Name: isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00
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Nos gustaría dar las gracias a Andreas Dendorfer, del Centro Walter-Brendel de Medicina Experimental, LMU Munich, por su ayuda con el protocolo de corte. Por proporcionar muestras de tejido miocárdico humano, nos gustaría agradecer a Ghazali Minabari y Christian Heim del Departamento de Cirugía Cardíaca, Hospital Universitario Erlangen, Hendrik Milting del Instituto Erich & Hanna Klessmann, Ruhr-University Bochum y Muhannad Alkassar del Departamento de Cardiología Pediátrica, Hospital Universitario Erlangen. Para el apoyo con la citometría de flujo, nos gustaría dar las gracias a Simon V-ll y a sus colegas del Centro de Investigación Traslacional (TRC), Hospital Universitario Erlangen. También nos gustaría dar las gracias a Lorenz McCargo y a Celine Gracianinger del Instituto de Fisiología Celular y Molecular de Erlangen por su excelente apoyo técnico.
Este trabajo fue apoyado por el DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular), por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) en el Hospital Universitario de la Universidad de Erlangen-Núremberg, y la Universidad erlangen-Núremberg.

Todos los experimentos con ratas fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Mittelfranken, Baviera, Alemania. La recolección y el uso de muestras de tejido cardíaco humano fueron aprobados por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Erlangen-Núremberg y el Ruhr-Universidad Bochum. Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la recolección de tejidos.
<p clas...

Aunque el aislamiento de los cardiomiocitos vivos se estableció hace más de 40 años y sigue siendo un requisito previo para muchos enfoques experimentales en la investigación cardíaca, sigue siendo una técnica difícil con resultados impredecibles. El aislamiento de cardiomiocitos a través de la perfusión de las arterias coronarias con solución enzimática se utiliza comúnmente para corazones de animales pequeños y produce un gran número de células viables. Sin embargo, esto requiere un sistema y experiencia...

