Name: isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

Ringraziamo Andreas Dendorfer del Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine di LMU Monaco di Baviera per l'aiuto con il protocollo di affettatura. Per fornire campioni di tessuto miocardico umano vorremmo ringraziare Ghazali Minabari e Christian Heim del Dipartimento di Chirurgia Cardiaca, Dell'Ospedale Universitario Erlangen, Hendrik Milting dell'Istituto Erich & Hanna Klessmann, Ruhr-University Bochum e Muhannad Alkassar del Dipartimento di Cardiologia Pediatrica, Ospedale Universitario Erlangen. Per il supporto con la citometria di flusso vorremmo ringraziare Simon V'lkl e colleghi del centro di ricerca trassedizionale (TRC), University Hospital Erlangen. Ringraziamo anche Lorenz McCargo e Celine Gràninger dell'Istituto di Fisiologia Cellulare e Molecolare Erlangen per un eccellente supporto tecnico.
Questo lavoro è stato sostenuto dal D-HK (Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare), dal Centro interdisciplinare per la ricerca clinica (I-KF) presso l'Ospedale Universitario dell'Università di Erlangen-N'rnberg, e l'Università Erlangen-N'rnberg.

Tutti gli esperimenti con i ratti sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali Mittelfranken, Baviera, Germania. La raccolta e l'uso di campioni di tessuto cardiaco umano è stato approvato dagli Institutional Review Boards dell'Università di Erlangen-Nornberg e della Ruhr-University Bochum. Gli studi sono stati condotti secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki. I pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto prima della raccolta dei tessuti.
I ra...

Anche se l'isolamento dei cardiomiociti viventi è stato stabilito più di 40 anni fa ed è ancora un prerequisito per molti approcci sperimentali nella ricerca cardiaca, rimane una tecnica difficile con esiti imprevedibili. L'isolamento dei cardiomiocite tramite perfusione delle arterie coronarie con soluzione enzimatica è comunemente usato per i cuori di piccoli animali e produce un gran numero di cellule vitali. Tuttavia, ciò richiede un sistema e una competenza relativamente complessi. Inoltre, la maggior parte dei...

