Name: modeling age-associated neurodegenerative diseases in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-08-15T14:00:00
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チャニオタキス・Mとクナキス・Kのビデオ録画と編集に感謝します。K.P.は、ギリシャ研究イノベーション財団(HFRI)と研究技術総事務局(GSRT)からの助成金を受けています。N.T.は欧州研究評議会(ERC – GA695190 – MANNA)、欧州委員会枠組みプログラム、ギリシャ教育省からの助成金によって資金提供されています。

1. 多動性イオンチャネルによる壊死細胞死
注:デゲネリンの遺伝子ファミリーにおける機能の利益変異は、とりわけ mec-4 および deg-3 を含む、ワーム3のメカノセンセーションに必要な6つのタッチ受容体ニューロンの壊死細胞死を引き起こす多動性イオンチャネルの生成をもたらす。デゲネリンの異常刺激によって誘発される壊死は、哺乳類?...

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	<li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).</li><li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+neuronal+necrosis:+rogue+biology.">The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).</li><li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+mechanotransduction:+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).</li><li>Berkowitz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+C.+elegans+dopamine+neuron+degeneration+assay+for+the+validation+of+potential+Parkinson's+disease+genes.">Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model.">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li><li>Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+disruption+of+cellular+protein+folding+in+models+of+polyglutamine+diseases.">Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases.</a> Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Labbadia, J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+proteostasis+in+aging+and+disease.">The biology of proteostasis in aging and disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).</li><li>Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+dopamine+neuron+degeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).</li><li>Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+protect+from+heat-stroke-associated+neurodegeneration.">Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration.</a> Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).</li><li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat+shock+proteins+and+neurodegeneration:+recent+developments.">Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments.</a> BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).</li><li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans.">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans.">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li><li>Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).</li></ol>

ここでは、年齢依存性神経変性を調査するいくつかの汎用性の高いC.エレガンスモデルの成長、同期および顕微鏡検査のための広くアクセス可能な方法論を紹介し、説明する。特に、過活性化イオンチャネル誘導性壊死およびタンパク質凝集誘発神経毒性,,1、2、3、4、5、7、9、10、112,3を用いて、1年?...

過去20年間、C.エレガンスは壊死細胞死の分子メカニズムを調べるモデル生物として広く使用されてきました。C.エレガンスは、非常によく特徴付け、マッピングされた神経系、透明な身体構造、および老化を通して生体内細胞機能および生存を監視する遺伝的およびイメージング方法の多様なレパートリーを提供する。したがって、神経変性のいくつかのC.エレガンス遺伝モデルは、神経細胞の生存率を評価するために既に開発されている。,特に、よく説明され、使用される線虫モデルは、タンパク質凝集,,,,,44、5、6、7、8、9、105および熱中ストローク,896711、12、とりわけ増加したタンパク質凝集によって引き起こされる多動11性イオンチャネル誘導性壊死12101、2、3および細胞死を含む。3 ,
致死下の温度への短期的な暴露は、壊死細胞死に対する耐性を与え、線虫および哺乳類ニューロン11の両方におけるその後の熱ストレスによって引き起こされた。興味深いことに、穏やかな高温での線虫の毎日の予備調整は、イオン的不均衡(例えば、mec-4(u231)および/またはdeg-3(u662))およびタンパク質凝集(例えば、α-シヌクレインおよびPolyQ40)11,13のような多様な刺激によって引き起こされる神経変性から11,13保護する。
ここでは 、C.エレガンス を使用して、興奮性毒性誘発細胞死、パーキンソン病およびハンチントン病などのヒト疾患の確立されたモデルにおける年齢依存性神経変性を監視および評価するための汎用性の高い方法論について説明する。さらに、我々は、神経変性のいくつかのモデルにおける熱プレコンディショニングの神経保護的役割を強調する。これらの技術を遺伝的および/または薬理学的スクリーンと組み合わせることで、新しい細胞死モジュレーターの同定と特性化が生じ、潜在的な治療上の関心を持つ。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>8,40,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dehydrate (CaCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>17101.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deg-3(u662)V or deg-3(d)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope (Nomarsky)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axio Vert A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SMZ645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>EVOS Cell Imaging Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,37,010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mec-4(u231)X or mec-4(d)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>10 006 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>01 010 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office 2011 Excel software package</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth medium (NGM) agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin stock solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,40,41,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical analysis software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Prism software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UA44: Is[baIn1; pdat-1&#945;-syn, pdat-1GFP]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling age-associated neurodegenerative diseases in caenorhabditis elegans

ヒトの神経変性病理と闘い、その広範な社会経済的影響を管理することは、世界的な優先事項になりつつあります。人間の生活の質と医療システムに対する有害な影響にもかかわらず、人間の神経変性疾患の大半は依然として不治で予防不可能なままです。したがって、このような病気に対する新たな治療介入の開発は、緊急性を迫っている。神経回路および機能の年齢関連の悪化は、低ワーム のカエノハブディティス・エレガンス やヒトと同じくらい多様な生物において進化的に保存され、基礎となる細胞および分子メカニズムの類似性を意味する。 C.エレガンス は非常に可鍛性の高い遺伝モデルであり、よく特徴付けられる神経系、身体の透明性、および老化時の神経活動と品質管理を評価するための遺伝的およびイメージング技術の多様なレパートリーを提供する。ここでは、過活性化イオンチャネル誘発壊死( 例えば、deg-3(d) および mec-4(d))およびタンパク質凝集(例えば、α-シリン酸およびポリグルタミン酸)誘導神経毒性を含むいくつかの汎用性の高い線虫モデルを利用した方法論を紹介し、説明する。これらの動物神経変性モデルと細胞死モジュレーターの遺伝的および薬理学的スクリーンの組み合わせは、神経機能の年齢関連の内訳の前例のない理解をもたらし、人間の健康と生活の質に広く関連する重要な洞察を提供します。

