Name: modeling age-associated neurodegenerative diseases in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-08-15T14:00:00
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비디오 녹화 및 편집에 대한 차니오타키스 M. 및 쿠나키스 K. 감사드립니다. K.P.는 그리스 연구 혁신 재단(HFRI)과 연구 기술 총무사(GSRT)의 보조금으로 지원받고 있습니다. N.T.는 유럽 연구 위원회 (ERC – GA695190 – MANNA), 유럽 위원회 프레임 워크 프로그램 및 그리스 교육부의 보조금으로 지원됩니다.

1. 음과 이온 채널에 의해 유도 된 괴사 세포 죽음
참고: 메크-4 및 deg-3을 포함한 degenerins유전자 패밀리의 기능성 돌연변이는 웜3에서메카노센션에 필요한 6개의 터치 수용체 뉴런의 괴사 세포 사멸을 유발하는 활동적인 이온 채널의 생성을 초래한다. 괴사는 degenerins의 비정상적인 자극에 의해 유도된 포유류에 있는 흥분 독성에 몇몇 기계론및 형?...

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	<li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).</li><li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+neuronal+necrosis:+rogue+biology.">The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).</li><li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+mechanotransduction:+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).</li><li>Berkowitz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+C.+elegans+dopamine+neuron+degeneration+assay+for+the+validation+of+potential+Parkinson's+disease+genes.">Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Labbadia, J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+proteostasis+in+aging+and+disease.">The biology of proteostasis in aging and disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).</li><li>Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. 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T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans.">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans.">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li><li>Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).</li></ol>

여기에서, 우리는 노화에 의존하는 신경 변성을 조사하는 몇몇 다재다능한 C. elegans 모형의 성장, 동기화 및 현미경 검사를 위한 넓게 접근하는 방법론을 소개하고 기술합니다. 특히, 하이퍼활성화이온 채널 유도 괴사,및 단백질 골재 유발 신경독성1,2,23,3,4,,5,<...

지난 2 년 동안, C. elegans 널리 괴사 세포 죽음의 분자 메커니즘을 조사 하는 모델 유기체로 사용 되었습니다. C. elegans는 매우 잘 특성화되고 매핑된 신경계, 투명한 신체 구조 및 노화 전반에 걸쳐 생체 외세포 기능 및 생존을 모니터링하는 유전 및 이미징 방법의 다양한 레퍼토리를 제공합니다. 따라서, 신경 변성의 몇몇 C. elegans 유전 모형은 이미 신경 생존성을 평가하기 위하여 개발되었습니다. 특히, 잘 설명되고 사용되는 선충 모델은 단백질,집계4, 5, 6, 7, 8, 9,10 및 열사병 11, 12, 그 외 에서 단백질,집계1,,4,5,,6,7,78,9,10 및 열사병11, 12,그 외에서 증가된 단백질 집계에 의해 유발되는 활동적인 이온 채널 유도 괴사1,2,3 및세포 사멸을 포함한다.2
사외 치명적인 온도에 단기 노출은 선충과 포유류 뉴런11모두에서 후속 열 스트레스에 의해 트리거 괴사 세포 죽음에 대한 저항을 부여했다. 흥미롭게도, 온화한 고온에서 선충의 매일 전제 조건은 이온 불균형 (예를 들어, mec-4 (u231) 및 /또는 deg-3 (u662)및 단백질 집계 (예를 들어, α-synuclein 및 polyQ41) 및 폴리11Q41등 다양한 자극에 의해 가해지는 신경 변성으로부터보호합니다.13
여기서는 C. elegans를 사용하여 발췌 독성 유발 세포 사망, 파킨슨병 및 헌팅턴 병과 같은 잘 확립 된 인간 질환 모델에서 연령 의존적 신경 변성을 모니터링하고 평가합니다. 또한, 우리는 신경 변성의 여러 모델에서 열 전조의 신경 보호 역할을 강조. 유전 및/또는 약리학적 스크린과 함께 이러한 기술의 조합은 잠재적인 치료 적 관심과 함께 새로운 세포 죽음 변조기의 식별 및 특성화를 초래할 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>8,40,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dehydrate (CaCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>17101.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deg-3(u662)V or deg-3(d)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope (Nomarsky)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axio Vert A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SMZ645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>EVOS Cell Imaging Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,37,010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mec-4(u231)X or mec-4(d)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>10 006 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>01 010 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office 2011 Excel software package</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth medium (NGM) agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin stock solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,40,41,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical analysis software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Prism software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UA44: Is[baIn1; pdat-1&#945;-syn, pdat-1GFP]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling age-associated neurodegenerative diseases in caenorhabditis elegans