Una tecnica seminale che ha spianato la strada a importanti approfondimenti sulla fisiologia cardiomiocite è l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari viventi dai cuori intatti1. I cardiomiociti isolati possono essere utilizzati per studiare la normale struttura cellulare e la funzione, o le conseguenze degli esperimenti in vivo; ad esempio, per valutare i cambiamenti nell'elettrofisiologia cellulare o nell'accoppiamento eccitazione-contrazione nei modelli animali di malattia cardiaca. Inoltre, cardiomiociti isolati possono essere utilizzati per la coltura cellulare, interventi farmacologici, trasferimento genico, ingegneria tissunte, e molte altre applicazioni. Pertanto, metodi efficienti per l'isolamento cardiomiocato sono di fondamentale importanza per la ricerca cardiaca di base e traslazionale.
I cardiomiociti di piccoli mammiferi, come i roditori, e da mammiferi più grandi, come maiali o cani, sono comunemente isolati dalla perfusione coronarica del cuore con soluzioni contenenti collagene grezze e/o proteasi. Questo è stato descritto come il metodo "gold standard" per l'isolamento cardiomiocato, con conseguente resa fino al 70% delle cellule vitali2. L'approccio è stato utilizzato anche con i cuori umani, con conseguente cardiomiocazione accettabile produce3,4,5. Tuttavia, poiché la perfusione coronarica è fattibile solo se il cuore intatto o un grande cuneo miocardiale contenente un ramo dell'arteria coronaria è disponibile, la maggior parte degli esemplari cardiaci umani non sono adatti a questo approccio a causa delle loro piccole dimensioni e della mancanza di una vascolatura appropriata. Pertanto, l'isolamento dei cardiomiociti umani è impegnativo.
I campioni miocardali umani sono per lo più costituiti da blocchi di tessuto di dimensioni variabili (circa 0,5 x 0,5 x 0,5 cm a 2 x 2 x 2 cm), ottenuti attraverso biopsie endomiocardali6, miectomie setttiva7, impianti VAD8, o da cuori espiantati9. Le procedure più comuni per l'isolamento cardiomiocato iniziano con l'amatare il tessuto utilizzando forbici o un bisturi. I contatti tra cellule vengono poi interrotti dall'immersione nei tamponi senza calcio o a basso contenuto di calcio. Questo è seguito da più passaggi di digestione con estratti di enzimi grezzi o enzimi purificati come proteasi (ad esempio, trypsina), collagenasi, ialuronidae, o elastase, con conseguente disintegrazione della matrice extracellulare e liberazione dei cardiomiociti. In una fase finale, critica, una concentrazione fisiologica di calcio deve essere accuratamente ripristinata, o il danno cellulare può verificarsi a causa del calcio-paradosso10,11,12. Questo approccio di isolamento è conveniente, ma in genere inefficiente. Per esempio, uno studio ha scoperto che quasi 1 g di tessuto miocardiale era necessario per ottenere un numero sufficiente di cardiomiociti adatti per esperimenti successivi13. Una possibile ragione per basse rese è il metodo relativamente duro di macinare il tessuto. Questo può danneggiare in particolare i cardiomiociti situati ai bordi del pezzo anche se questi miociti sono più probabilità di essere rilasciato dalla digestione ezimatica.
Un altro aspetto che può influenzare l'efficienza di isolamento e la qualità delle cellule ottenute da campioni umani è la durata dell'ischemia del tessuto. La maggior parte dei protocolli menzionano i tempi di trasporto brevi al laboratorio come prerequisito per buoni risultati. Questo limita lo studio dei cardiomiociti ventricolari umani ai laboratori con strutture di cardiochirurgia nelle vicinanze. Insieme, queste restrizioni ostacolano la verifica di importanti risultati da modelli animali nei cardiomiociti umani. Sono quindi auspicabili protocolli di isolamento migliorati che consentono rese elevate di cardiomiocazione da piccole quantità di tessuto, preferibilmente senza gravi danni dopo lunghi tempi di trasporto.
