Name: modeling age-associated neurodegenerative diseases in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-08-15T14:00:00
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Ringraziamo Chaniotakis M. e Kounakis K. per la registrazione video e l'editing. K.P. è finanziato da una sovvenzione della Fondazione ellenica per la ricerca e l'innovazione (HFRI) e del Segretariato generale per la ricerca e la tecnologia (GSRT). N.T. è finanziata da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (CER – GA695190 – MANNA), dei programmi quadro della Commissione europea e del Ministero greco dell'istruzione.

1. Morte delle cellule necrotiche indotta da canali ionici iperattivi
NOTA: Mutazioni di guadagno di funzione nella famiglia genica dei degenerins, tra cui mec-4 e deg-3 tra gli altri, provoca la generazione di canali iperattivi che innescano la morte necrotica cellulare di sei neuroni recettori tattili necessari per la meccanoscima nei vermi3. La necrosi indotta dalla stimolazione aberrante dei degenerini mostra diverse somiglianze meccanicistiche e mor...

<ol>
	<li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).</li><li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+neuronal+necrosis:+rogue+biology.">The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).</li><li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+mechanotransduction:+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).</li><li>Berkowitz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+C.+elegans+dopamine+neuron+degeneration+assay+for+the+validation+of+potential+Parkinson's+disease+genes.">Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model.">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li><li>Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+disruption+of+cellular+protein+folding+in+models+of+polyglutamine+diseases.">Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases.</a> Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Labbadia, J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+proteostasis+in+aging+and+disease.">The biology of proteostasis in aging and disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).</li><li>Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+dopamine+neuron+degeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).</li><li>Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+protect+from+heat-stroke-associated+neurodegeneration.">Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration.</a> Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).</li><li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat+shock+proteins+and+neurodegeneration:+recent+developments.">Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments.</a> BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).</li><li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans.">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans.">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li><li>Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).</li></ol>

Qui, introduciamo e descriviamo metodologie ampiamente accessibili per la crescita, la sincronizzazione e l'esame microscopico di alcuni modelli versatili di C. elegans che studiano la neurodegenerazione dipendente dall'età. In particolare, valutiamo e seleviamo le basi cellulari e molecolari della ripartizione neuronale legata all'età utilizzando necrosi ionica indotta dal canale iperattivato e neurotossicità indotta da proteine1,2,<sup cl...

Negli ultimi due decenni, C. elegans è stato ampiamente utilizzato come organismo modello per studiare i meccanismi molecolari della morte cellulare necrotica. C. elegans offre un sistema nervoso eccezionalmente ben caratterizzato e mappato, una struttura del corpo trasparente e un repertorio diversificato di metodi genetici e di imaging per monitorare la funzione cellulare in vivo e la sopravvivenza durante l'invecchiamento. Così, diversi modelli genetici C. elegans di neurodegenerazione sono già stati sviluppati per valutare la vitalità neuronale. In particolare, i modelli di nematode ben descritti e utilizzati includono la necrosi ioattiva indotta dal canale ionico1,2,3 e la morte cellulare innescata da una maggiore aggregazione proteica4,5,6,7,8,9,10 e colpo di calore11,12, tra gli altri.
L'esposizione a breve termine a temperature subletali ha conferito resistenza contro la morte delle cellule necrotiche, innescata da un successivo stress termico sia nei nematodi che nei neuroni mammiferi11. È interessante notare che il precondizionamento giornaliero dei nematodi a una temperatura elevata lieve protegge dalla neurodegenerazione, che viene inflitta da diversi stimoli, come lo squilibrio ionico (ad esempio, il mec-4(u231) e/o il deg-3 (u662)) e l'aggregazione delle proteine (ad esempio, zo-sinucleina e poliQ40)11,13.
Qui, descriviamo metodologie versatili usando C. elegans per monitorare e valutare la neurodegenerazione dipendente dall'età in modelli consolidati di malattie umane, come la morte cellulare innescata da eccitotossicità, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington. Inoltre, sottolineiamo il ruolo neuroprotettivo del precondizionamento del calore in diversi modelli di neurodegenerazione. Una combinazione di queste tecniche con schermi genetici e/o farmacologici comporterà l'identificazione e la caratterizzazione di nuovi modulatori di morte cellulare, con potenziale interesse terapeutico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>8,40,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dehydrate (CaCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>17101.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deg-3(u662)V or deg-3(d)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope (Nomarsky)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axio Vert A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SMZ645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>EVOS Cell Imaging Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,37,010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mec-4(u231)X or mec-4(d)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>10 006 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>01 010 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office 2011 Excel software package</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth medium (NGM) agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin stock solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,40,41,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical analysis software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Prism software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UA44: Is[baIn1; pdat-1&#945;-syn, pdat-1GFP]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling age-associated neurodegenerative diseases in caenorhabditis elegans

