Name: isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

우리는 실험 의학의 월터 브렌델 센터에서 안드레아스 덴도르퍼감사하고 싶습니다, LMU 뮌헨, 슬라이스 프로토콜에 대한 도움. 인간 심근 조직 샘플을 제공하기 위해 우리는 심장 외과의 학과에서 가잘리 미나바리와 크리스티안 하임, 대학 병원 에를랑겐, 에리히 & 한나 Klessmann 연구소에서 헨드릭 밀팅, Ruhr-대학 보훔과 무한나드 알카사르 소아 심장 학부, 대학 병원 에를랑겐에서 감사드립니다. 흐름 세포측정을 지원하기 위해 우리는 번역 연구 센터 (TRC), 대학 병원 에를랑겐에서 사이먼 Völkl과 동료에게 감사드립니다. 우리는 또한 우수한 기술 지원을 위해 세포 및 분자 생리학 에를랑겐 연구소의 로렌츠 맥카고와 셀린 그뤼닝거에게 감사드립니다.
이 작품은 DZHK에 의해 지원되었다 (심장 혈관 연구를위한 독일 센터), 임상 연구를위한 학제 간 센터 (IZKF) 에를랑겐 뉘른베르크 대학의 대학 병원에서, 그리고 Universitätsbund 에를랑겐 뉘른베르크.

쥐를 가진 모든 실험은 동물 관리 및 사용 위원회 미텔 프랑켄, 바이에른, 독일에 의해 승인되었습니다. 인간 심장 조직 샘플의 수집 및 사용은 에를랑겐 뉘른베르크 대학과 루르 대학 보훔대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 헬싱키 선언 지침에 따라 연구를 수행했습니다. 환자는 조직 수집 전에 서면 통보 된 동의를 주었습니다.
암컷 위스타 쥐(150-200 g)는 시판?...

살아있는 심근세포의 고립은 40년 전에 확립되었고 여전히 심장 연구에서 많은 실험적 접근법의 전제 조건이지만 예측할 수 없는 결과를 가진 어려운 기술로 남아 있습니다. 효소 용액을 가진 관상 동맥의 관류를 통해 심근 세포 절연은 일반적으로 작은 동물의 심혼을 위해 이용되고 실행 가능한 세포의 다수를 산출합니다. 그러나, 이것은 상대적으로 복잡한 시스템과 전문 지식이 필요합니다. 더...