인간의 신경 퇴행성 병리학과 싸우고 그들의 만연한 사회 경제적 영향을 관리하는 것은 글로벌 우선 순위가되고있다. 인간의 삶의 질과 의료 시스템에 대한 해로운 영향에도 불구하고, 인간의 신경 퇴행성 질환의 대부분은 여전히 불치의 예방 할 수없는 남아있다. 따라서 이러한 질병에 대한 새로운 치료 개입의 개발은 시급한 시급성이되고 있습니다. 뉴런 회로와 기능의 노화와 관련된 악화는 낮은 벌레 Caenorhabditis elegans 및 인간과 같은 다양한 유기체에서 진화적으로 보존되어 기본 세포 및 분자 메커니즘의 유사성을 나타냅니다. C. elegans는 노화 중 신경 활동과 품질 관리를 평가하기 위해 잘 특징인 신경계, 신체 투명성 및 유전 및 이미징 기술의 다양한 레퍼토리를 제공하는 고가성 유전 모델입니다. 여기서, 우리는 과활성화 이온 채널 유도 괴사(예를 들어, deg-3(d) 및 mec-4(d)및 단백질 집계(예를 들어, α-syunclein 및 poly-글루타메이트)를 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 세포 및 세포 노화의 세포 분석과 세포 의 세포 적고를 모니터링 및 절제하는 방법을 소개하고 설명합니다. 이러한 동물 신경 변성 모델의 조합, 세포 죽음 변조기에 대 한 유전 및 약리학적 화면과 함께 신경 기능의 나이 관련 고장의 전례 없는 이해로 이어질 것입니다 및 인간의 건강 및 삶의 질에 광범위 한 관련성에 중요 한 통찰력을 제공할 것입니다.

음과 이온 채널에 의해 유도 된 괴사 세포 죽음 여기에 제시된 절차를 이용하여, mec-4(u231) 및 deg-3u662) 돌연변이 배아는 34°C에서 25분 동안 배양되거나 20°C의 표준 온도에서 보관하였다. 부화 시, 신경 세포 시체의 수는 두 그룹의 L1 애벌레 단계에서 결정되었다. 괴사 세포 죽음은 열 충격 전제 조건 계란(그림 1A-1B)에서부화 선충에서 ?...

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Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

여기에서, 우리는 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환의 세포 및 분자 기초를 모니터링하고 해부하기 위해 과활성화 이온 채널 유도 괴사 및 단백질 골재 유도 신경 독성을 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 널리 접근 할 수있는 방법론을 소개하고 설명합니다.