Combattere le patologie neurodegenerative umane e gestire il loro impatto socioeconomico pervasivo sta diventando una priorità globale. Nonostante i loro effetti nocivi sulla qualità della vita umana e sul sistema sanitario, la maggior parte dei disturbi neurodegenerativi umani rimangono ancora incurabili e non prevenibili. Pertanto, lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici contro tali malattie sta diventando un'urgenza urgente. Il deterioramento associato all'età dei circuiti neuronali e della funzione è evolutivamente conservato in organismi diversi come il verme umile Caenorhabditis elegans e gli esseri umani, che significa somiglianze nei meccanismi cellulari e molecolari sottostanti. C. elegans è un modello genetico altamente malleabile, che offre un sistema nervoso ben caratterizzato, trasparenza del corpo e un repertorio diversificato di tecniche genetiche e di imaging per valutare l'attività neuronale e il controllo della qualità durante l'invecchiamento. Qui, introduciamo e descriviamo metodologie che utilizzano alcuni modelli di nematodi versatili, tra cui la necrosi ioonizzata indotta dal canale ionico (ad esempio, deg-3(d) e mec-4(d)) e l'aggregazione proteica (ad esempio, la siccoliera e la neurotossicisia indotta dalla poli-glutamata) per sezionare e sezionare le basi cellulari e molecolari. Una combinazione di questi modelli di neurodegenerazione animale, insieme a schermi genetici e farmacologici per modulatori di morte cellulare porterà a una comprensione senza precedenti della ripartizione della funzione neuronale legata all'età e fornirà informazioni critiche con ampia rilevanza per la salute umana e la qualità della vita.

Indotta dalla morte delle cellule necrotiche dai canali ionici iperattivi Utilizzando le procedure qui presentate, gli embrioni mutanti mec-4(u231) e deg-3u662) sono stati incubati per 25 min a 34 gradi centigradi o mantenuti alla temperatura standard di 20 gradi centigradi. Alla schiusa, il numero di cadaveri di cellule neuronali è stato determinato nella fase larvale L1 di entrambi i gruppi. La morte delle cellule necrotiche è diminuita nei nematodi che si schiudono dalle uova pr...

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Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Qui, introduciamo e descriviamo metodologie ampiamente accessibili utilizzando alcuni modelli di nematodi versatili, tra cui la necrosi ionica indotta dal canale ionico e la neurotossicità indotta da aggregazioni proteiche, per monitorare e sezionare le basi cellulari e molecolari delle malattie neurodegenerative associate all'età.