Una técnica seminal que ha allanado el camino a información importante sobre la fisiología cardiomiocitos es el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares vivos de corazones intactos1. Cardiomiocitos aislados se pueden utilizar para estudiar la estructura celular normal y la función, o las consecuencias de los experimentos in vivo; por ejemplo, para evaluar los cambios en la electrofisiología celular o el acoplamiento excitación-contracción en modelos animales de enfermedad cardíaca. Además, los cardiomiocitos aislados se pueden utilizar para el cultivo celular, intervenciones farmacológicas, transferencia de genes, ingeniería de tejidos y muchas otras aplicaciones. Por lo tanto, los métodos eficientes para el aislamiento de cardiomiocitos son de valor fundamental para la investigación cardíaca básica y traslacional.
Los cardiomiocitos de pequeños mamíferos, como los roedores, y de mamíferos más grandes, como cerdos o perros, son comúnmente aislados por perfusión coronaria del corazón con soluciones que contienen colágenos crudos y/o proteasas. Esto ha sido descrito como el método "estándar de oro" para el aislamiento de cardiomiocitos, lo que resulta en rendimientos de hasta el 70% de las células viables2. El enfoque también se ha utilizado con los corazones humanos, lo que resulta en rendimientos de cardiomiocitos aceptables3,,4,5. Sin embargo, debido a que la perfusión coronaria sólo es factible si el corazón intacto o una cuña miocárdica grande que contiene una rama de la arteria coronaria está disponible, la mayoría de los especímenes cardíacos humanos no son adecuados para este enfoque debido a su pequeño tamaño y la falta de vasculatura adecuada. Por lo tanto, el aislamiento de los cardiomiocitos humanos es un desafío.
Los especímenes de miocardio humano consisten principalmente en trozos de tejido de tamaño variable (aproximadamente 0,5 x 0,5 x 0,5 cm a 2 x 2 x 2 cm), obtenidos a través de biopsias endomiocardiales6, miectomies septal7, implantaciones de VAD8, o de corazones explantados9. Los procedimientos más comunes para el aislamiento de cardiomiocitos comienzan con la picadura del tejido usando tijeras o un bisturí. Los contactos de célula a célula se interrumpen por inmersión en tampones libres de calcio o de bajo contenido de calcio. Esto es seguido por múltiples pasos de digestión con extractos de enzimas brutas o enzimas purificadas como proteasas (por ejemplo, tripina), colagenasa, hialuronidasa, o elastasa, lo que resulta en una desintegración de la matriz extracelular y la liberación de los cardiomiocitos. En un paso final y crítico, una concentración fisiológica de calcio tiene que ser restaurada cuidadosamente, o el daño celular puede ocurrir debido a la paradoja de calcio10,11,12. Este enfoque de aislamiento es conveniente, pero generalmente ineficiente. Por ejemplo, un estudio encontró que casi 1 g de tejido miocárdico era necesario para obtener un número suficiente de cardiomiocitos adecuado para experimentos posteriores13. Una posible razón para los bajos rendimientos es el método relativamente duro de picar el tejido. Esto puede dañar particularmente los cardiomiocitos ubicados en los bordes de los trozos, aunque estos miocitos son más propensos a ser liberados por digestión enzimática.
Otro aspecto que puede influir en la eficiencia del aislamiento y la calidad de las células obtenidas de muestras humanas es la duración de la isquemia tisular. La mayoría de los protocolos mencionan los tiempos de transporte cortos al laboratorio como un requisito previo para obtener buenos resultados. Esto restringe el estudio de cardiomiocitos ventriculares humanos a laboratorios con instalaciones de cirugía cardíaca cercanas. Juntos, estas restricciones dificultan la verificación de hallazgos importantes de modelos animales en cardiomiocitos humanos. Por lo tanto, son deseables protocolos de aislamiento mejorados que permiten altos rendimientos de cardiomiocitos a partir de pequeñas cantidades de tejido, preferiblemente sin daños graves después de tiempos de transporte prolongados.