심근세포 생리학에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있는 길을 열어준 정액 기술은 온전한 심장1에서살아있는 심실 심근세포의 격리이다. 고립 된 심근 세포는 정상적인 세포 구조 와 기능을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다., 또는 생체 내 실험의 결과; 예를 들어, 세포 전기 생리학 또는 심폐소생 수축 커플링의 변화를 평가하기 위해 심장 질환의 동물 모델에서. 추가적으로, 고립된 심근세포는 세포 배양, 약리학 내정간섭, 유전자 전달, 조직 공학 및 많은 그밖 응용을 위해 이용될 수 있습니다. 따라서 심근세포 분리를 위한 효율적인 방법은 기본 및 번역 심장 연구에 근본적인 가치가 있습니다.
설치류와 같은 작은 포유류와 돼지 나 개와 같은 더 큰 포유동물의 심근세포는 일반적으로 조잡한 콜라게나아제 및 / 또는 프로테아제가 함유 된 용액으로 심장의 관상 동맥 관류에 의해 격리됩니다. 이는 심근세포 분리를 위한 "금본위제" 방법으로 설명되어 있으며, 그 결과 실행 가능한 세포2의최대 70%의 수율을 초래한다. 접근은 또한 허용심근세포산출량 3,,4,45의결과로, 인간의 심혼과 함께 이용되었습니다. 그러나 관상 동맥 관류는 관상 동맥 가지를 포함하는 온전한 심근 또는 큰 심근 웨지를 사용할 수 있는 경우에만 가능하기 때문에, 대부분의 인간 심장 표본은 그들의 작은 크기와 적당한 혈관의 부족으로 인해 이 접근에 적합하지 않습니다. 따라서 인간의 심근 세포의 고립은 어렵습니다.
인간 심근 표본은 주로 가변 크기의 조직 덩어리(약 0.5 x 0.5 x 0.5 cm ~ 2 x 2 x 2cm)로 구성하며, 끝막생기 생검6,중격 절제술7,VAD 이식8,또는 심어진 하트9를통해 수득된다. 심근 세포 격리를 위한 일반적인 절차는 가위 또는 메스를 사용하여 조직을 다진 것으로 시작합니다. 세포 대 세포 접촉은 칼슘이 없거나 낮은 칼슘 완충제에 침수하여 중단됩니다. 이것은 원유 효소 추출물 또는 프로테아제 (예 : 트립신), 콜라게나아제, 히알루로니다제 또는 엘라스타제와 같은 정제 효소를 함유한 다중 소화 단계로 이어지며 세포외 매트릭스가 분해되고 심근세포의 해방을 초래합니다. 최종적으로 중요한 단계에서, 생리적 칼슘 농도는 신중하게 회복되어야 하며, 칼슘-역설(10,,11,,12)으로인해 세포 손상이 발생할 수 있다.11 이 격리 방법은 편리하지만 일반적으로 비효율적입니다. 예를 들어, 한 연구는 심근 조직의 거의 1 g후속 실험에 적합한 심근 세포의 충분한 수를 얻기 위해 필요 했다 발견13. 낮은 수율에 대 한 가능한 이유는 조직을 다진의 상대적으로 가혹한 방법. 이 심근 세포는 효소 소화에 의해 방출 될 가능성이 가장 높지만 청크 가장자리에 위치한 심근 세포가 특히 손상 될 수 있습니다.
인간 표본에서 얻은 세포의 격리 효율성 및 품질에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 측면은 조직 허혈의 지속 기간. 대부분의 프로토콜은 좋은 결과를 위한 전제 조건으로 실험실에 짧은 수송 시간을 언급합니다. 이것은 가까운 심장 수술 시설을 가진 실험실에 인간 심실 심근 세포의 연구를 제한합니다. 함께, 이러한 제한은 인간의 심근 세포에 있는 동물 모형에서 중요한 사실 인정의 확인을 방해합니다. 소량의 조직에서 높은 심근세포 수율을 허용하는 향상된 격리 프로토콜은 운송 시간이 연장된 후 심각한 손상없이 바람직하게는 바람직합니다.
여기에 기진도14,,15로생성된 얇은 심근 조직 슬라이스의 효소 소화에 기초한 격리 프로토콜이다. 우리는 조직 조각에서 격리가 가위로 다진 조직 덩어리에서 그것보다 훨씬 더 효율적이다는 것을 보여줍니다. 설명된 방법은 소량의 심근 조직에서 생존 가능한 인간 심근세포의 높은 수율을 허용할 뿐만 아니라 최대 36시간 동안 차가운 심근용액에 저장되거나 운반된 표본에도 적용가능하다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedionemonoxime</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3494.1</td>
			<td>Purity&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B250009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Fluka Biochemica</td>
			<td>49450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting-point agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>Used for human tissue at 4 mg/mL 
			(activity: 280 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Used for rat tissue at 1.5 mg/mL 
			(activity 330 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td>Used for rat tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity &#8805; 3.5 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase XXIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Used for human tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity: 7-14 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact shaker</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>KS-15 B control</td>
			<td>Agitation direction: horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pasteur-pipettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EA65.1</td>
			<td>For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter &#8805;2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BARN88880030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter, 180 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 35, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome (VT1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices

동물과 인간의 심혼에서 심실 심장 근세포의 격리는 심장 연구에서 근본적인 방법입니다. 동물 심근 세포는 일반적으로 소화 효소와 관상 관상 관류에 의해 격리됩니다. 그러나 인간의 심근 세포를 고립시키는 것은 인간 심근 세포가 일반적으로 관상 동맥 관류를 허용하지 않기 때문에 도전적이며, 대체 절연 프로토콜은 실행 가능한 세포의 가난한 수율을 초래합니다. 또한, 인간의 심근 표본은 드물며 현장 심장 수술을 받는 기관에서만 정기적으로 사용할 수 있습니다. 이것은 인간 심근세포에 동물에서 사실 인정의 번역을 방해합니다. 여기에 설명된 인간 및 동물 심근에서 심실 심근세포의 효율적인 격리를 가능하게 하는 신뢰할 수 있는 프로토콜이 있습니다. 세포 손상을 최소화하면서 표면 대 부피 비율을 높이기 위해 심근 조직 슬라이스 300 μm 두께는 진동기를 가진 심근 표본에서 생성됩니다. 조직 조각은 프로테아제와 콜라게나아제로 소화됩니다. 쥐 심근은 유동 세포 계수에 의정서를 확립하고 생존 가능한 칼슘 내성 심근세포의 수율을 정량화하는 데 사용되었습니다. 일반적으로 사용되는 조직-청크 방법과 비교하여 막대 모양의 심근세포의 상당히 높은 수율을 보였다(41.5 ± 11.9 vs. 7.89 ± 3.6%, p&lt; 0.05). 프로토콜은 쥐 심근에서와 유사한 수율이 있는 실패하고 실패하지 않는 인간 심근으로 변환되었으며, 다시 조직 청크 방법(45.0 ± 15.0 대 6.87 ± 5.23 세포/mg, p&lt; 0.05)보다 현저하게 높았다. 특히, 제시 된 프로토콜과 함께 가능한 인간의 심근 세포의 합리적인 수를 분리 할 수있다 (9-200 세포 / mg) 조직의 최소한의 양에서 (&50 mg). 따라서, 이 방법은 인간과 동물의 심장 모두에서 건강하고 실패한 심근에 적용가능하다. 더욱이, 감기 심근용액에서 최대 36시간 까지 저장된 인간 조직 표본으로부터 흥분및 수축근구를 분리할 수 있어 현장 심장 수술이 없는 기관의 실험실에 특히 유용한 방법을 렌더링할 수 있다.

격리 효율을 확인하기 위해, 프로토콜은 쥐 심근증과 함께 사용되었고, 실행 가능한 심근세포의 결과 수는 관상 동맥 관류를 통해 격리및 작은 조직 덩어리로부터의 격리에 의해 얻어진 숫자와 비교되었다(청크 절연, 그림 2). 조직 조각으로부터의 청크 격리 및 격리는 동일한 심혼에서 수행되었다. 그러나 관상 동맥 관류를 통한 격리를 위해 온 심장이 사용되었습니다. 관상...

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Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices (Video) | JoVE

