Name: isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

Vi vill tacka Andreas Dendorfer från Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, LMU München, för hjälp med skivningsprotokollet. För att ge mänskliga myokardi vävnadsprover vi vill tacka Ghazali Minabari och Christian Heim från Institutionen för hjärtkirurgi, Universitetssjukhuset Erlangen, Hendrik Milting från Erich & Hanna Klessmann Institutet, Ruhr-University Bochum och Muhannad Alkassar från Institutionen för pediatrisk kardiologi, Universitetssjukhuset Erlangen. För stöd med flödescytometri vill vi tacka Simon Völkl och kollegor från det translationella forskningscentret (TRC), Universitetssjukhuset Erlangen. Vi vill också tacka Lorenz McCargo och Celine Grüninger från Institutet för cellulär och molekylär fysiologi Erlangen för utmärkt teknisk support.
Detta arbete stöddes av DZHK (tyska centrumet för kardiovaskulär forskning), av tvärvetenskapligt centrum för klinisk forskning (IZKF) vid universitetssjukhuset vid universitetet i Erlangen-Nürnberg, och Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Alla experiment med råttor godkändes av Djurvårds- och användningskommittén Mittelfranken, Bayern, Tyskland. Insamling och användning av mänskliga hjärtvävnadsprover godkändes av de institutionella granskningsnämnderna vid universitetet i Erlangen-Nürnberg och Ruhr-universitetet Bochum. Studier genomfördes enligt Helsingforsdeklarationens riktlinjer. Patienterna gav sitt skriftliga informerade samtycke före vävnadsinsamlingen.
Kvinnliga Wistar råttor (150 –200 g) erhölls kom...

Även om isoleringen av levande kardiomyocyter inrättades för mer än 40 år sedan och är fortfarande en förutsättning för många experimentella metoder i hjärtforskning, är det fortfarande en svår teknik med oförutsägbara resultat. Kardiomyocyte isolering via perfusion av kranskärlen med enzymlösning används ofta för hjärtan av små djur och ger ett stort antal livskraftiga celler. Detta kräver dock ett relativt komplicerat system och expertis. Vidare är de flesta mänskliga vävnadsprover inte lämpad...