카노르하비티스 예르간에서 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 모델링

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

지난 수십 년 동안 인간의 수명은 생활 수준 개선과 의학의 발전으로 인해 연장됩니다. 나이는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 과 같은 신경 퇴행성 질환을 포함한 많은 생명을 위협하는 질병의 가장 큰 위험 요소입니다. 여기서, 우리는 신경 변성의 세포 분자 메커니즘을 모니터링하고 해부하기 위해 하이퍼 액티브 이온 채널 유도 괴사 및 단백질 응집체를 포함한 일부 다목적 새로운 방법 모델을 활용하여 방법론을 시연한다.4개의 피크 건강 유충은 4를 만들고 해부 스테레오 현미경을 사용하여 E.Coli와 체질, 선충 성장 미디어 플레이트에 3 개의 뉴턴 선충을 합니다. 10및 4개의 선충, 기생 효소 플레이트를 놓고 표준 온도에서 섭씨 20도의 성장하십시오. 5일 후, 1mL와 9 버퍼로 접시를 씻고 1.5mL 튜브로 동물을 수집합니다.30, 000g의 원심분리기는 30초 동안 상체를 제거합니다. 도금 용액0.5mL를 추가합니다. 도금 용액은 실온에 저장됩니다.소용돌이와 모니터링은 모두 용해 될 때까지 주기적으로 모니터링합니다. 5분 이상 도금하지 마십시오. 원심분리기는 10, 000g에서 30초 동안 및 상부체를 제거합니다.1mL과 9개의 버퍼로 팔레트를 두 번 씻으세요. 원심분리기는 10000g에서 30초 동안 상주분리기를 제거합니다. 세척 후, 200 마이크로 리터 M9 버퍼에서 계란을 다시 중단하고 25 분 동안 배양, 수조에서 섭씨 34도에서.20도에서 별도의 계란 그룹을 유지하십시오. 제어 또는 열 충격을 포함하는 파이펫 100 마이크로 리터는 계란을 치료하고 시드되지 않은 10 GN 플레이트에 배치합니다. 각 접시에는 적어도 100~200개의 알이 들어 있습니다.부화 때까지 20섭씨에서 계란을 배양합니다. 1.5ml 튜브에서 접시를 씻고 L1 생명과 선충을 수집하기 위해 M9 버퍼를 사용합니다. 원심 분리기 는 10, 000g에서 30 초 동안.상체를 제거하고 팔레트를 유지합니다. 선충을 마취하기 위해 20 밀리머 M9 레반지 버퍼의 100 마이크로 리터를 추가합니다. L1 시계를 함유하고 2% 아가-ls 스팟에 장착하여 시료 상단에 커버슬립을 부드럽게 장착하는 M9 레반디얼 버퍼의 파이펫 10 마이크로리터.DIC 현미경 을 사용하여 시계를 관찰하십시오. 630 수용체 뉴런의 스캐닝 변성을 스캐닝하여 그 선충의 특징적인 가상 원조 외관을 가진 세포를 계산하여. 선충을 선택하고 15 ~20 L4 유충을 선택하 여 동기화 하 고 먼저 박테리아 C에 변형에 각각의 L4 애벌레 다음 GM 플레이트.선충이 섭씨 20도의 표준 온도에서 자라도록 하십시오. 섭씨 34도에 설정된 인큐베이터로 플레이트를 전송하여 30분 동안 사전 컨디셔닝을 수행합니다. 그런 다음 조건전 선충을 섭씨 20도의 표준 온도에서 다시 반환합니다.10 밀리머 M9 레강 버퍼 드롭의 10 마이크로 리터를 아가-ls 지점의 중앙에 추가합니다. 각각의 형질전환 선충을 선택하고 M9 레강형 낙하로 옮기. 20~30개의 선충을 한 방울당 놓습니다.시료 위에 뚜껑을 부드럽게 놓습니다. 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 습도를 유지하기 위해 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오. 카메라와 결합된 형광 현미경을 사용하여 20 x 배율로 헤드 영역의 연구 이미지를 감지하고 캡처합니다.도파민성 신경 세포 죽음에 대 한 형질 전환선충의 7 일을 모니터링. 살아있는 사람들과 240융합을 표현하는 4일간의 트랜스제닉 동물의 머리 부위에 있는 신경 폴리쿨 골재를 측정한다. 괴사 세포 죽음은 전 열 충격 전제 조건 계란을 가지고 선충에서 가장 주요 인활성 이온 채널을 유도.열 충격 사전 조절, 7 일 된 성인 헤르마로디테에서 알파 시뉴클레인 유도 세포 죽음에 대한 예측을 촉진하고 4 일 된 성인의 머리 영역에서 Q40 단백질 응집체를 감소시킨다. 노화는 세포와 조직 항상성의 점진적 인 변성으로 인한 손상의 결과입니다. 따라서 노화와 관련된 뉴런 분해를 조작하는 것에 대한 이해는 최우선 순위입니다.유전학 및 약리학적 스크린과 결합된 제시된 기술은 잠재적인 치료 관심사를 가진 일반적인 세포 죽음 변조기의 통지로 이끌어 낼 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

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