Aquí se describe un protocolo de aislamiento basado en la digestión enzimática de las rebanadas de tejido miocárdico delgado generadas con un vibratoma14,,15. Demostramos que el aislamiento de las rodajas de tejido es mucho más eficiente que el de los trozos de tejido picados con tijeras. El método descrito no sólo permite altos rendimientos de cardiomiocitos humanos viables a partir de pequeñas cantidades de tejido miocárdico, sino que también es aplicable a muestras almacenadas o transportadas en solución cardiopléjica en frío hasta 36 h.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedionemonoxime</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3494.1</td>
			<td>Purity&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B250009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Fluka Biochemica</td>
			<td>49450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting-point agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>Used for human tissue at 4 mg/mL 
			(activity: 280 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Used for rat tissue at 1.5 mg/mL 
			(activity 330 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td>Used for rat tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity &#8805; 3.5 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase XXIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Used for human tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity: 7-14 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact shaker</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>KS-15 B control</td>
			<td>Agitation direction: horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pasteur-pipettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EA65.1</td>
			<td>For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter &#8805;2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BARN88880030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter, 180 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 35, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome (VT1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices

El aislamiento de los miocitos cardíacos ventriculares de corazones animales y humanos es un método fundamental en la investigación cardíaca. Los cardiomiocitos animales son comúnmente aislados por perfusión coronaria con enzimas digestivas. Sin embargo, aislar los cardiomiocitos humanos es un reto porque los especímenes de miocardio humano generalmente no permiten la perfusión coronaria, y los protocolos de aislamiento alternativos resultan en rendimientos pobres de células viables. Además, los especímenes de miocardio humano son raros y solo están disponibles regularmente en instituciones con cirugía cardíaca in situ. Esto dificulta la traducción de los hallazgos de cardiomiocitos animales a humanos. Aquí se describe un protocolo fiable que permite el aislamiento eficiente de los miocitos ventriculares del miocardio humano y animal. Para aumentar la relación superficie-volumen y minimizar el daño celular, se generan rebanadas de tejido miocárdico de 300 m de espesor a partir de muestras de miocárdico con un vibratome. Las rodajas de tejido se digieren con proteasa y colagenasa. El miocardio de rata se utilizó para establecer el protocolo y cuantificar los rendimientos de miocitos viables y tolerantes al calcio mediante el recuento de células citométricas de flujo. La comparación con el método de trozos de tejido comúnmente utilizado mostró rendimientos significativamente más altos de los cardiomiocitos en forma de varilla (41,5 a 11,9 frente a 7,89 a 3,6%, p < 0,05). El protocolo se tradujo al miocardio humano en defecto y sin fallos, donde los rendimientos eran similares a los del miocardio de rata y, de nuevo, notablemente más altos que con el método de tejido-trozo (45,0 a 15,0 frente a 6,87 a 5,23 células/mg, p < 0,05). En particular, con el protocolo presentado es posible aislar un número razonable de cardiomiocitos humanos viables (9–200 células/mg) de cantidades mínimas de tejido (<50 mg). Por lo tanto, el método es aplicable al miocardio sano y en defecto de los corazones humanos y animales. Además, es posible aislar miocitos excitables y contráctiles de muestras de tejido humano almacenadas hasta 36 h en solución cardiopléjica en frío, haciendo que el método sea particularmente útil para laboratorios en instituciones sin cirugía cardíaca in situ.

