Name: isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Andreas Dendorfer, do Centro walter-Brendel de Medicina Experimental, LMU Munique, por ajuda com o protocolo de corte. Por fornecer amostras de tecido miocárdio humano gostaríamos de agradecer Ghazali Minabari e Christian Heim do Departamento de Cirurgia Cardíaca do Hospital Universitário Erlangen, Hendrik Milting do Instituto Erich & Hanna Klessmann, Ruhr-University Bochum e Muhannad Alkassar do Departamento de Cardiologia Pediátrica, Hospital Universitário Erlangen. Pelo apoio com a citometria de fluxo, gostaríamos de agradecer a Simon Völkl e colegas do Centro de Pesquisa Translacional (TRC), Hospital Universitário Erlangen. Também gostaríamos de agradecer a Lorenz McCargo e Celine Grüninger do Instituto de Fisiologia Celular e Molecular Erlangen pelo excelente suporte técnico.
Este trabalho foi apoiado pelo DZHK (Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular), pelo Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) do Hospital Universitário da Universidade de Erlangen-Nürnberg, e pela Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Todos os experimentos com ratos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso animal Mittelfranken, Baviera, Alemanha. A coleta e o uso de amostras de tecido cardíaco humano foram aprovados pelos Conselhos de Revisão Institucional da Universidade de Erlangen-Nürnberg e do Bochum ruhr-university. Os estudos foram realizados de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinque. Os pacientes deram seu consentimento por escrito informado antes da coleta de tecidos.
Ratos Wistar fêmeas (15...

Embora o isolamento dos cardiomiócitos vivos tenha sido estabelecido há mais de 40 anos e ainda seja um pré-requisito para muitas abordagens experimentais na pesquisa cardíaca, continua a ser uma técnica difícil com resultados imprevisíveis. O isolamento cardiomiocócito através da perfusão das artérias coronárias com solução enzimópica é comumente usado para corações de animais pequenos e produz um grande número de células viáveis. No entanto, isso requer um sistema e experiência relativamente compl...