多動性イオンチャネルによる壊死細胞死 ここで示した手順を用いて、mec-4(u231)およびdeg-3u662)変異胚を34°Cで25分間インキュベートするか、または20°Cの標準温度で保った。孵化の際、両群のL1幼虫段階で神経細胞の死体数が決定された。壊死細胞死は、熱ショック予調卵から孵化した線虫において減少する(図1A-1B)。
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Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

ここでは、過活性化イオンチャネル誘導性壊死やタンパク質凝集誘発神経毒性を含む、多目的な線虫モデルを利用した広くアクセス可能な方法論を紹介し、年齢関連神経変性疾患の細胞および分子基盤を監視および解剖する。

カエノハブディティス・エレガンスにおける年齢関連神経変性疾患のモデル化

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

過去数十年にわたり、生活水準の向上と医学の進歩により、人間の寿命が延びています。年齢は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患を含む多くの生命を脅かす疾患の最大の危険因子です。ここでは、神経変性の細胞分子機構を監視・解剖するために、超活性イオンチャネル誘導壊死やタンパク質凝集体を含む、いくつかの多目的な新しい方法モデルを用いた方法論を実証する。ピークの健康に満ちた幼虫は4を作り、3つのニュートン線虫を線虫成長培地プレートに作り、解剖ステレオ顕微鏡を使用して大腸菌をふるいにかける。10個と4本の線虫、寄生酵素プレートを置き、摂氏20度の標準温度で成長させます。5日後、プレートを1 mLと9バッファーで洗浄し、1.5mLチューブで動物を採取します。30,000gで30秒間遠心分離機を使用し、上清を取り除きます。0.5 mLのメッキ液を加えます。めっき液は室温で保存する。ボルテックスとモニターは、それらがすべて溶解するまで定期的に行います。5分以上の間はめっきを避けてください。遠心分離機で10,000gで30秒間、上清を取り除きます。1 mL と 9 つのバッファーでパレットを 2 回洗浄します。10000gで30秒間遠心分離機を使用し、上清を取り除きます。洗浄後、200マイクロリットルM9バッファーで卵を再懸濁し、水浴で摂氏34度で25分間インキュベートします。摂氏20度で卵の別々のグループを維持します。コントロールまたはヒートショックを含むピペット100マイクロリットルは、卵を処理し、シードなし10 GNプレート上に置きます。各プレートには、少なくとも100〜200個の卵が含まれています。孵化するまで20度摂氏で卵をインキュベートします。プレートを洗浄し、1.5 mlチューブ内のL1寿命と線虫を収集するために使用し、M9バッファ。遠心分離機は10,000gで30秒間。上清を取り除き、パレットを保持します。線虫を麻酔するために20ミリモルM9レバンジアルバッファーの100マイクロリットルを加えます。ピペット10マイクロリットルのM9レバンジアルバッファーは、L1ウォッチを含み、サンプルの上部にそっとカバースリップを2%寒天-lsスポットに取り付けます。DIC顕微鏡を用いて観察します。その線虫の特徴的な仮想援助外観を有する細胞を数えることによって630受容体ニューロンの変性をスキャンする。最初の細菌C、GMプレートの各菌株の15〜20 L4幼虫を選択して移送することによって線虫を同期させます。インキュベートし、線虫が摂氏20度の標準温度で成長するようにしましょう。34°Cに設定されたインキュベーターでプレートを移して、毎日30分間のプレコンディショニングを行います。次に、予め調整された線虫を摂氏20度の標準温度に戻します。寒天-lsスポットの中心に20ミリモルM9レバンギアルバッファードロップの10マイクロリットルを追加します。それぞれのトランスジェニック線虫を選び、M9レバンジアルドロップで転送します。1滴あたり20〜30線虫を配置します。サンプルの上部にそっとカバースリップを置きます。マニキュアでカバースリップを密封し、イメージングプロセス全体の湿度を維持します。カメラと組み合わせた蛍光顕微鏡を使用して、20 x倍率でヘッド領域の研究画像を検出してキャプチャします。ドーパミン作動性神経細胞死のためのトランスジェニック線虫の7日間を監視します。生きている人々との240の融合を発現する4日齢のトランスジェニック動物の頭部領域におけるニューロンのポリクル凝集体を測定する。壊死細胞死は、過剰活動性イオンチャネルを誘発し、かつての熱ショック予調卵を有する線虫の中で最も主要である。ヒートショックプレコンディショニングは、7日齢の成人雌雄同体におけるα-シヌクレイン誘導細胞死に対する予測を促進し、4日齢成人の頭領域におけるQ40タンパク質凝集体を減少させる。老化は、細胞および組織恒常性の徐々に変性によって引き起こされる損傷の結果である。したがって、加齢に伴う神経の分解を操作する理解は、最優先事項です。提示された技術は、遺伝学および薬理学的スクリーンと組み合わせることで、潜在的な治療上の関心を持つ正常な細胞死変調器の通知につながる可能性がある。

Research

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