Name: modeling age-associated neurodegenerative diseases in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-08-15T14:00:00
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Agradecemos a Chaniotakis M. e Kounakis K. pela gravação e edição de vídeo. K.P. é financiado por uma bolsa da Fundação Helênica de Pesquisa e Inovação (HFRI) e da Secretaria Geral de Pesquisa e Tecnologia (GSRT). A N.T. é financiada por subvenções do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC – GA695190 – MANNA), dos Programas-Quadro da Comissão Europeia e do Ministério da Educação grego.

1. Célula necrosada induzida por canais de íons hiperativos
NOTA: Mutações de ganho de função na família genética de degenerinas, incluindo mec-4 e deg-3, entre outras, resultam na geração de canais de íons hiperativos desencadeando a morte celular necrosada de seis neurônios receptores de toque necessários para mecanosensação em vermes3. A necrose induzida pela estimulação aberrante das degenerinas apresenta várias semelhanças mecanic...

<ol>
	<li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).</li><li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+neuronal+necrosis:+rogue+biology.">The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).</li><li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+mechanotransduction:+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).</li><li>Berkowitz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+C.+elegans+dopamine+neuron+degeneration+assay+for+the+validation+of+potential+Parkinson's+disease+genes.">Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model.">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li><li>Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+disruption+of+cellular+protein+folding+in+models+of+polyglutamine+diseases.">Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases.</a> Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li><li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Labbadia, J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+proteostasis+in+aging+and+disease.">The biology of proteostasis in aging and disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).</li><li>Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+dopamine+neuron+degeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).</li><li>Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+protect+from+heat-stroke-associated+neurodegeneration.">Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration.</a> Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).</li><li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat+shock+proteins+and+neurodegeneration:+recent+developments.">Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments.</a> BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).</li><li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans.">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans.">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li><li>Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).</li></ol>

Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis para crescimento, sincronização e exame microscópico de alguns modelos versáteis de C. elegans que investigam a neurodegeneração dependente da idade. Particularmente, avaliamos e dissecamos os fundamentos celulares e moleculares da quebra neuronal relacionada à idade, utilizando necrose hiperativada induzida pelo canal de íons e neurotoxicidade induzida porproteínas 1,,2,<...

Nas últimas duas décadas, C. elegans tem sido amplamente utilizado como um organismo modelo para investigar os mecanismos moleculares da morte celular necrótica. C. elegans oferece um sistema nervoso excepcionalmente bem caracterizado e mapeado, estrutura corporal transparente e um repertório diversificado de métodos genéticos e de imagem para monitorar a função celular in vivo e a sobrevivência ao longo do envelhecimento. Assim, vários modelos genéticos C. elegans de neurodegeneração já foram desenvolvidos para avaliar a viabilidade neuronal. Em particular, os modelos de nematoides bem descritos e utilizados incluem a necrose hiperativa induzida pelo canalde íons 1,,2,3 e morte celular desencadeada pelo aumento da agregação proteica4,,5,,6,,7,,8,,9,,10 e insolação11,,12,entre outros.
A exposição a curto prazo a temperaturas sub-letais conferiu resistência à morte celular necrosada, desencadeada por um estresse térmico subsequente tanto em nematoides quanto em neurônios mamíferos11. Curiosamente, o pré-condicionamento diário de nematoides a uma temperatura elevada leve protege contra a neurodegeneração, que é infligida por diversos estímulos, como desequilíbrio iônico (por exemplo, mec-4(u231) e/ou deg-3(u662)) e agregação de proteínas (por exemplo, α-sinucleína e polyQ40)11,13.
Aqui, descrevemos metodologias versáteis usando C. elegans para monitorar e avaliar a neurodegeneração dependente da idade em modelos bem estabelecidos de doenças humanas, como morte celular desencadeada por excitotoxicidade, Parkinson e doença de Huntington. Além disso, sublinhamos o papel neuroprotetor do pré-condicionamento térmico em vários modelos de neurodegeneração. Uma combinação dessas técnicas em conjunto com telas genéticas e/ou farmacológicas resultará na identificação e caracterização de novos moduladores de morte celular, com potencial interesse terapêutico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>8,40,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dehydrate (CaCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>17101.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deg-3(u662)V or deg-3(d)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC microscope (Nomarsky)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axio Vert A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SMZ645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>EVOS Cell Imaging Systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,37,010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mec-4(u231)X or mec-4(d)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>10 006 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass (18 mm x 18 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>01 010 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office 2011 Excel software package</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth medium (NGM) agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin stock solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,40,41,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical analysis software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Prism software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramisole hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UA44: Is[baIn1; pdat-1&#945;-syn, pdat-1GFP]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling age-associated neurodegenerative diseases in caenorhabditis elegans

Combater patologias neurodegenerativas humanas e gerenciar seu impacto socioeconômico generalizado está se tornando uma prioridade global. Apesar de seus efeitos prejudiciais sobre a qualidade de vida humana e o sistema de saúde, a maioria dos distúrbios neurodegenerativos humanos ainda permanece incurável e inde prevenivel. Portanto, o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas contra tais males está se tornando uma urgência premente. A deterioração dos circuitos e funções neuronais associadas à idade é evolutivamente conservada em organismos tão diversos quanto o humilde verme Caenorhabditis elegans e humanos, significando semelhanças nos mecanismos celulares e moleculares subjacentes. C. elegans é um modelo genético altamente maleável, que oferece um sistema nervoso bem caracterizado, transparência corporal e um repertório diversificado de técnicas genéticas e de imagem para avaliar a atividade neuronal e o controle de qualidade durante o envelhecimento. Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íons hiperativado (por exemplo, deg-3(d) e mec-4(d)) e agregado de proteínas (por exemplo, neurotoxina α-syuncleina e poli-glutamato)-induzidas por neurotoxicidade, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de quebra neuronal relacionada à idade. Uma combinação desses modelos de neurodegeneração animal, juntamente com telas genéticas e farmacológicas para moduladores de morte celular, levará a uma compreensão sem precedentes da discriminação relacionada à idade da função neuronal e fornecerá insights críticos com ampla relevância para a saúde humana e qualidade de vida.