Modellazione di malattie neurodegenerative associate all'età in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Negli ultimi decenni, la durata della vita umana è stata estesa, a causa del miglioramento del tenore di vita e dei progressi nella scienza medica. L'età è il principale fattore di rischio per molte malattie potenzialmente letali, tra cui i disturbi neurodegenerativi, come l'Alzheimer, il morbo di Parkinson e il morbo di Huntington. Qui, dimostriamo metodologie che utilizzano alcuni nuovi modelli di metodo versatili, tra cui necrosi indotta da canali ionici iperattivi e aggregati proteici induce la neurotossicità, per monitorare e sezionare il meccanismo molecolare cellulare della degenerazione neurale.Picco di larve healthful di fare quattro e fare tre nematodi Newton su nematode crescita media piastra, setacciando con E.Coli utilizzando sezionando microscopio stereo. Posizionare dieci e quattro nematodi, piastra enzimatica parassita e farli crescere alla temperatura standard, di 20 gradi celsius. Cinque giorni dopo, lavare la piastra con 1 ml e 9 tampone e raccogliere gli animali in un tubo da 1,5 ml.Centrifugare a 30.000 g per 30 secondi e rimuovere il supernatante. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di placcatura. La soluzione di placcatura viene conservata a temperatura ambiente.Vortice e monitor periodicamente fino a quando non si sono sciolti tutti. Evitare la placcatura per periodi superiori a cinque minuti. Centrifugare a 10.000 g per 30 secondi e rimuovere il supernatante.Lavare il doppio della tavolozza con 1 mL e nove buffer. Centrifugare a 10000 g per 30 secondi e rimuovere il supernatante. Dopo il lavaggio, rimorsi le uova in 200 microlitri M9 tamponare e incubarle per 25 minuti, a 34 gradi Celsius in un bagno d'acqua.Mantenere un gruppo separato di uova a 20 gradi Celsius. Pipettare 100 microlitri contenenti uova trattate con controllo o shock termico e posizionarle su una piastra da 10 GN senza piombo. Ogni piatto contiene almeno da 100 a 200 uova.Incubare le uova a 20 gradi celsius fino alla schiusa. Utilizzare e M9 tamponare per lavare le piastre e raccogliere la durata dell'L1 e i nematodi in un tubo da 1,5 ml. Centrifuga a 10.000 g per 30 secondi.Rimuovere il supernatante e mantenere la tavolozza. Aggiungere 100 microlitri di tampone levangiale M9 da 20 millimolare per anestetizzare i nematodi. Pipetta 10 microlitri di tampone levangiale M9, contenenti orologio L1 e montarli in un punto 2%agar-ls posizionare delicatamente un coverslip sulla parte superiore del campione.Osservare l'orologio utilizzando la microscopia DIC. Scansione della degenerazione dei 630 neuroni recettoriali contando le cellule con un caratteristico aspetto virtualmente aiutato di quel nematode. Sincronizza i nematodi selezionando e trasferendo da 15 a 20 larve L4 di ciascuna in sforzo sui batteri C e poi sulle piastre GM.Incubare e lasciare che i nematodi crescano alla temperatura standard di 20 gradi Celsius. Eseguire la precondizione giornaliera per 30 minuti trasferendo le piastre in un incubatore impostato a 34 gradi Celsius. Quindi riportare i nematodi precondizione alla temperatura standard di 20 gradi Celsius.Aggiungere 10 microlitri di tampone levangiale M9 da 20 millimolare al centro del punto agar-ls. Raccogliere i rispettivi nematodi transgenici e trasferirli in caduta levangiale M9. Posizionare da 20 a 30 nematodi per goccia.Posizionare delicatamente coprire lo scivolamento sulla parte superiore del campione. Sigillare lo scivolo del coperchio con smalto per preservare l'umidità durante tutto il processo di imaging. Utilizzando un microscopio a fluorescenza combinato con una fotocamera, rileva e cattura le immagini di studio della regione della testa con un ingrandimento di 20 x.Monitora sette giorni di nematodi transgenici per la morte delle cellule neuronali dopaminergiche. Misurare gli aggregati policulali neuronali nella regione testa di animali transgenici di quattro giorni che esprimono 240 fusioni con persone vive. La morte necrotica delle cellule ha indotto un canale ionico iperattivo è il più principale nei nematodi che hanno le uova precondizioni per shock termico precedenti.Precondizione da shock termico, promuovendo una previsione contro la morte cellulare indotta da alfa-sinuleina nell'enfafrodite adulta di sette giorni e diminuisce gli aggregati proteici Q40 nella regione principale degli adulti di quattro giorni. L'invecchiamento è una conseguenza dei danni causati dalla graduale degenerazione dell'omeostasi cellulare e tissutale. Quindi la comprensione della manipolazione della rottura neuronale legata all'età sono le priorità dei primi posti.Le tecniche presentate combinate con la genetica e gli schermi farmacologici potrebbero portare ad una notifica di normali modulatori di morte cellulare con potenziale interesse terapeutico.

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