Descritto qui è un protocollo di isolamento basato sulla digestione ezimatica di sottili fette di tessuto miocardiale generate con un vibratome14,15. Dimostriamo che l'isolamento dalle fette di tessuto è molto più efficiente di quello dei pezzi di tessuto macinati con le forbici. Il metodo descritto non solo consente elevate rese di cardiomiociti umani vitali da piccole quantità di tessuto miocardico, ma è applicabile anche ai campioni immagazzinati o trasportati in soluzione cardioplegica fredda per un massimo di 36 h.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedionemonoxime</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3494.1</td>
			<td>Purity&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B250009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Fluka Biochemica</td>
			<td>49450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting-point agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>Used for human tissue at 4 mg/mL 
			(activity: 280 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Used for rat tissue at 1.5 mg/mL 
			(activity 330 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td>Used for rat tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity &#8805; 3.5 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase XXIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Used for human tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity: 7-14 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact shaker</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>KS-15 B control</td>
			<td>Agitation direction: horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pasteur-pipettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EA65.1</td>
			<td>For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter &#8805;2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BARN88880030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter, 180 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 35, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome (VT1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices

L'isolamento dei miociti cardiaci ventricolari dai cuori animali e umani è un metodo fondamentale nella ricerca cardiaca. I cardiomiociti animali sono comunemente isolati dalla perfusione coronarica con enzimi digestivi. Tuttavia, isolare i cardiomiociti umani è difficile perché gli esemplari miocardici umani di solito non consentono la perfusione coronarica e protocolli di isolamento alternativi producono scarse rese di cellule vitali. Inoltre, gli esemplari miocardiali umani sono rari e regolarmente disponibili presso le istituzioni con cardiochirurgia in loco. Ciò ostacola la traduzione dei risultati dai cardiomiociti animali a quello umano. Descritto qui è un protocollo affidabile che consente l'isolamento efficiente dei miociti ventricolari dal miocardio umano e animale. Per aumentare il rapporto superficie-volume riducendo al minimo i danni alle cellule, le fette di tessuto miocardiale di 300 m di spessore vengono generate da campioni miocardici con un vibrato. Le fette di tessuto vengono poi digerito con proteasi e collagenasi. Il miocardio del ratto è stato utilizzato per stabilire il protocollo e quantificare le rese dei miociti vitali e tolleranti al calcio mediante il conteggio delle cellule citometriche di flusso. Il confronto con il metodo di parti di tessuto comunemente usato ha mostrato rese significativamente più elevate di cardiomiociti a forma di asta (41,5 x 11,9 contro 7,89 x 3,6%, p < 0,05). Il protocollo è stato tradotto in miocardio umano in mancanza e non in mancanza, dove le rese erano simili a quelle del miocardio di ratto e, ancora una volta, nettamente più elevate rispetto al metodo del pezzo di tessuto (45,0 x 15,0 contro 6,87 : 5,23 cellule/mg, p < 0,05). In particolare, con il protocollo presentato è possibile isolare un numero ragionevole di cardiomiociti umani vitali (9-200 cellule/mg) da quantità minime di tessuto (<50 mg). Così, il metodo è applicabile al miocardio sano e in mancanza da cuori umani e animali. Inoltre, è possibile isolare i miociti eccitabili e contrattili da campioni di tessuto umano conservati fino a 36 h in soluzione cardioplegica fredda, rendendo il metodo particolarmente utile per i laboratori presso le istituzioni senza cardiochirurgia in loco.