En banbrytande teknik som har banat väg för viktiga insikter i kardiomyocyte fysiologi är isoleringen av levande ventrikulära kardiomyocyter från intakta hjärtan1. Isolerade kardiomyocyter kan användas för att studera normal cellulär struktur och funktion, eller konsekvenserna av in vivo experiment; till exempel att bedöma förändringar i cellulär elektrofysiologi eller excitation-kontraktionskoppling i djurmodeller av hjärtsjukdom. Dessutom, isolerade kardiomyocyter kan användas för cellodling, farmakologiska insatser, genöverföring, vävnadsteknik, och många andra tillämpningar. Därför är effektiva metoder för kardiomyocyteisolering av grundläggande värde för grundläggande och translationell hjärtforskning.
Kardiomyocyter från små däggdjur, såsom gnagare, och från större däggdjur, såsom svin eller hundar, är ofta isolerade genom koronarperfusion av hjärtat med lösningar som innehåller råkollagen och/eller proteaser. Detta har beskrivits som "guldmyntfoten" metod för kardiomyocyte isolering, vilket resulterar i avkastning på upp till 70% av livskraftiga celler2. Tillvägagångssättet har också använts med mänskliga hjärtan, vilket resulterar i acceptabla kardiomyocyteavkastning 3,4,5. Men eftersom koronar perfusion är endast genomförbart om intakt hjärta eller en stor hjärtinfarkt kil som innehåller en födans gatan gren är tillgängliga, de flesta mänskliga hjärt exemplar är inte lämpade för detta tillvägagångssätt på grund av deras ringa storlek och en brist på lämpliga vasculature. Därför är isoleringen av mänskliga kardiomyocyter utmanande.
Mänskliga myokardprover består mestadels av vävnadsbitar av variabel storlek (ungefär 0,5 x 0,5 x 0,5 cm till 2 x 2 x 2 cm), som erhålls genom endomyocardial biopsier6, septal myectomies7, VAD implantationer8, eller från explanterade hjärtan9. De vanligaste procedurerna för kardiomyocyteisolering börjar med att hacka vävnaden med hjälp av sax eller en skalpell. Cell-till-cell kontakter störs sedan genom nedsänkning i kalcium-fri eller låg kalcium buffertar. Detta följs av flera matsmältningssteg med rå enzym extrakt eller renat enzymer som proteaser (t.ex., trypsin), kollagenas, hyaluronidas, eller elastase, vilket resulterar i en sönderfall av extracellulära matris och befrielse av kardiomyocyter. I ett sista, kritiskt steg, en fysiologisk kalciumkoncentration måste noggrant återställas, eller cellulära skador kan uppstå på grund av kalcium-paradox10,11,12. Denna isolering strategi är bekvämt men oftast ineffektivt. Till exempel fann en studie att nästan 1 g myokardvävnad krävdes för att få ett tillräckligt antal kardiomyocyter som lämpar sig för efterföljande experiment13. En möjlig orsak till låga avkastningar är den relativt hårda metoden att malet vävnaden. Detta kan särskilt skada kardiomyocyter ligger vid bit kanter även om dessa myocyter är mest sannolikt att släppas av enzymatisk matsmältning.
En annan aspekt som kan påverka isolering effektivitet och kvalitet av celler som erhållits från mänskliga exemplar är varaktigheten av vävnad ischemi. De flesta protokoll nämner korta transporttider till laboratoriet som en förutsättning för goda resultat. Detta begränsar studiet av mänskliga ventrikulära kardiomyocyter till laboratorier med närliggande hjärtkirurgi anläggningar. Tillsammans hämmar dessa restriktioner verifieringen av viktiga fynd från djurmodeller i humana kardiomyocyter. Förbättrad isolering protokoll som möjliggör hög kardiomyocyte avkastning från små mängder vävnad, helst utan allvarliga skador efter utökade transporttider, är därför önskvärt.
Beskrivs här är en isolering protokoll som bygger på den enzymatiska matsmältningen av tunna myokardvävnad skivor som genereras med en vibratom14,15. Vi visar att isolering från vävnad skivor är mycket effektivare än från vävnad bitar malet med sax. Den beskrivna metoden möjliggör inte bara hög avkastning av livskraftiga humana kardiomyocyter från små mängder av myokardvävnad utan är också tillämplig på exemplar som lagras eller transporteras i kall kardioplegiclösning i upp till 36 h.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedionemonoxime</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3494.1</td>
			<td>Purity&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B250009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Fluka Biochemica</td>
			<td>49450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting-point agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>Used for human tissue at 4 mg/mL 
			(activity: 280 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Used for rat tissue at 1.5 mg/mL 
			(activity 330 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td>Used for rat tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity &#8805; 3.5 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase XXIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Used for human tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity: 7-14 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact shaker</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>KS-15 B control</td>
			<td>Agitation direction: horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pasteur-pipettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EA65.1</td>
			<td>For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter &#8805;2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BARN88880030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter, 180 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 35, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome (VT1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices

Isoleringen av ventrikulära hjärt myocyter från djur och mänskliga hjärtan är en grundläggande metod i hjärtforskning. Animal kardiomyocyter är vanligen isolerade av koronar perfusion med matsmältningsenzymer. Att isolera mänskliga kardiomyocyter är dock utmanande eftersom mänskliga hjärtinfarkt exemplar vanligtvis inte tillåter för koronar perfusion, och alternativa isolering protokoll resultera i dålig avkastning av livskraftiga celler. Dessutom är mänskliga hjärtinfarkt exemplar sällsynta och endast regelbundet tillgängliga på institutioner med på plats hjärtkirurgi. Detta hämmar översättningen av resultaten från djur till mänskliga kardiomyocyter. Beskrivs här är ett tillförlitligt protokoll som möjliggör effektiv isolering av ventrikulära myocyter från människors och djurs myokardium. För att öka förhållandet mellan ytan och volym och samtidigt minimera cellskador genereras myokardvävnadsskivor 300 μm tjocka från myokardexemem med en vibratom. Vävnadsskivor rötas sedan med proteas och kollagenas. Råttan hjärtmuskel användes för att fastställa protokollet och kvantifiera avkastningen av livskraftiga, kalcium-toleranta myocyter genom flöde-cytometric cell räkna. Jämförelse med den vanligen använda vävnad-chunk metoden visade betydligt högre avkastning av stavformade kardiomyocyter (41,5 ± 11,9 vs 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). Protokollet översattes till sviktande och icke-sviktande humant hjärtmuskelium, där avkastningen var liknande som i råtta myokardium och, återigen, markant högre än med vävnad-chunk metoden (45,0 ± 15,0 vs 6,87 ± 5,23 celler/mg, p < 0,05). Noterbart, med det presenterade protokollet är det möjligt att isolera rimligt antal livskraftiga mänskliga kardiomyocyter (9–200 celler/mg) från minimala mängder vävnad (<50 mg). Således är metoden tillämplig på friska och sviktande myokardium från både mänskliga och djuriska hjärtan. Vidare är det möjligt att isolera retbara och kontraktila myocyter från mänskliga vävnadsprover som lagras i upp till 36 h i kall kardioplegisk lösning, vilket gör metoden särskilt användbar för laboratorier vid institutioner utan hjärtkirurgi på plats.

För att verifiera isoleringseffektiviteten användes protokollet med råttmokardium och det resulterande antalet livskraftiga myocyter jämfördes med de siffror som erhölls genom isolering via koronarperfusion och genom isolering från små vävnadsbitar (bitisolering, Bild 2). Chunk isolering och isolering från vävnad skivor utfördes från samma hjärtan. För isoleringen via koronarperfusion, dock, hela hjärtat användes. Koronar perfusion gett övervägande stav-formad och tvärstr...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Presenteras är ett protokoll för isolering av mänskliga och animaliska Ventrikulärt kardiomyocyter från vibratome-cut hjärtinfarkt skivor. Höga utbyten av kalciumtoleranta celler (upp till 200 celler/mg) kan erhållas från små mängder vävnad (<50 mg). Protokollet är tillämpligt på myokardium som utsätts för kallischemi i upp till 36 h.

Isolering av mänskliga Ventrikulära kardiomyocyter från Vibratome-Cut Myokardial Skivor