Célula necrosada induzida por canais de íons hiperativos Utilizando os procedimentos aqui apresentados, os embriões mutantes mec-4(u231) e deg-3u662 foram incubados por 25 min a 34 °C ou mantidos na temperatura padrão de 20 °C. Ao eclodir, o número de corpos de células neuronais foi determinado no estágio larval L1 de ambos os grupos. A morte celular necrótica é diminuída em nematoides que eclodiram de ovos pré-condicionados de choque térmico(Figura...

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Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íon hiperativado e neurotoxicidade induzida por proteínas, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de doenças neurodegenerativas associadas à idade.

Modelagem de Doenças Neurodegenerativas Associadas à Idade em Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Ao longo das últimas décadas, a vida humana é ampliada, devido a melhorias nos padrões de vida e avanços na ciência médica. A idade é o maior fator de risco para muitas doenças que ameaçam a vida, incluindo doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson e doença de Huntington. Aqui, demonstramos metodologias utilizando alguns modelos versáteis de novos métodos, incluindo necrose induzida por canais de íons hiperacoervas induzidos e agregados proteicos induzem neurotoxicidade, para monitorar e dissecar o mecanismo molecular celular da degeneração neural.Pico de larvas saudáveis de fazer quatro e fazer três nematoides Newton em placa de mídia de crescimento nematoide, peneirando com E.Coli usando microscópio estéreo dissecando. Coloque dez e quatro nematoides, placa de enzima parasitária e plante-as na temperatura padrão, de 20 graus celsius. Cinco dias depois, lave a placa com 1 mL e 9 tampão e colete os animais em tubo de 1,5mL.Centrifugar a 30.000 g por 30 segundos e remover o supernaspe. Adicione 0,5 mL de solução de revestimento. A solução de revestimento é armazenada à temperatura ambiente.Vórtice e monitore periodicamente até que todos tenham dissolvido. Evite chapeamento por períodos superiores a cinco minutos. Centrifugar a 10.000 g por 30 segundos e remover o supernaspe.Lave duas vezes a paleta com 1 mL e nove tampões. Centrifugar a 10000 g por 30 segundos e remover o supernatante. Após a lavagem, resuspenha os ovos em 200 microliters M9 tampão e incuba-os por 25 minutos, a 34 graus Celsius em um banho de água.Mantenha um grupo separado de ovos a 20 graus Celsius. Pipeta 100 microliters contendo controle ou choque térmico ovos tratados e colocá-los em placa de 10 GN não semeada. Cada prato contém pelo menos 100 a 200 ovos.Incubar os ovos a 20 graus celsius até eclodir. Use e tampão M9 para lavar placas e coletar vida L1 e nematoides em tubo de 1,5 ml. Centrífuga a 10.000 g por 30 segundos.Remova o supernatante e mantenha a paleta. Adicione 100 microliters de 20 mililitros M9 tampão levangial para anestesiar os nematoides. Pipeta 10 microliters de tampão levangial M9, contendo relógio L1 e montá-los em 2%agar-ls spot colocar suavemente um deslizamento de tampa na parte superior da amostra.Observe o relógio usando a microscopia DIC. Escaneando a degeneração dos 630 neurônios receptores contando células com uma aparência virtual característica desse nematode. Sincronizar nematoides selecionando e transferindo 15 a 20 larvas L4 de cada uma em cepa em primeira célula C e depois placas GM.Incubar e deixar os nematoides crescerem à temperatura padrão de 20 graus Celsius. Realize o pré-condicionamento diário por 30 minutos transferindo as placas em uma incubadora fixada a 34 graus Celsius. Em seguida, devolva os nematoides pré-condicionados de volta à temperatura padrão de 20 graus Celsius.Adicione 10 microliters de 20 mililitros M9 gota de tampão levangial no centro do ponto ágar-ls. Escolha os respectivos nematoides transgênicos e transfira-os em gota levangial M9. Coloque de 20 a 30 nematoides por gota.Coloque suavemente o deslizamento de cobertura na parte superior da amostra. Sele o deslizamento da tampa com esmalte para preservar a umidade durante todo o processo de imagem. Usando um microscópio de fluorescência combinado com uma câmera, detecte e capture imagens de seu estudo da região da cabeça em 20 x ampliação.Monitore sete dias de nematoides transgênicos para morte celular neuronal dopaminérgica. Medir os agregados neuronais do policul na região principal de quatro dias de animais transgênicos que expressam 240 fusão com pessoas vivas. A morte celular necrótica induzida por canais de íons hiperativos é a principal em nematoides que tem antigos ovos pré-condição de choque térmico.Pré-condicionamento de choque térmico, promovendo uma previsão contra a morte celular induzida por alfa-sinucleína em hermafrodita adulta de sete dias de idade e diminui os agregados de proteína q40 na região principal de quatro idosos. O envelhecimento é consequência dos danos causados pela degeneração gradual da homeostase celular e tecidual. Assim, a compreensão da manipulação da quebra neuronal relacionada à idade são prioridades dos primeiros lugares.As técnicas apresentadas combinadas com genética e telas farmacológicas poderiam levar a uma notificação de moduladores normais de morte celular com potencial interesse terapêutico.

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