Name: isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Andreas Dendorfer fra Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, LMU Munich, for å få hjelp med kutteprotokollen. For å gi menneskelige myokardvevsprøver vil vi gjerne takke Ghazali Minabari og Christian Heim fra Institutt for hjertekirurgi, Universitetssykehuset Erlangen, Hendrik Milting fra Erich & Hanna Klessmann Institute, Ruhr-University Bochum og Muhannad Alkassar fra Institutt for pediatrisk kardiologi, Universitetssykehuset Erlangen. For støtte til strømningscytometri vil vi takke Simon Völkl og kolleger fra det translasjonelle forskningssenteret (TRC), Universitetssykehuset Erlangen. Vi vil også takke Lorenz McCargo og Celine Grüninger fra Institutt for cellulær og molekylær fysiologi Erlangen for utmerket teknisk støtte.
Dette arbeidet ble støttet av DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), av Tverrfaglig senter for klinisk forskning (IZKF) ved Universitetssykehuset ved Universitetet i Erlangen-Nürnberg, og Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Alle eksperimenter med rotter ble godkjent av Dyreomsorgs- og brukskomiteen Mittelfranken, Bayern, Tyskland. Innsamling og bruk av menneskelige hjertevevsprøver ble godkjent av institusjonelle gjennomgangsråd ved Universitetet i Erlangen-Nürnberg og Ruhr-Universitetet Bochum. Studier ble utført i henhold til Helsinkis retningslinjer. Pasientene ga sitt skriftlige informerte samtykke før vevsinnsamling.
Hunnrotter (150–200 g) ble kommersielt oppnådd, bedøvet ved å injisere 100 mg/kg t...

Selv om isolering av levende kardiomyocytter ble etablert for mer enn 40 år siden og fortsatt er en forutsetning for mange eksperimentelle tilnærminger i hjerteforskning, er det fortsatt en vanskelig teknikk med uforutsigbare resultater. Kardiomyocyte isolasjon via perfusjon av koronararteriene med enzymløsning brukes ofte til hjerter av små dyr og gir et stort antall levedyktige celler. Dette krever imidlertid et relativt komplekst system og kompetanse. Videre er de fleste menneskelige vevsprøver ikke egnet for den...

En banebrytende teknikk som har banet vei til viktig innsikt i kardiomyocyte fysiologi er isolering av levende ventrikulære kardiomyocytter fra intaktehjerter 1. Isolerte kardiomyocytter kan brukes til å studere normal cellulær struktur og funksjon, eller konsekvensene av in vivo eksperimenter; for eksempel, for å vurdere endringer i cellulær elektrofysiologi eller eksitasjon-sammentrekning kobling i dyremodeller av hjertesykdom. I tillegg kan isolerte kardiomyocytter brukes til cellekultur, farmakologiske inngrep, genoverføring, vevsteknikk og mange andre applikasjoner. Derfor er effektive metoder for kardiomyocyte isolasjon av grunnleggende verdi til grunnleggende og translasjonell hjerteforskning.
Kardiomyocytter fra små pattedyr, som gnagere, og fra større pattedyr, som griser eller hunder, er vanligvis isolert av koronar perfusjon av hjertet med løsninger som inneholder rå kollagenaser og / eller proteaser. Dette har blitt beskrevet som "gullstandard" -metoden for kardiomyocyteisolasjon, noe som resulterer i utbytter på opptil 70% av levedyktige celler2. Tilnærmingen har også blitt brukt med menneskelige hjerter, noe som resulterer i akseptable kardiomyocyttergir 3,4,5. Men fordi koronar perfusjon bare er mulig hvis det intakte hjertet eller en stor myokardkile som inneholder en koronargren er tilgjengelig, er de fleste menneskelige hjerteprøver ikke egnet for denne tilnærmingen på grunn av deres lille størrelse og mangel på passende vaskulatur. Derfor er isolering av menneskelige kardiomyocytter utfordrende.