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

이 프로토콜은 운송 시간 후에도 인간과 동물의 심장 샘플과 함께 작동합니다. 밀리그램당 최대 200개의 근세포가 진동편 절단 조직 조각으로부터 분리될 수 있습니다. 심근세포의 전기생리학적, 구조적 및 생화학적 분석은 심장 질환의 메커니즘을 발견하고 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다.100밀리미터 의 조직 배양 접시를 채운 후, 20 밀리리터의 냉삭한 용액을 사용하여 조직 샘플을 배양 접시에 놓습니다. 접시에 문화 접시를 섭씨 4도까지 식힙니다. 동물과 특히 인간에게서 살아있는 조직 견본이 잠재적으로 전염성이 있다는 것을 명심하십시오.가위 또는 메스를 사용 하 여, 샘플에서 과잉 섬유 조직 및 상피 지방을 제거 합니다. 더 큰 조직 샘플의 최적의 진동 처리를 위해 메스를 사용하여 조직에서 8 밀리미터 큐브를 자른다. 생검에서 더 작은 견본을 위해, 이것은 필요하지 않습니다.하나는 상피 지방 층에 의해 에피카르늄을 식별 할 수 있습니다. 과도한 지방을 제거한 후, 티슈 블록을 접시에 넣고, 에피카르듐을 아래로 향합니다. 조직 포함을 준비하려면 400 밀리그램의 낮은 융점 아가로즈를 절단 용액 10밀리리터로 끓입니다.뜨거운 용존 아가로즈 젤로 10 밀리리터 주사기를 채웁니다. 주사기를 밀봉하고 아가로즈가 평형화 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 섭씨 37도의 수조에 놓습니다. 집게를 사용하여 트림 시편을 깨끗한 35mm 조직 배양 접시로 옮기고, 에피카르듐은 아래쪽으로 향합니다.그런 다음 멸균 면봉으로 시편에서 과도한 유체를 제거합니다. 집게를 들고 이동에 대한 표본을 확보하십시오. 그리고 아가로즈의 주사기를 그 위에 비우고 표본을 완전히 몰입시게 하십시오.즉시 접시를 얼음 위에 놓고 아가로즈가 10 분 동안 굳어지게합니다. 사용하지 않은 면도날을 진동의 블레이드 홀더에 장착합니다. 가능하면 블레이드의 Z 편향을 조정하여 진동을 보정합니다.메스를 사용하여 진동의 시편 홀더에 맞는 아가로즈 조직 블록을 절제합니다. 안정성을 보장하기 위해 조직이 여전히 아가로즈에 충분히 침지되어 있는지 확인하십시오. 아가로즈 마진, 적어도 8 밀리미터.시편 홀더에 얇은 시아노아크라일트 접착제를 발라주세요. 그리고 아가로즈 티슈 블록을 홀더에 부드럽게 누릅니다. 절단 용액으로 진동 목욕을 구축 할 수 있습니다.그런 다음 진동의 외부 냉각 탱크를 분쇄 된 얼음으로 채우고 절단 공정 전반에 걸쳐 섭씨 4 ~ 6도의 온도를 유지합니다. 아가로즈 티슈 블록을 포함하는 표본 홀더를 진동 욕조에 넣습니다. 원고에 설명된 진동 설정을 사용하여 300개의 마이크로리터 두께의 슬라이스를 생성합니다.심근세포 섬유가 심실 벽에 정렬되는 방식이기 때문에 병렬 에피카르듐으로 섹션을 만드는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 너무 많은 피해가있을 것입니다. 표준 광 현미경을 사용하여 심근세포와 조직 조각의 정렬을 확인하십시오.조직을 손상시키지 않으려면 조직 자체 대신 아가로즈를 잡으세요. 심근세포 섬유는 균일하게 정렬되어야하며 근구는 수축해서는 안됩니다. 실험실 셰이커에 열판을 놓고 섭씨 37도까지 데우십시오.65 RPM에서 실험실 셰이커를 시작합니다. 단백질을 용액 1의 2 밀리리터에 녹입니다. 그리고 콜라게나아제, 용액 1의 2 밀리리터로 용해하십시오.그러나 단백질과 콜라게나아제는 혼합하지 마십시오. 콜라게나제 용액에 염화칼슘을 추가하여 5개의 마이크로몰라를 최종 농도로 유지합니다. 두 솔루션을 섭씨 37도에서 배양합니다.집게를 사용하여 조직 조각을 깨끗한 60mm 조직 배양 접시로 옮기하십시오. 5밀리미터의 사전 냉각 절삭 용액을 제공합니다. 얼음이나 차가운 접시에 접시를 보관하고 블레이드 나 집게를 사용하여 조직에서 아가로즈를 조심스럽게 제거하십시오.조직 슬라이스의 초기 세척을 수행하려면, 열 블레이드에 깨끗한 35 밀리미터 조직 배양 접시를 놓습니다. 그리고 미리 데워진 용액 1개로 2밀리미터를 채우게 하십시오. 제조 된 접시에 하나 또는 두 개의 조직 조각을 전송합니다.그런 다음 세척 단계에 1 밀리미터 파이펫을 사용합니다. 슬라이스를 세척한 후, 접시에서 용액을 하나씩 제거하고 단백질제 용액의 2밀리리터를 추가합니다. 65 RPM의 셰이커와 함께 열블레이드에서 12분 동안 슬라이스를 배양합니다.미리 데워진 용액 2밀리리터로 티슈 슬라이스를 두 번 더 씻으시면 됩니다. 다음으로, 식기에서 용액을 하나씩 제거하고 콜라게나제 용액 2밀리리터를 추가합니다. 65 RPM에서 흔들리면서 열블레이드에서 적어도 30분 동안 슬라이스를 배양합니다.잠복 15 분 후, 가벼운 현미경으로 접시를 검사하여 무료 개별 심근세포에 대한 확인. 개별 심낭이 보일 때까지 5분마다 계속 확인합니다. 그런 다음, 미리 데워진 용액 2밀리리터로 슬라이스를 두 번 세척하여 대체 소화.