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Detta protokoll fungerar med prover från mänskliga och djurhjärtan, även efter timmar av transporttid. Upp till 200 myocyter per milligram kan isoleras från vibratome-cut vävnad skivor. Elektrofysiologisk, strukturell och biokemisk analys av kardiomyocyter, hjälper till att upptäcka och bättre förstå, mekanismer för hjärtsjukdom.Efter att ha fyllt en 100 millimeters vävnadsodlingsfat, med 20 milliliter kallskärningslösning, placerar du vävnadsprovet i odlingsfatet. Håll odlingsrätten på en tallrik kyld till 4 grader Celsius. Tänk på att levande vävnadsprover från djur och särskilt människor är potentiellt smittsamma.Använd sax eller skalpell, för att avlägsna överflödig fibrotisk vävnad och epissariskt fett, från provet. För optimal vibratombearbetning av större vävnadsprover, använd skalpelln för att skära åtta millimeters kuber från vävnaden. För mindre prover från biopsier är detta inte nödvändigt.Man kan identifiera det episkaardium av det episkasydliga fettlagret. Efter att ha tagit bort överflödigt fett, placera vävnadsblocket, i skålen, med epicardium nedåt. För att förbereda för vävnad inbäddning, koka 400 milligram låg smältpunkt uppstod i tio milliliter av skärlösning.Fyll en tio milliliter spruta med den heta upplösta agarosgelen. Försegla sprutan och placera den i ett 37 grader Celsius vattenbad i minst 15 minuter, så att agarosen kan ekvilo. Med hjälp av tåtor, flytta trim exemplaret i en ren 35 millimeter vävnad kultur maträtt, med epicardium nedåt.Ta sedan bort överflödig vätska från preparatet, med en steril svabb. Säkra preparatet mot rörelse, genom att hålla det med tens. Och töm sprutan av agaros över toppen av det, se till att helt sänka ner exemplaret.Omedelbart placeras skålen på is och låt agaros stelna i 10 minuter. Montera ett oanvänt rakblad på vibratomens bladhållare. Kalibrera om möjligt vibratomen, genom att justera bladets Z-avböjning.Använd en skalpell för att punktskattebelägga ett agarosvävnadsblock som passar in på vibratomens preparathållare. För att säkerställa stabilitet, se till att vävnaden fortfarande är tillräckligt nedsänkt i agaros. Med agarose marginaler, på minst åtta millimeter.Applicera ett tunt lager cyanoakrylatlim på preparathållaren. Och tryck försiktigt på agaros vävnadsblocket, på hållaren. Bygg ett vibratombad, med skärlösning.Fyll sedan den yttre kyltanken av vibratomen med krossad is, för att bibehålla en temperatur på fyra till sex grader Celsius, under hela skärprocessen. Placera preparathållaren, innehållande agarosvävnadsblocket, i vibratombadet. Med hjälp av vibratome inställningar som beskrivs i manuskriptet, generera 300 microliter tjocka skivor.Det är avgörande att skapa sektioner i parallella epicardium eftersom detta är hur kardiomyocyte fibrer är i linje i ventrikulär väggen. Annars blir det för mycket skada. Använd ett vanligt ljusmikroskop, för att kontrollera inriktningen av kardiomyocyterna och vävnadsskivorna.För att undvika att skada vävnaden, håll agaros, i stället för själva vävnaden. En kardiomyocyte fibrer, bör vara enhetligt anpassade och myocyterna, bör inte kontrakteras. Placera en värmeplatta på labbshakaren och värm den till 37 grader Celsius.Starta labbskakören vid 65 RPM. Lös upp proteinasen i två milliliter lösning ett. Och lös upp kollagenas, i två milliliter lösning ett.Men blanda inte proteinasen och kollagenasen. Tillsätt kalciumklorid till kollagenaslösningen, för en slutlig koncentration, av fem mikromolar. Inkubera båda lösningarna vid 37 grader Celsius.Använd tärna för att överföra en vävnadsskiva till en ren 60 millimeters vävnadsodlingsfat. Med fem millimeters förkyld skärlösning. Hålla skålen på is eller en kall tallrik, försiktigt bort agarose från vävnaden, med hjälp av ett blad eller tärningar.För att utföra den inledande tvätten av vävnadsskivorna, placera en ren 35 millimeters vävnadskulturskål på värmebladet. Och fyll den, med två millimeter förvarad lösning en. Överför en eller två vävnadsskivor till den beredda skålen.Använd sedan en en millimeters pipett, för tvättstegen. Efter tvättning av skivorna, ta bort lösning en från skålen och tillsätt två milliliter av proteinaslösningen. Inkubera skivorna i 12 minuter på värmebladet, med skakmaskinen vid 65 RPM.Tvätta vävnadsskivorna två gånger till, med två milliliter förvarad lösning en. Därefter ta bort lösning en från skålen och tillsätt två milliliter av kollagenaslösning. Inkubera skivorna i minst 30 minuter på värmebladet, med skakningar vid 65 RPM.Efter 15 minuters inkubation, kontrollera om fria enskilda myocyter, genom att undersöka skålen under ett ljus mikroskop. Fortsätt att kontrollera var femte minut, tills enskilda myocyter är synliga. Sedan, alt matsmältning genom att tvätta skivor två gånger, med två milliliter av förvarad lösning två.Och fylla på skålen, med två milliliter lösning