Humane myokardprøver består for det meste av vevsbiter av variabel størrelse (ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm til 2 x 2 x 2 cm), oppnådd gjennom endomyocardialbiopsier 6, septal myectomies7,VAD implantasjoner8, eller fra utvåte hjerter9. De vanligste prosedyrene for kardiomyocyte isolasjon starter med å hakke vevet ved hjelp av saks eller en skalpell. Celle-til-celle-kontakter blir deretter forstyrret av nedsenking i kalsiumfrie eller lavkalsiumbuffere. Dette etterfølges av flere fordøyelsestrinn med rå enzymekstrakter eller rensede enzymer som proteaser (f.eks. trypsin), kollagnase, hyaluronidase eller elaastase, noe som resulterer i en oppløsning av den ekstracellulære matrisen og frigjøringen av kardiomyocytter. I et siste, kritisk trinn må en fysiologisk kalsiumkonsentrasjon gjenopprettes nøye, eller cellulær skade kan oppstå på grunn av kalsiumparadokset10,11,12. Denne isolasjontilnærmingen er praktisk, men vanligvis ineffektiv. For eksempel fant en studie at nesten 1 g myokardvev var nødvendig for å oppnå et tilstrekkelig antall kardiomyocytter egnet for påfølgende eksperimenter13. En mulig årsak til lave utbytter er den relativt harde metoden for å hakke vevet. Dette kan spesielt skade kardiomyocytter som ligger på chunk kantene selv om disse myocytter er mest sannsynlig å bli utgitt av enzymatisk fordøyelse.
Et annet aspekt som kan påvirke isolasjonseffektivitet og kvalitet på celler hentet fra menneskelige prøver er varigheten av vevsiskemi. De fleste protokoller nevner korte transporttider til laboratoriet som en forutsetning for gode resultater. Dette begrenser studiet av menneskelige ventrikulære kardiomyocytter til laboratorier med nærliggende hjertekirurgi fasiliteter. Sammen hindrer disse restriksjonene verifiseringen av viktige funn fra dyremodeller i menneskelige kardiomyocytter. Forbedrede isolasjonsprotokoller som tillater høye kardiomyocytteravlinger fra små mengder vev, helst uten alvorlig skade etter lengre transporttider, er derfor ønskelig.
Beskrevet her er en isolasjonsprotokoll basert på enzymatisk fordøyelse av tynne myokardvevskiver generert med en vibratom14,15. Vi viser at isolasjon fra vevskiver er mye mer effektiv enn det fra vevsbiter hakket med saks. Den beskrevne metoden gir ikke bare mulighet for høye utbytter av levedyktige menneskelige kardiomyocytter fra små mengder myokardvev, men gjelder også for prøver lagret eller transportert i kald kardioplegisk løsning i opptil 36 timer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedionemonoxime</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3494.1</td>
			<td>Purity&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B250009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Fluka Biochemica</td>
			<td>49450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting-point agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>Used for human tissue at 4 mg/mL 
			(activity: 280 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Used for rat tissue at 1.5 mg/mL 
			(activity 330 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td>Used for rat tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity &#8805; 3.5 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase XXIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Used for human tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity: 7-14 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact shaker</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>KS-15 B control</td>
			<td>Agitation direction: horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pasteur-pipettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EA65.1</td>
			<td>For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter &#8805;2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BARN88880030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter, 180 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 35, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome (VT1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices

Isolering av ventrikulære hjerte myocytter fra dyre- og menneskehjerter er en grunnleggende metode i hjerteforskning. Dyr kardiomyocytter er ofte isolert av koronar perfusjon med fordøyelsesenzymer. Imidlertid er det utfordrende å isolere menneskelige kardiomyocytter fordi menneskelige myokardprøver vanligvis ikke tillater koronar perfusjon, og alternative isolasjonsprotokoller resulterer i dårlige utbytter av levedyktige celler. I tillegg er menneskelige myokardprøver sjeldne og bare regelmessig tilgjengelige på institusjoner med hjertekirurgi på stedet. Dette hindrer oversettelsen av funn fra dyr til menneskelige kardiomyocytter. Beskrevet her er en pålitelig protokoll som muliggjør effektiv isolering av ventrikulære myocytter fra humant og dyr myokardi. For å øke overflate-til-volum-forholdet samtidig som celleskade minimeres, genereres myokardvevsskiver 300 μm tykke fra myokardprøver med vibratom. Vevskiver fordøyes deretter med protease og kollagenase. Rotte myokardi ble brukt til å etablere protokollen og kvantifisere utbytter av levedyktige, kalsiumtolerante myocytter ved strømningscytokometrisk celletelling. Sammenligning med den brukte vev-chunk metoden viste betydelig høyere utbytter av stangformede kardiomyocytter (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). Protokollen ble oversatt til sviktende og ikke-sviktende humant myokardi, hvor utbyttene var like som i rotte myokardi og igjen markert høyere enn med vev-chunk-metoden (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 celler / mg, p < 0,05). Spesielt, med protokollen presentert er det mulig å isolere rimelige antall levedyktige menneskelige kardiomyocytter (9-200 celler / mg) fra minimale mengder vev (<50 mg). Dermed er metoden gjelder for sunn og sviktende myokardi fra både menneskelige og dyrehjerter. Videre er det mulig å isolere spennende og kontraktile myocytter fra menneskelige vevsprøver lagret i opptil 36 timer i kald kardioplegisk løsning, noe som gjør metoden spesielt nyttig for laboratorier ved institusjoner uten hjertekirurgi på stedet.

For å verifisere isolasjonseffektiviteten ble protokollen brukt med rotte myokardi, og det resulterende antallet levedyktige myocytter ble sammenlignet med tallene oppnådd ved isolasjon via koronar perfusjon og ved isolasjon fra små vevsbiter (delisolasjon, Figur 2). Chunk isolasjon og isolasjon fra vevskiver ble utført fra de samme hjertene. For isolasjon via koronar perfusjon ble imidlertid hele hjertet brukt. Koronar perfusjon ga overveiende stangformede og kryss-striated kardiomyocyt...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Presentert er en protokoll for isolering av menneskelige og animalske ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardskiver. Høye utbytter av kalsiumtolerante celler (opptil 200 celler/mg) kan oppnås fra små mengder vev (<50 mg). Protokollen gjelder for myokardium utsatt for kald iskemi i opptil 36 timer.

Isolering av humane ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardskiver

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Denne protokollen fungerer med prøver fra menneske- og dyrehjerter, selv etter timer med transporttid. Opptil 200 myocytter per milligram kan isoleres fra vibratom-cut vev skiver. Elektrofysiologiske, strukturelle og biokjemiske analyser av kardiomyocytter, bidrar til å oppdage og bedre forstå, mekanismer for hjertesykdom.Etter å ha fylt en 100 millimeter vevskulturrett, med 20 milliliter kald kutteoppløsning, legg vevsprøven i kulturretten. Hold kulturretten på en tallerken avkjølt til 4 grader Celsius. Husk at levende vevsprøver fra dyr og spesielt mennesker er potensielt smittsomme.Bruk saks eller skalpell, for å fjerne overflødig fibrotisk vev og epiardialt fett, fra prøven. For optimal vibratombehandling av større vevsprøver, bruk skalpellen til å kutte åtte millimeter kuber fra vevet. For mindre prøver fra biopsier er dette ikke nødvendig.Man kan identifisere epiardium av det episke fettlaget. Etter å ha fjernet overflødig fett, legg vevsblokken, i parabolen, med epicardium vendt ned. For å forberede seg på vevsinnbygging, kok 400 milligram lavt smeltepunkt oppsto i ti milliliter kutteoppløsning.Fyll en