Per verificare l'efficienza dell'isolamento, il protocollo è stato utilizzato con il miocardio di ratto e il numero risultante di miociti vitali è stato confrontato con i numeri ottenuti dall'isolamento tramite perfusione coronarica e dall'isolamento da piccoli blocchi di tessuto (isolamento dei blocchi, Figura 2). L'isolamento dei blocchi e l'isolamento dalle fette di tessuto sono stati eseguiti dagli stessi cuori. Per l'isolamento tramite perfusione coronarica, tuttavia, è stato utilizz...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Presentato è un protocollo per l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani e animali da fette miocardici tagliate con vibratome. È possibile ottenere rese elevate di cellule tolleranti al calcio (fino a 200 cellule/mg) da piccole quantità di tessuto (<50 mg). Il protocollo è applicabile al miocardio esposto all'ischemia fredda fino a 36 h.

Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Questo protocollo funziona con campioni provenienti da cuori umani e animali, anche dopo ore di trasporto. Fino a 200 miociti per milligrammo possono essere isolati da fette di tessuto tagliate con vibratome. L'analisi elettrofisiologia, strutturale e biochimica dei cardiomiociti, aiuta a scoprire e comprendere meglio i meccanismi delle malattie cardiache.Dopo aver riempito un piatto di coltura tissutale di 100 millimetri, con 20 millilitri di soluzione di taglio a freddo, posizionare il campione di tessuto nel piatto di coltura. Mantenere il piatto di coltura su un piatto raffreddato a 4 gradi Celsius. Tieni presente che i campioni di tessuto viventi degli animali e soprattutto degli esseri umani sono potenzialmente infettivi.Utilizzare forbici o bisturi, per rimuovere il tessuto fibrotico in eccesso e il grasso epicardiale, dal campione. Per un'elaborazione ottimale del vibratoma di campioni di tessuto più grandi, utilizzare il bisturi per tagliare otto cubi millimetri dal tessuto. Per campioni più piccoli da biopsie, questo non è necessario.Si può identificare l'epicardio con lo strato di grasso epicardiale. Dopo aver rimosso il grasso in eccesso, posizionare il blocco di tessuto, nel piatto, con l'epicardio rivolto verso il basso. Per prepararsi all'incorporamento dei tessuti, far bollire 400 milligrammi di agarosio a basso punto di fusione in dieci millilitri di soluzione di taglio.Riempire una siringa da dieci millilitri con il gel di agarosio sciolto a caldo. Sigillare la siringa e posizionare in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti, per consentire all'agarosio di equilibrare. Usando le forcep, spostare il campione di assetto in un piatto pulito di coltura tissutale da 35 millimetri, con l'epicardio rivolto verso il basso.Quindi, rimuovere il liquido in eccesso dal campione, con un tampone sterile. Fissare il campione contro il movimento, tenendolo con le forcette. E svuotare la siringa di agarosio sopra di essa, assicurandosi di immergere completamente l'esemplare.Posizionare immediatamente il piatto sul ghiaccio e lasciare solidificare l'agarosio per 10 minuti. Montare una lama di rasoio inutilizzata sul porta lama del vibratomo. Se possibile, calibrare il vibratoma, regolando la deflessione Z della lama.Utilizzare un bisturi per asportare un blocco di tessuto di agarosio che si adatta al supporto del campione del vibratomo. Per garantire la stabilità, assicurarsi che il tessuto sia ancora sufficientemente immerso nell'agarosio. Con margini di agarosio, di almeno otto millimetri.Applicare un sottile strato di colla cianoacrilato sul supporto del campione. E premere delicatamente il blocco di tessuto di agarosio, sul supporto. Costruisci un bagno vibratomo, con soluzione di taglio.Quindi, riempire il serbatoio di raffreddamento esterno del vibratomo con ghiaccio frantumato, per mantenere una temperatura da quattro a sei gradi Celsius, durante tutto il processo di taglio. Posizionare il portapenne, contenente il blocco di tessuto di agarosio, nel bagno del vibratomo. Utilizzando le impostazioni del vibratoma descritte nel manoscritto, generare fette spesse 300 microlitri.È fondamentale creare sezioni in epicardio parallelo perché è così che le fibre di cardiomiocita sono allineate nella parete ventricolare. Altrimenti, ci saranno troppi danni. Utilizzare un microscopio a luce standard, per controllare l'allineamento dei cardiomiociti e delle fette di tessuto.Per evitare di danneggiare il tessuto, tenere l'agarosio, invece del tessuto stesso. Una fibra di cardiomiocita, dovrebbe essere allineata uniformemente e i miociti, non dovrebbero essere contratti. Posizionare una piastra termica sullo shaker di laboratorio e scaldarla a 37 gradi Celsius.Avviare lo shaker di laboratorio a 65 giri/min. Sciogliere la proteinasi in due millilitri della prima soluzione. E sciogliere la collagenasi, in due millilitri della prima soluzione.Ma non mescolare la proteinasi e la collagenasi. Aggiungere cloruro di calcio alla soluzione di collagenasi, per una concentrazione finale, di cinque micromolari. Incubare entrambe le soluzioni a 37 gradi Celsius.Utilizzare le forcep per trasferire una fetta di tessuto in un piatto pulito di coltura tissutale da 60 millimetri. Con cinque millimetri di soluzione di taglio pre-refrigerata. Tenendo il piatto sul ghiaccio o su una piastra fredda, rimuovere con cura l'agarosio dal tessuto, usando una lama o una forza.Per eseguire il lavaggio iniziale delle fette di tessuto, posizionare un piatto pulito di coltura tissutale da 35 millimetri sulla lama di calore. E riempirlo, con due millimetri di soluzione pre-riscaldata uno. Trasferire una o due fette di tessuto sul piatto preparato.Quindi utilizzare una pipetta di un millimetro, per le fasi di lavaggio. Dopo aver lavato le fette, rimuovere