Uma técnica seminal que abriu caminho para importantes insights sobre a fisiologia do cardiomiócito é o isolamento de cardiomiócitos ventriculares vivos de corações intactos1. Cardiomiócitos isolados podem ser usados para estudar a estrutura e função celular normal, ou as consequências de experimentos in vivo; por exemplo, avaliar alterações na eletrofisiologia celular ou acoplamento excitação-contração em modelos animais de doença cardíaca. Além disso, cardiomiócitos isolados podem ser usados para cultura celular, intervenções farmacológicas, transferência genética, engenharia de tecidos e muitas outras aplicações. Portanto, métodos eficientes para isolamento cardiomiócito são de valor fundamental para a pesquisa cardíaca básica e translacional.
Cardiomiócitos de pequenos mamíferos, como roedores, e de mamíferos maiores, como porcos ou cães, são comumente isolados pela perfusão coronária do coração com soluções contendo colagens brutas e/ou proteases. Este foi descrito como o método "padrão ouro" para o isolamento do cardiomiócito, resultando em rendimentos de até 70% das células viáveis2. A abordagem também tem sido utilizada com corações humanos, resultando em rendimentos de cardiomiócitos aceitáveis3,,4,5. No entanto, como a perfusão coronária só é viável se o coração intacto ou uma grande cunha miocárdia contendo um ramo da artéria coronária estiver disponível, a maioria dos espécimes cardíacos humanos não são adequados para esta abordagem devido ao seu pequeno tamanho e à falta de vasculatura apropriada. Portanto, o isolamento dos cardiomiócitos humanos é desafiador.
As amostras do miocárdio humano consistem principalmente em pedaços de tecido de tamanho variável (aproximadamente 0,5 x 0,5 x 0,5 cm a 2 x 2 x 2 cm), obtidos através de biópsias endomyocárdias6,mectomias septal7,implantações VAD8, ou de corações explanados9. Os procedimentos mais comuns para isolamento cardiomiocócito começam com picar o tecido usando uma tesoura ou um bisturi. Os contatos célula-células são então interrompidos pela imersão em tampões livres de cálcio ou de baixo cálcio. Isso é seguido por múltiplas etapas de digestão com extratos de enzimas brutas ou enzimas purificadas como proteases (por exemplo, trippsina), colagenase, hialuronidase ou elastase, resultando em desintegração da matriz extracelular e liberação de cardiomiócitos. Em um passo final e crítico, uma concentração fisiológica de cálcio deve ser cuidadosamente restaurada, ou danos celulares podem ocorrer devido ao cálcio-paradoxo10,,11,12. Essa abordagem de isolamento é conveniente, mas geralmente ineficiente. Por exemplo, um estudo descobriu que quase 1 g de tecido miocárdio era necessário para obter um número suficiente de cardiomiócitos adequados para experimentos subsequentes13. Uma possível razão para baixos rendimentos é o método relativamente severo de picar o tecido. Isso pode danificar particularmente os cardiomiócitos localizados nas bordas do pedaço, embora esses miócitos sejam mais propensos a serem liberados por digestão enzimática.
Outro aspecto que pode influenciar a eficiência do isolamento e a qualidade das células obtidas a partir de espécimes humanos é a duração da isquemia tecidual. A maioria dos protocolos menciona o curto tempo de transporte para o laboratório como pré-requisito para bons resultados. Isso restringe o estudo de cardiomiócitos ventriculares humanos a laboratórios com instalações de cirurgia cardíaca próximas. Juntas, essas restrições dificultam a verificação de achados importantes de modelos animais em cardiomiócitos humanos. Protocolos de isolamento aprimorados que permitem altos rendimentos de cardiomiócitos de pequenas quantidades de tecido, de preferência sem danos graves após tempos de transporte prolongados, são, portanto, desejáveis.
Descrito aqui é um protocolo de isolamento baseado na digestão enzimática de finas fatias de tecido miocárdio geradas com um vibratome14,15. Demonstramos que o isolamento de fatias de tecido é muito mais eficiente do que o de pedaços de tecido picados com tesouras. O método descrito não só permite altos rendimentos de cardiomiócitos humanos viáveis de pequenas quantidades de tecido miocárdio, mas também é aplicável a espécimes armazenados ou transportados em solução cardioplégica fria por até 36 h.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedionemonoxime</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3494.1</td>
			<td>Purity&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B250009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Fluka Biochemica</td>
			<td>49450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting-point agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>Used for human tissue at 4 mg/mL 
			(activity: 280 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Used for rat tissue at 1.5 mg/mL 
			(activity 330 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td>Used for rat tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity &#8805; 3.5 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase XXIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Used for human tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity: 7-14 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact shaker</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>KS-15 B control</td>
			<td>Agitation direction: horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pasteur-pipettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EA65.1</td>
			<td>For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter &#8805;2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BARN88880030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter, 180 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 35, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome (VT1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices

O isolamento de miócitos cardíacos ventriculares de corações animais e humanos é um método fundamental na pesquisa cardíaca. Cardiomiócitos animais são comumente isolados por perfusão coronária com enzimas digestivas. No entanto, isolar os cardiomiócitos humanos é um desafio porque os espécimes do miocárdio humano geralmente não permitem perfusão coronária, e protocolos alternativos de isolamento resultam em baixos rendimentos de células viáveis. Além disso, as amostras de miocárdio humano são raras e só estão disponíveis regularmente em instituições com cirurgia cardíaca no local. Isso dificulta a tradução de achados de cardiomiócitos animais para humanos. Descrito aqui é um protocolo confiável que permite o isolamento eficiente de miócitos ventriculares do miocárdio humano e animal. Para aumentar a relação superfície-volume, minimizando os danos celulares, as fatias de tecido miocárdio de 300 μm de espessura são geradas a partir de amostras do miocárdio com um vibratome. As fatias de tecido são então digeridas com protease e colagem. O miocárdio de rato foi usado para estabelecer o protocolo e quantificar os rendimentos de miócitos viáveis e tolerantes ao cálcio por contagem de células citométricas de fluxo. A comparação com o método de pedaço de tecido comumente utilizado mostrou rendimentos significativamente maiores de cardiomiócitos em forma de haste (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). O protocolo foi traduzido para o miocárdio humano falha e não falha, onde os rendimentos foram semelhantes aos do miocárdio de rato e, novamente, notavelmente maior do que com o método de pedaço de tecido (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 células/mg, p < 0,05). Notavelmente, com o protocolo apresentado é possível isolar números razoáveis de cardiomiócitos humanos viáveis (9-200 células/mg) de quantidades mínimas de tecido (<50 mgs). Assim, o método é aplicável ao miocárdio saudável e falhado tanto do coração humano quanto do animal. Além disso, é possível isolar miócitos excitáveis e contratuais de amostras de tecido humano armazenadas por até 36 h em solução cardioplégica fria, tornando o método particularmente útil para laboratórios em instituições sem cirurgia cardíaca no local.

Para verificar a eficiência do isolamento, o protocolo foi utilizado com miocárdio de rato e o número resultante de miócitos viáveis foi comparado com os números obtidos pelo isolamento via perfusão coronária e pelo isolamento de pequenos pedaços de tecido (isolamento de pedaços, Figura 2). O isolamento dos pedaços e o isolamento das fatias de tecido foram realizados dos mesmos corações. Para o isolamento via perfusão coronária, no entanto, todo o coração foi usado. A perfus...

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Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Apresentado é um protocolo para o isolamento de cardiomiócitos ventriculares humanos e animais de fatias miocárrias cortadas por vibratome. Altos rendimentos de células tolerantes ao cálcio (até 200 células/mg) podem ser obtidos a partir de pequenas quantidades de tecido (<50 mgs). O protocolo é aplicável ao miocárdio exposto à isquemia fria por até 36 h.

Isolamento de Cardiomiócitos Ventriculares Humanos de fatias de miocárdio cortadas por vibratome