ti milliliter sprøyte med den varme oppløste agarosegelen. Forsegle sprøyten og legg den i et 37 grader Celsius vannbad i minst 15 minutter, slik at agarose å likevekt. Bruk tang, flytt trimprøven inn i en ren 35 millimeter vevskulturrett, med epicardium vendt nedover.Fjern deretter overflødig væske fra prøven, med en steril vattpinne. Fest prøven mot bevegelse ved å holde den med tang. Og tøm sprøyten av agarose over toppen av den, og sørg for å helt nedsenk prøven helt.Umiddelbart plassert parabolen på isen og la agarose stivne i 10 minutter. Monter et ubrukt barberblad på bladholderen på vibratomen. Kalibrer om mulig vibratomen ved å justere Z-avbøyningen av bladet.Bruk en skalpell til å avgifte en agarose vevblokk som passer til prøveholderen av vibratomen. For å sikre stabilitet, sørg for at vevet fortsatt er tilstrekkelig nedsenket i agarose. Med agarose marginer, på minst åtte millimeter.Påfør et tynt lag cyanoacrylat lim til prøveholderen. Og trykk forsiktig på agarose vevsblokken, på holderen. Bygg et vibratombad, med skjæreløsning.Fyll deretter den ytre kjøletanken på vibratomen med knust is, for å opprettholde en temperatur på fire til seks grader Celsius, gjennom hele kutteprosessen. Plasser prøveholderen, som inneholder agarosevevsblokken, i vibratombadet. Bruk vibratominnstillingene som er beskrevet i manuskriptet, og generer 300 mikroliter tykke skiver.Det er avgjørende å lage seksjoner parallelt epicardium fordi dette er hvordan kardiomyocytter fibre er justert i ventrikulær vegg. Ellers vil det være for mye skade. Bruk et standard lysmikroskop, for å kontrollere justeringen av kardiomyocytter og vevsskiver.For å unngå å skade vevet, hold agarose, i stedet for selve vevet. En kardiomyocyttfibre, bør være jevnt justert og myocytter, bør ikke kontraheres. Plasser en varmeplate på laboratorieshakeren og varm den til 37 grader Celsius.Start labshakeren ved 65 O/min. Oppløs proteinase i to milliliter løsning en. Og oppløs kollagenasen, i to milliliter løsning en.Men ikke bland proteinase og kollagenase. Tilsett kalsiumklorid til kollagenaseløsningen, for en endelig konsentrasjon, på fem mikromos. Inkuber begge løsningene ved 37 grader Celsius.Bruk tang til å overføre en vevsskive til en ren 60 millimeter vevskulturrett. Med fem millimeter forhåndskjølt skjæreløsning. Hold parabolen på is eller en kald plate, fjern forsiktig agarose fra vevet, ved hjelp av et blad eller tang.For å utføre den første vasken av vevsskiver, legg en ren 35 millimeter vevskulturrett på varmebladet. Og fyll den, med to millimeter forhåndsoppvarmet løsning en. Overfør en eller to vevskiver til den tilberedte parabolen.Bruk deretter en en millimeter pipette, for vasketrinnene. Etter vask av skivene, fjern løsning en fra parabolen og legg til to milliliter proteinoppløsning. Inkuber skivene i 12 minutter på varmebladet, med risteren ved 65 o/min.Vask vevsskivene to ganger til, med to milliliter forhåndsvarmet løsning en. Deretter fjerner du løsning en fra parabolen og legger til to milliliter collagenaseløsning. Inkuber skivene i minst 30 minutter på varmebladet, med risting ved 65 o/min.Etter 15 minutter med inkubasjon, sjekk for gratis individuelle myocytter, ved å undersøke parabolen under et lett mikroskop. Fortsett å sjekke hvert femte minutt, til individuelle myocytter er synlige. Deretter, alt fordøyelsen ved å vaske skivene to ganger, med to milliliter forhåndsoppvarmet løsning to.Og fyll på parabolen, med to milliliter løsning to. Trekk forsiktig fibrene i vevsskiven fra hverandre, ved hjelp av fine tang. Fortsett å jobbe forsiktig, for å unngå å skade kardiomyocytter.Og pipette flere ganger, med en engangsbruk forbi pipetten. Deretter bekrefter du at de stangformede kardiomyocytter har skilt seg, ved å undersøke parabolen, under et lett mikroskop. Plasser fatet tilbake på varmeplaten ved 37 grader Celsius og agiter ved å riste.Ved å legge til 10 millimolar og 100 millimolar kalsiumklorid lagerløsninger, sakte øke kalsiumkonsentrasjonen av vevssuspensjon fra fem mikromolar til 1,5 millimolar. Når kalsiumøkningen er fullført, bruk tang for å fjerne eventuelle