그리고 2 개의 밀리리터용액으로 접시를 리필하십시오. 미세 한 집게를 사용하여 조심스럽게 티슈 슬라이스의 섬유를 분리합니다. 심근 세포에 손상을 피하기 위해 신중하게 계속 작동합니다.그리고 파이펫을 여러 번 피펫으로 사용하며 파이펫을 지나면 됩니다. 그런 다음, 막대 모양의 심근세포가 가벼운 현미경으로 접시를 검사하여 분리된 것을 확인합니다. 접시를 다시 37°C의 열판에 놓고 흔들어 서 동요합니다.10 밀리몰러와 100 밀리머 칼슘 염화물 재고 솔루션을 추가하여 조직 현탁액의 칼슘 농도를 5 마이크로몰어에서 1.5 밀리몰러로 천천히 증가시면 됩니다. 칼슘 증가가 완료되면, 남은 소화되지 않은 조직 덩어리를 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 먼저 서스펜션의 동요를 중지합니다.다음으로, 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 서스펜션 상단에서 용액의 1/3을 천천히 제거합니다. 심근 세포의 포부를 피하십시오. 그런 다음 3개의 용액의 마이크로리터를 세포에 추가합니다.10분간의 교반 후, 이 세척 단계를 반복하십시오. 서스펜션을 15밀리리터 원심분리튜브로 옮기. 그리고 심근세포가 실온에서 퇴적물을 최소 10분, 최대 30분 동안 허용합니다.상체를 완전히 제거합니다. 그리고 수정된 티로드 용액 또는 원하는 실험 버퍼에서 펠릿을 다시 중단한다. 가벼운 현미경을 사용하여 세포 품질을 확인합니다.심근세포의 30~50%는 막 결점 없이 도장 모양으로 매끄럽게 만들어야 합니다. 그리고 표시, 명확한 교차 줄무늬. 격리 효율을 확인하기 위해, 프로토콜은 쥐 심근에 적용되었다.그리고 관상 동맥 관류 및 격리를 통해 격리와 비교하여 작은 조직 덩어리에서. 프로토콜을 사용할 때 막대 모양 의 세포의 낮은 비율이 관찰된 다음 관류에 의해 격리된 후 관찰되었다. 그러나 총 수는 여전히 높았다.대조적으로, 조직 덩어리에서 격리, 적은 막대 모양의 세포를 산출. 유동 세포측정은, 결과를 정량적으로 비교하는 데 사용되었다. 조직 조각에서 심근세포의 분리는 관상 동맥 관류에 의해 얻어진 수율에 도달하지 않습니다.그러나 조직 덩어리에서 심근 세포 격리보다 훨씬 높은 수율을 제공합니다. 다음으로, 프로토콜은 인간 심근에 적용되었다. 심근 조각에서 격리, 하이드 숫자와 막대 모양인간의 심근 세포의 큰 비율을 산출.그리고 둥근 심근 세포의 단지 작은 비율. 심근 조각에서 격리, 조직 덩어리에서 격리 보다 막대 모양의 심근 세포의 눈에 띄게 높은 수 결과. 광정수화는 심근 슬라이스로부터 분리된 후 심근세포 생존가능성이 실질적으로 높다는 것을 확인했습니다.기술된 프로토콜로 분리된 인간 세포는 구조 적 분석을 실시할 수 있다. 알파 액틴 염색, 조밀 한 일반 Z 라인 패턴과 1.92 마이크로 미터의 평균 sarcomere 길이를 공개, 휴식 심근 세포에. LTCC 및 RyR 염색, 명확한 클러스터가 세포막 과 T 튜블러 근처에서 공동 국화되는 것으로 나타났다.고립 된 심근 세포는 흥분 하 고 세포 전기 생리학 또는 흥분 수축 커플링에 대 한 연구에 사용할 수 있습니다. 행동 잠재적인 모양과 지속 시간, 다른 사람에 의해 보고 된 범위에 있었다, 심실 심근 세포에 대 한, 실패 인간의 마음에서. 칸 보컬 라인 스캐닝에 의해 기록 된 칼슘 과도, 자극 후 명확한 업 스트로크를 보여 주었다.그리고, 잡음 비율에 허용 신호. 수축에 의한 심근세포 단축은 하부 세포 경계의 편향으로부터 볼 수 있다. 이 프로토콜에 의해 얻어진 이졸개 심근세포의 수가 많기 때문에 세포 배양이 가능합니다.이것은 인간 심근세포의 유전자 전달, 약리학 시험 및 조직 공학을 허용할 수 있습니다. 중요한 응용 프로그램은 인간 세포에 있는 동물 모형에서 사실 인정의 확인입니다. 심부전은 매우 제한된 치료 옵션을 가진 임상 증후군입니다.향상된 심근세포 격리 기술은 진단과 미래 치료를 위한 세포 표적을 확인하는 것을 도울 것입니다.

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In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells (Video) | JoVE

배아 심실 내피 세포의 분리

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes (Video) | JoVE

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum (Video) | JoVE

인간 혈청에서 작은 비 암호화 RNA를의 분리

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus (Video) | JoVE

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes (Video) | JoVE

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...