la soluzione uno dal piatto e aggiungere due millilitri della soluzione proteicasi. Incubare le fette per 12 minuti sulla lama di calore, con lo shaker a 65 giri/min.Lavare le fette di tessuto altre due volte, con due millilitri di soluzione preri warmed uno. Quindi, rimuovere la soluzione uno dal piatto e aggiungere due millilitri di soluzione di collagenasi. Incubare le fette per almeno 30 minuti sulla lama di calore, con scuotimento a 65 giri/min.Dopo 15 minuti di incubazione, controllare la presenza gratuita di miociti individuali, esaminando il piatto al microscopio leggero. Continuare a controllare ogni cinque minuti, fino a quando i singoli miociti non sono visibili. Quindi, alt digestione lavando le fette due volte, con due millilitri di soluzione pre-riscaldata due.E riempire il piatto, con due millilitri di soluzione due. Estrarre con cura le fibre della fetta di tessuto, usando forcelle fini. Continuare a lavorare con attenzione, per evitare di danneggiare i cardiomiociti.E pipetta più volte, con un solo uso oltre la pipetta. Quindi, confermare che i cardiomiociti a forma di asta si sono separati, esaminando il piatto, al microscopio leggero. Riposizionare il piatto sulla piastra termica a 37 gradi Celsius e agitare scuotendo.Aggiungendo soluzioni di 10 millimolare e 100 millimolare di cloruro di calcio, aumentare lentamente la concentrazione di calcio della sospensione tissutale da cinque micromolari a 1,5 millimolari. Quando l'aumento di calcio è completo, utilizzare le flesse per rimuovere eventuali blocchi di tessuto non digeriti rimanenti. In primo luogo, fermare l'agitazione della sospensione.Successivamente, utilizzando una pipetta da 1000 microliter, rimuovere lentamente 1/3 della soluzione, dalla parte superiore della sospensione. Evitare l'aspirazione dei cardiomiociti. Quindi aggiungere 700 microlitri della soluzione tre, alle cellule.Dopo 10 minuti di agitazione, ripetere questi passaggi di lavaggio. Trasferire la sospensione in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. E permettere ai cardiomiociti di sedimentare a temperatura ambiente, per un minimo di 10 minuti e un massimo di 30 minuti.Rimuovere completamente il supernatante. E rimospendare il pellet in soluzione di tirolo modificata o il tampone di sperimentazione desiderato. Utilizzando un microscopio a luce, verificare la qualità della cella.Dal 30 al 50% dei cardiomiociti deve essere a forma di asta, liscia senza croste di membrana. E display, chiare striature incrociate. Per verificare l'efficienza di isolamento, il protocollo è stato applicato al miocardio del ratto.E rispetto all'isolamento attraverso la perfusione coronarica e l'isolamento, da piccoli pezzi di tessuto. Una percentuale inferiore di cellule a forma di asta è stata osservata quando si utilizza il protocollo, quindi dopo l'isolamento per perfusione. Ma il numero totale era ancora alto.Al contrario, l'isolamento dai pezzi di tessuto, ha prodotto meno cellule a forma di asta. Citometria del flusso, è stato utilizzato per confrontare quantitativamente i risultati. L'isolamento dei cardiomiociti dalle fette tissutali, non raggiunge la resa ottenuta per perfusione coronarica.Ma fornisce rese significativamente più elevate rispetto all'isolamento dei miociti, dai pezzi di tessuto. Successivamente, il protocollo è stato applicato al miocardio umano. L'isolamento dalle fette miocardici, ha prodotto numeri di Hyde e una grande proporzione di miociti umani a forma di bastone.E solo una piccola percentuale di cardiomiociti arrotondati. L'isolamento dalle fette del miocardio, ha comportato un numero sorprendentemente più elevato di miociti a forma di bastone, rispetto all'isolamento dai pezzi di tessuto. La quantificazione fotometrica ha confermato una vitalità del miocita sostanzialmente più elevata dopo l'isolamento dalle fette del miocardio.Le cellule umane, isolate con il protocollo descritto, possono essere sottoposte ad analisi strutturali. Colorazione alfa actina, ha rivelato un denso modello di linea Z regolare e una lunghezza media del sarcomero di 1,92 micrometri, nei cardiomiociti a riposo. Colorazione LTCC e RyR, ha mostrato che l'ammasso chiaro è co-localizzato vicino alla membrana cellulare e ai tubuli T.I cardiomiociti isolati erano eccitabili e potevano essere utilizzati per studi sull'elettrofisiologia cellulare o sull'accoppiamento di contrazione dell'eccitazione. Azione potenziale forma e durata, era nella gamma riportata da altri, per i cardiomiociti ventricolari, dal cuore umano in fallimento. I transitori di calcio registrati dalla scansione delle linee vocali di Khan, mostrarono un chiaro upstroke dopo la stimolazione.E, un rapporto segnale/rumore accettabile. L'accorciamento del cardiomiocita per contrazione può essere visto dalla deflessione del bordo inferiore della cella. A causa dell'elevato numero di cardiomiociti isolatori ottenuti da questo protocollo, la coltura cellulare è possibile.Ciò può consentire il trasferimento genico, i test farmacologici e l'ingegneria tissutale dei cardiomiociti umani. Un'applicazione importante, è la verifica dei risultati, dai modelli animali nelle cellule umane. L'insufficienza cardiaca è una sindrome clinica con opzioni terapeutiche molto limitate.Il miglioramento delle tecniche di isolamento dei cardiomiociti aiuterà a identificare gli obiettivi cellulari per la diagnosi e le terapie future.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolamento di cellule staminali da xenotrapianti di cancro pancreatico umano

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Ricerca

Biologia

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolamento dei Piccoli RNA non codificanti dal siero umano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...