gjenværende ufordøyde vevsbiter. Først må du stoppe agitasjonen av suspensjonen.Deretter, ved hjelp av en 1000 mikroliter pipette, sakte fjerne 1/3 av løsningen, fra toppen av suspensjonen. Unngå aspirasjon av kardiomyocytter. Legg deretter til 700 mikroliter løsning tre, til cellene.Etter 10 minutter med agitasjon, gjenta disse vasketrinnene. Overfør suspensjonen til et 15 milliliter sentrifugerør. Og la kardiomyocytter sediment ved romtemperatur, i minst 10 minutter og maksimalt 30 minutter.Fjern supernatanten helt. Og resuspend pellet i modifisert tyrod løsning eller ønsket eksperimentering buffer. Ved hjelp av et lett mikroskop, bekreft cellekvaliteten.30 til 50% av kardiomyocytter bør være stangformet, glatt uten membran blebs. Og vise, klare kryssstriations. For å verifisere isolasjonseffektivitet ble protokollen brukt på rotte myokardi.Og sammenlignet med isolasjon via koronar perfusjon og isolasjon, fra små vev biter. En lavere andel av stangformede celler ble observert ved bruk av protokollen, deretter etter isolasjon ved perfusjon. Men det totale antallet var fortsatt høyt.I motsetning, isolasjon fra vev biter, ga færre stangformede celler. Flow cytometri, ble brukt til å sammenligne resultatene kvantitativt. Isolering av kardiomyocytter fra vevskiver, når ikke til utbyttet oppnådd ved koronar perfusjon.Men gir, betydelig høyere avkastning enn myocyte isolasjon, fra vev biter. Deretter ble protokollen brukt på humant myokardi. Isolasjon fra myokardskiver, ga Hyde tall og en stor andel av stang formet menneskelige myocytter.Og bare en liten andel av, avrundede kardiomyocytter. Isolasjon fra myokardskiver, resulterte i et slående høyere antall stangformede myocytter, enn isolasjon fra vevsbiter. Fotometrisk kvantifisering bekreftet en vesentlig høyere myocytt levedyktighet etter isolasjon fra myokardskiver.Menneskelige celler, isolert med den beskrevne protokollen, kan bli utsatt for strukturell analyse. Alpha actinin farging, avslørte en tett vanlig Z linje mønster og en gjennomsnittlig sarcomere lengde på 1,92 mikrometer, i hvile kardiomyocytter. LTCC og RyR farging, viste klar klynge er co-lokalisert nær cellemembranen og T tubuli.De isolerte kardiomyocytter var spennende og kunne brukes til studier på cellulær elektrofysiologi eller eksitasjon sammentrekning kobling. Handling potensiell form og varighet, var i området rapportert av andre, for ventrikulære kardiomyocytter, fra sviktende menneskelige hjerter. Kalsiumtransientene som ble registrert av Khans vokallinjeskanning, viste et klart oppslag etter stimulering.Og et akseptabelt signal-til-støy-forhold. Kardiomyocyte forkortelse ved sammentrekning kan sees fra nedbøyning av den nedre celle grensen. På grunn av det høye antallet isolatorer kardiomyocytter oppnådd av denne protokollen, er cellekultur mulig.Dette kan gi mulighet for genoverføring, farmakologisk testing og vevsteknikk av humane kardiomyocytter. En viktig applikasjon, er verifisering av funn, fra dyremodeller i menneskelige celler. Hjertesvikt er et klinisk syndrom med svært begrensede terapeutiske alternativer.Forbedrede kardiomyocytter isolasjonsteknikker vil bidra til å identifisere cellulære mål for diagnose og fremtidige terapier.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human Cardiac Forstadier og cardiomyocytes fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolasjon og Kv Channel Recordings i Murine Atrial og ventrikulær cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon og kultur av Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: En Differensiering Protokoll fra mater-frie menneskeskapte pluripotent stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering av embryonale Ventrikulære endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon og fysiologiske Analyse av Muse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolering av Small kodende RNA fra Menneskelig Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering av myofibroblasts fra Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon, kultur og transduksjon av Adult Mouse cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...