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Este protocolo funciona com amostras de corações humanos e animais, mesmo após horas de tempo de transporte. Até 200 miócitos por miligrama podem ser isolados de fatias de tecido cortadas por vibratome. A análise eletrofisiológica, estrutural e bioquímica dos cardiomiócitos ajuda a descobrir e entender melhor, mecanismos de doenças cardíacas.Depois de encher um prato de cultura tecidual de 100 milímetros, com 20 mililitros de solução de corte frio, coloque a amostra de tecido no prato de cultura. Mantenha o prato de cultura em um prato resfriado a 4 graus Celsius. Tenha em mente que amostras de tecido vivo de animais e especialmente humanos são potencialmente infecciosas.Use tesoura ou bisturi, para remover o excesso de tecido fibroso e gordura epicárida, da amostra. Para o processamento ideal de vibratome de amostras de tecido maiores, use o bisturi para cortar cubos de oito milímetros do tecido. Para amostras menores de biópsias, isso não é necessário.Pode-se identificar o epicárdio pela camada de gordura epicárida. Depois de remover o excesso de gordura, coloque o bloco de tecido, no prato, com o epicardium virado para baixo. Para se preparar para a incorporação de tecidos, ferva 400 miligramas de ponto de fusão baixo em dez mililitros de solução de corte.Encha uma seringa de dez mililitros com o gel de agarose dissolvido quente. Sele a seringa e coloque-a em um banho de água de 37 graus Celsius por pelo menos 15 minutos, para permitir que a agarose se equilibre. Usando fórceps, mova a amostra de corte para um prato limpo de cultura de tecido de 35 milímetros, com o epicardium voltado para baixo.Em seguida, remova o excesso de fluido do espécime, com um cotonete estéril. Proteja o espécime contra o movimento, segurando-o com fórceps. E esvaziar a seringa de agarose sobre ele, certificando-se de imergir completamente o espécime.Imediatamente colocou o prato no gelo e deixe a agarose solidificar por 10 minutos. Monte uma lâmina de barbear nãousada no suporte da lâmina do vibratome. Se possível, calibrar o vibratome, ajustando a deflexão Z da lâmina.Use um bisturi para extirpar um bloco de tecido de ágarose que se encaixe no porta-espécimes do vibratome. Para garantir a estabilidade, certifique-se de que o tecido ainda está suficientemente imerso em agarose. Com margens de agarose, de pelo menos oito milímetros.Aplique uma fina camada de cola cianoacrilato no suporte da amostra. E pressione suavemente o bloco de tecido agarose, no suporte. Construa um banho de vibratome, com solução de corte.Em seguida, encha o tanque de resfriamento externo do vibratome com gelo esmagado, para manter uma temperatura de quatro a seis graus Celsius, durante todo o processo de corte. Coloque o porta-amostras, contendo o bloco de tecido agarose, no banho de vibratome. Usando as configurações de vibratome descritas no manuscrito, gere 300 fatias de espessura de microliter.É crucial criar seções em epicárdio paralelo porque é assim que as fibras de cardiomiócitos são alinhadas na parede ventricular. Caso contrário, haverá muito dano. Use um microscópio de luz padrão, para verificar o alinhamento dos cardiomiócitos e das fatias de tecido.Para evitar danificar o tecido, segure a agarose, em vez do tecido em si. As fibras de cardiomiócitos devem ser uniformemente alinhadas e os miócitos, não devem ser contraídos. Coloque uma placa de calor no agitador de laboratório e aqueça-a a 37 graus Celsius.Inicie o agitador de laboratório a 65 RPM. Dissolva a proteína em dois mililitros de solução um. E dissolver a colagem, em dois mililitros de solução um.Mas não misture a proteinase e a colagemnase. Adicione cloreto de cálcio à solução de colagenase, para uma concentração final, de cinco micromolar. Incubar ambas as soluções a 37 graus Celsius.Use fórceps para transferir uma fatia de tecido para um prato limpo de cultura de tecido de 60 milímetros. Com cinco milímetros de solução de corte pré-refrigerado. Mantendo o prato no gelo ou uma placa fria, remova cuidadosamente a agarose do tecido, usando uma lâmina ou fórceps.Para realizar a lavagem inicial das fatias de tecido, coloque um prato limpo de cultura de tecido de 35 milímetros na lâmina de calor. E preenchê-lo, com dois milímetros de solução pré-aquecida um. Transfira uma ou duas fatias de tecido para o prato preparado.Em seguida, use uma pipeta de um milímetro, para as etapas de lavagem. Depois de lavar as fatias, retire a solução um do prato e adicione dois mililitros da solução proteinase. Incubar as fatias por 12 minutos na lâmina de fogo, com o agitador a 65 RPM.Lave as fatias de tecido mais duas vezes, com dois mililitros de solução pré-aquecida. Em seguida, remova a solução um do prato e adicione dois mililitros de solução de colagenase. Incubar as fatias por pelo menos 30 minutos na lâmina de fogo, com agitação a 65 RPM.Após 15 minutos de incubação, verifique se há miócitos individuais gratuitos, examinando o prato sob um