två. Dra försiktigt fibrerna i vävnadsskivan isär, med hjälp av fina tensar. Fortsätt att arbeta noggrant, för att undvika att skada kardiomyocyterna.Och pipettera flera gånger, med en enda användning förbi din pipett. Sedan, bekräfta att de stavformade kardiomyocyterna har separerat, genom att undersöka skålen, under ett ljusmikroskop. Placera tillbaka skålen på värmeplattan i 37 grader Celsius och agitera genom att skaka.Genom att tillsätta 10 millimolar och 100 millimolar kalciumkloridlagerlösningar ökar långsamt kalciumkoncentrationen av vävnadsavstängningen från fem mikromolar till 1,5 millimolar. När kalciumökningen har slutförts, använd tövövingar för att ta bort eventuella återstående osmälta vävnadsbitar. Först, stoppa agitation av suspensionen.Därefter, med hjälp av en 1000 mikroliterpipett, ta långsamt bort 1/3 av lösningen, från toppen av suspensionen. Undvik aspiration av kardiomyocyterna. Tillsätt sedan 700 mikroliter av lösning tre, till cellerna.Efter 10 minuters agitation, upprepa dessa tvätta steg. Överför suspensionen till ett centrifugeringsrör på 15 milliliter. Och låt kardiomyocyterna sedimentera vid rumstemperatur, i minst 10 minuter och högst 30 minuter.Ta bort supernatanten helt. Och resuspend pelleten i modifierad tyrodelösning eller önskad experimenteringsbuffert. Med hjälp av ett ljusmikroskop verifiera cellkvaliteten.30 till 50%av kardiomyocyterna ska vara stavformade, släta utan membran blebs. Och display, tydliga korsstrisationer. För att verifiera isoleringseffektiviteten tillämpades protokollet på rått-myokardium.Och jämfört med isolering via koronarperfusion och isolering, från små vävnadbitar. En lägre andel av stavformade celler observerades vid användning av protokollet, sedan efter isolering genom perfusion. Men det totala antalet var fortfarande högt.Däremot, isolering från vävnad bitar, gav färre stavformade celler. Flödescytometri, användes för att jämföra resultaten kvantitativt. Isoleringen av kardiomyocyter från vävnadsskivor, når inte till den avkastning som erhålls genom koronar perfusion.Men ger, betydligt högre avkastning än myocyte isolering, från vävnad bitar. Därefter tillämpades protokollet på humant hjärtmuskel. Isolering från myokardsegment, gav Hyde nummer och en stor andel av staven formade mänskliga myocyter.Och bara en liten del av, rundade kardiomyocyter. Isolering från myokardiska skivor, resulterade i ett påfallande högre antal stavformade myocyter, än isolering från vävnad bitar. Fotometrisk kvantifiering bekräftade en väsentligen högre myocyte livskraft efter isolering från hjärtinfarkt skivor.Mänskliga celler, isolerade med det beskrivna protokollet, kan utsättas för strukturell analys. Alpha aktinin färgning, visade en tät regelbunden Z linje mönster och en genomsnittlig sarcomere längd 1,92 mikrometer, i vila kardiomyocyter. LTCC och RyR färgning, visade tydliga klustret är co-lokaliserade nära cellmembranet och T tubules.De isolerade kardiomyocyter var retbara och kunde användas för studier på cellulära elektrofysiologi eller excitation kontraktion koppling. Åtgärder potentiella form och varaktighet, var i intervallet rapporteras av andra, för Ventrikulärt kardiomyocyter, från att misslyckas mänskliga hjärtan. Kalciumtransienter som registrerats av Khan vocal line scanning, visade en tydlig upstroke efter stimulering.Och, en acceptabel signal till brus förhållande. Kardiomycyt förkortning genom kontraktion kan ses från deformation av den nedre cellen gränsen. På grund av det höga antalet isolatorer kardiomyocyter som erhållits genom detta protokoll, cellkulturens möjligt.Detta kan möjliggöra för genöverföring, farmakologisk testning och vävnadsteknik av mänskliga kardiomyocyter. En viktig tillämpning, är verifieringen av fynd, från djurmodeller i mänskliga celler. Hjärtsvikt är ett kliniskt syndrom med mycket begränsade terapeutiska alternativ.Förbättrad kardiomyocyte isolering tekniker kommer att bidra till att identifiera cellulära mål för diagnos och framtida terapier.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolering av stamceller från mänskliga xenografter Pankreascancer

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolering och Kv Recordings Channel i murina förmaks-och ventrikulära kardiomyocyter

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolering och odling av neonatala Mus Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering av embryonala Ventrikulära Endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolering och fysiologisk Analys av Mus Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolering av små icke-kodande RNA från humant serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering av Myofibroblaster från mus och Human matstrupen

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolering, kultur och Transduction av vuxna möss Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...