Para verificar la eficiencia del aislamiento, el protocolo se utilizó con miocardio de rata y el número resultante de miocitos viables se comparó con los números obtenidos por aislamiento a través de perfusión coronaria y por aislamiento de pequeños trozos de tejido (aislamiento de trozos, Figura 2). El aislamiento de los trozos y el aislamiento de las rebanadas de tejido se realizaron desde los mismos corazones. Para el aislamiento a través de perfusión coronaria, sin embargo, se u...

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Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Presentado es un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos y animales de rodajas de miocardio cortados por vibratome. Se pueden obtener altos rendimientos de células tolerantes al calcio (hasta 200 células/mg) a partir de pequeñas cantidades de tejido (<50 mg). El protocolo es aplicable al miocardio expuesto a isquemia fría durante un máximo de 36 h.

Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos de rebanadas de miocardio de corte de vibratome

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Este protocolo funciona con muestras de corazones humanos y animales, incluso después de horas de transporte. Se pueden aislar hasta 200 miocitos por miligramo de las rodajas de tejido cortados con vibratome. El análisis electrofisiológico, estructural y bioquímico de los cardiomiocitos, ayuda a descubrir y comprender mejor los mecanismos de la enfermedad cardíaca.Después de llenar un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros, con 20 mililitros de solución de corte en frío, coloque la muestra de tejido en el plato de cultivo. Mantenga el plato de cultivo en un plato enfriado a 4 grados Celsius. Tenga en cuenta que las muestras de tejido vivo de animales y especialmente de los seres humanos son potencialmente infecciosas.Use tijeras o bisturí, para eliminar el exceso de tejido fibroso y grasa epicardial, de la muestra. Para un procesamiento óptimo del vibratoma de muestras de tejido más grandes, utilice el bisturí para cortar cubos de ocho milímetros del tejido. Para muestras más pequeñas de biopsias, esto no es necesario.Se puede identificar el epicardium por la capa de grasa epicardial. Después de eliminar el exceso de grasa, coloque el bloque de tejido, en el plato, con el epicardium hacia abajo. Para prepararse para la incrustación de tejido, hierva 400 miligramos de baja agarosa de punto de fusión en diez mililitros de solución de corte.Llene una jeringa de diez mililitros con el gel de agarosa disuelto en caliente. Selle la jeringa y colóquela en un baño de agua de 37 grados Centígrados durante al menos 15 minutos, para permitir que la agarosa se equilibre. Usando fórceps, mueva la muestra de recorte en un plato limpio de cultivo de tejido de 35 milímetros, con el epicardium hacia abajo.A continuación, retire el exceso de líquido de la muestra, con un hisopo estéril. Asegure el espécimen contra el movimiento, sosteniéndolo con fórceps. Y vacíe la jeringa de agarosa encima de ella, asegurándose de sumergir completamente el espécimen.Inmediatamente colocó el plato sobre hielo y dejar que la agarosa se solidifique durante 10 minutos. Monte una cuchilla de afeitar sin usar en el soporte de la hoja del vibratomo. Si es posible, calibrar el vibratomo, ajustando la desviación Z de la cuchilla.Usa un bisturí para extirpar un bloque de tejido de agarosa que se ajuste al soporte de la muestra del vibratoma. Para garantizar la estabilidad, asegúrese de que el tejido esté suficientemente sumergido en agarosa. Con márgenes de agarosa, de al menos ocho milímetros.Aplique una fina capa de pegamento de cianoacrilato al soporte de la muestra. Y presione suavemente el bloque de tejido de agarosa, sobre el soporte. Construir un baño vibratomo, con solución de corte.A continuación, llenar el tanque de enfriamiento exterior del vibratome con hielo triturado, para mantener una temperatura de cuatro a seis grados centígrados, durante todo el proceso de corte. Coloque el soporte de la muestra, que contiene el bloque de tejido de agarosa, en el baño del vibratomo. Usando los ajustes de vibratoma descritos en el manuscrito, genere cortes de 300 microlitros de espesor.Es crucial crear secciones en epicardio paralelo porque así es como las fibras cardiomiocitos se alinean en la pared ventricular. De lo contrario, habrá demasiado daño. Utilice un microscopio de luz estándar, para comprobar la alineación de los cardiomiocitos y las rebanadas de tejido.Para evitar dañar el tejido, sostenga la agarosa, en lugar del tejido en sí. Las fibras de cardiomiocitos deben estar alineadas uniformemente y los miocitos, no deben contraerse. Coloque una placa de calor en la coctelera de laboratorio y calientela a 37 grados centígrados.Encienda el agitador de laboratorio a 65 RPM. Disolver la proteinasa en dos mililitros de solución uno. Y disolver la colagenasa, en dos mililitros de solución uno.Pero no mezcle la proteinasa y la colagenasa. Añadir cloruro de calcio a la solución de colagenasa, para una concentración final, de cinco micromolares. Incubar ambas soluciones a 37 grados centígrados.Use fórceps para transferir una rebanada de tejido a un plato limpio de cultivo de tejido de 60 milímetros. Con cinco milímetros de solución de corte pre-refrigerada. Manteniendo el plato en hielo o en un plato frío, retire cuidadosamente la agarosa del tejido, usando una cuchilla o fórceps.Para realizar el lavado inicial de las rodajas de tejido, coloque un plato limpio de cultivo de tejido de 35 milímetros en la hoja de calor. Y llénalo, con dos milímetros de solución precale calentada uno. Transfiera una o dos rodajas de tejido al plato preparado.A continuación, utilice una pipeta de un milímetro para los pasos de lavado. Después de lavar las rodajas, retire la solución uno del plato y agregue dos mililitros de la solución proteasa. Incubar las rodajas durante 12 minutos en la cuchilla de calor, con la coctelera a 65 RPM.Lave las rodajas de tejido