microscópio leve. Continue verificando a cada cinco minutos, até que os miócitos individuais sejam visíveis. Em seguida, alt digestão lavando as fatias duas vezes, com dois mililitros de solução pré-aquecida dois.E reabastecer o prato, com dois mililitros de solução dois. Puxe cuidadosamente as fibras da fatia de tecido, usando fórceps finos. Continue trabalhando com cuidado, para evitar danificar os cardiomiócitos.E pipeta várias vezes, com um único uso além de sua pipeta. Em seguida, confirme que os cardiomiócitos em forma de vara se separaram, examinando o prato, sob um microscópio leve. Coloque o prato de volta na placa de calor a 37 graus Celsius e agitar tremendo.Adicionando soluções de cloreto de cloreto de cálcio de 10 milimiliar e 100 mililitros, aumente lentamente a concentração de cálcio da suspensão do tecido de cinco micromolar para 1,5 mililitro. Quando o aumento do cálcio estiver completo, use fórceps para remover quaisquer pedaços de tecido não digerido restantes. Primeiro, pare a agitação da suspensão.Em seguida, usando uma pipeta de 1000 microliter, remova lentamente 1/3 da solução, do topo da suspensão. Evite aspiração dos cardiomiócitos. Em seguida, adicione 700 microliters de solução três, às células.Após 10 minutos de agitação, repita estes passos de lavagem. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. E permitir que os cardiomiócitos sedimentem à temperatura ambiente, por um mínimo de 10 minutos e um máximo de 30 minutos.Remova completamente o supernatante. E resuspenque a pelota em solução de tiraro ou no tampão de experimentação desejado. Usando um microscópio leve, verifique a qualidade da célula.30 a 50% dos cardiomiócitos devem ser moldados por vara, lisos sem blebs de membrana. E exibição, estrias cruzadas claras. Para verificar a eficiência do isolamento, o protocolo foi aplicado ao miocárdio de rato.E comparado com o isolamento via perfusão coronária e isolamento, de pequenos pedaços de tecido. Observou-se menor proporção de células em forma de haste ao utilizar o protocolo e, após o isolamento, por perfusão. Mas o número total ainda era alto.Em contraste, o isolamento de pedaços de tecido, rendeu menos células em forma de vara. Citometria de fluxo, foi utilizada para comparar os resultados quantitativamente. O isolamento dos cardiomiócitos de fatias de tecido não atinge o rendimento obtido pela perfusão coronária.Mas fornece, rendimentos significativamente maiores do que o isolamento do miócito, de pedaços de tecido. Em seguida, o protocolo foi aplicado ao miocárdio humano. Isolamento das fatias do miocárdio, rendeu números de Hyde e uma grande proporção de miócitos humanos em forma de vara.E apenas uma pequena proporção de cardiomiócitos arredondados. O isolamento das fatias do miocárdio resultou em um número notavelmente maior de miócitos em forma de vara, do que o isolamento de pedaços de tecido. A quantificação fotométrica confirmou uma viabilidade de miocíte substancialmente maior após o isolamento das fatias do miocárdio.As células humanas, isoladas com o protocolo descrito, podem ser submetidas à análise estrutural. A coloração de actinina alfa revelou um padrão de linha Z normal denso e um comprimento médio de sarcomere de 1,92 micrômetros, em cardiomiócitos de repouso. As manchas de LTCC e RyR mostraram que o aglomerado claro é co-localizado perto da membrana celular e dos túbulos T.Os cardiomiócitos isolados eram excitáveis e poderiam ser utilizados para estudos sobre eletrofisiologia celular ou acoplamento de contração de excitação. A forma e duração potenciais de ação estavam na faixa relatada por outros, para cardiomiócitos ventriculares, de corações humanos em falência. Os transitórios de cálcio gravados pela linha vocal de Khan, mostraram um claro upstroke após a estimulação.E, uma relação sinal aceitável para ruído. O encurtamento do cardiomiócito por contração pode ser visto a partir da deflexão da borda celular inferior. Devido ao alto número de cardiomiócitos isoladores obtidos por este protocolo, a cultura celular é possível.Isso pode permitir transferência de genes, testes farmacológicos e engenharia tecidual de cardiomiócitos humanos. Uma aplicação importante, é a verificação de achados, a partir de modelos animais em células humanas. Insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica com opções terapêuticas muito limitadas.Técnicas aprimoradas de isolamento cardiomiócito ajudarão a identificar alvos celulares para diagnóstico e terapias futuras.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolamento de células-tronco de xenoenxertos Humano do Câncer de pâncreas

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Biologia

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolamento e gravações de canais Kv em Murino cardiomiócitos atriais e ventriculares

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolamento de ARN a partir de pequenas não-codificante de Soro Humano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...