dos veces más, con dos mililitros de solución precalentó una. A continuación, retire la solución uno del plato y agregue dos mililitros de solución de colagenasa. Incubar las rodajas durante al menos 30 minutos en la hoja de calor, con agitación a 65 RPM.Después de 15 minutos de incubación, compruebe si hay miocitos individuales gratuitos, examinando el plato bajo un microscopio ligero. Continúe revisando cada cinco minutos, hasta que los miocitos individuales sean visibles. Luego, la digestión alt lavando las rodajas dos veces, con dos mililitros de solución precalentó dos.Y rellene el plato, con dos mililitros de solución dos. Tire con cuidado de las fibras de la rebanada de tejido, utilizando fórceps finos. Continúe trabajando con cuidado, para evitar dañar los cardiomiocitos.Y pipeta varias veces, con un solo uso más allá de su pipeta. Luego, confirme que los cardiomiocitos en forma de varilla se han separado, examinando el plato, bajo un microscopio de luz. Coloque el plato de nuevo en la placa de calor a 37 grados Celsius y agitar agitando.Mediante la adición de soluciones de 10 milimolar y 100 soluciones de uroquita de cloruro de calcio milimolar, aumentar lentamente la concentración de calcio de la suspensión de tejido de cinco micromolares a 1,5 milimolar. Cuando el aumento de calcio se haya completado, use fórceps para eliminar los trozos de tejido no digeridos restantes. En primer lugar, detenga la agitación de la suspensión.A continuación, con una pipeta de 1000 microlitro, retire lentamente 1/3 de la solución, de la parte superior de la suspensión. Evitar la aspiración de los cardiomiocitos. Luego agregue 700 microlitros de la solución tres, a las células.Después de 10 minutos de agitación, repita estos pasos de lavado. Transfiera la suspensión a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Y permitir que los cardiomiocitos sedimentar a temperatura ambiente, durante un mínimo de 10 minutos y un máximo de 30 minutos.Retire el sobrenadante por completo. Y resuspender el pellet en solución de tiro modificado o el buffer de experimentación deseado. Con un microscopio de luz, verifique la calidad de la célula.30 a 50%de los cardiomiocitos deben tener forma de varilla, lisa sin manchas de membrana. Y muestra, claras estrías cruzadas. Para verificar la eficiencia de aislamiento, el protocolo se aplicó al miocardio de rata.Y en comparación con el aislamiento a través de la perfusión coronaria y el aislamiento, de pequeños trozos de tejido. Se observó una menor proporción de células en forma de varilla cuando se utiliza el protocolo, luego después del aislamiento por perfusión. Pero el número total seguía siendo alto.Por el contrario, el aislamiento de los trozos de tejido produjo menos células en forma de varilla. La citometría de flujo, se utilizó para comparar los resultados cuantitativamente. El aislamiento de los cardiomiocitos de las rodajas de tejido, no alcanza el rendimiento obtenido por perfusión coronaria.Pero proporciona rendimientos significativamente más altos que el aislamiento de miocitos, de trozos de tejido. A continuación, el protocolo se aplicó al miocardio humano. El aislamiento de las rodajas de miocardio, produjo números de Hyde y una gran proporción de miocitos humanos en forma de varilla.Y sólo una pequeña proporción de cardiomiocitos redondeados. El aislamiento de las rodajas de miocardio, resultó en un número sorprendentemente mayor de miocitos en forma de varilla, que el aislamiento de trozos de tejido. La cuantificación fotométrica confirmó una viabilidad de miocitos sustancialmente mayor después del aislamiento de las rodajas de miocárdico.Las células humanas, aisladas con el protocolo descrito, pueden ser sometidas a análisis estructurales. La tinción de actinina alfa, reveló un patrón de línea Z regular denso y una longitud media de sarcomere de 1,92 micrómetros, en cardiomiocitos en reposo. Tinción LTCC y RyR, muestra racimo claro está co-localizado cerca de la membrana celular y los túbulos T.Los cardiomiocitos aislados eran excitables y podían utilizarse para estudios sobre electrofisiología celular o acoplamiento de contracción de excitación. Potencial de acción forma y duración, estaba en el rango reportado por otros, para cardiomiocitos ventriculares, de corazones humanos fallidos. Los transitorios de calcio grabados por Khan vocal line scanning, mostraron un claro upstroke después de la estimulación.Y, una relación señal-ruido aceptable. El acortamiento de cardiomiocitos por contracción se puede ver a partir de la desviación del borde inferior de la célula. Debido al alto número de aisladores cardiomiocitos obtenidos por este protocolo, el cultivo celular es posible.Esto puede permitir la transferencia de genes, las pruebas farmacológicas y la ingeniería de tejidos de los cardiomiocitos humanos. Una aplicación importante.es la verificación de hallazgos.de modelos animales en células humanas. La insuficiencia cardíaca es un síndrome clínico con opciones terapéuticas muy limitadas.Las técnicas mejoradas de aislamiento de cardiomiocitos ayudarán a identificar dianas celulares para el diagnóstico y futuras terapias.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

El aislamiento de células madre de cáncer de páncreas xenoinjertos

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Investigación

Biología

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Aislamiento y grabaciones Kv Canal murinos en miocitos auriculares y ventriculares

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Aislamiento de células endoteliales embrionarias ventriculares

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

El aislamiento de los pequeños RNAs no codificantes de suero humano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Aislamiento de Miofibroblastos de Mouse y Esófago Humano

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Aislamiento, cultivo y la transducción de cardiomiocitos de ratones adultos

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...