Name: assessment of de novo protein synthesis rates in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-09-12T13:00:00
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Nous remercions Chaniotakis M. et Kounakis K. pour l’enregistrement vidéo et le montage. K.P. est financé par une subvention de la Fondation hellénique pour la recherche et l’innovation (HFRI) et du Secrétariat général de la recherche et de la technologie (GSRT). N.T. est financé par des subventions du Conseil européen de la recherche (ERC – GA695190 – MANNA), des programmes-cadres de la Commission européenne et du ministère grec de l’Éducation.

REMARQUE : Les fusions transcriptionnelles et translationnelles aux fluorophores peuvent être utilisées pour évaluer la traduction de protéines de novo dans plusieurs tissus. Les taux de synthèse des protéines peuvent être évalués pour plusieurs familles de protéines qui ont été localisées dans différents compartiments cellulaires, y compris le cytoplasme, les mitochondries et le noyau7. Les souches suivantes sont utilisées pour surveiller les taux globaux et de synthèse des proté...

<ol>
	<li>Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E+function+in+somatic+cells+modulates+ageing+in+Caenorhabditis+elegans.">eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).</li><li>Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+as+an+integral+quality+control+mechanism+during+ageing.">Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing.</a> Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).</li><li>Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+absolute+protein+synthesis+rates+reveals+principles+underlying+allocation+of+cellular+resources.">Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources.</a> Cell. 157 (3), 624-635 (2014).</li><li>Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+monitoring+and+measurement+of+protein+translation+in+time+and+space.">Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space.</a> Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growing+Toolbox+for+Protein+Synthesis+Studies.">The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+monitoring+of+protein+synthesis+in+vivo.">Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).</li><li>Parker, R., Sheth, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+bodies+and+the+control+of+mRNA+translation+and+degradation.">P bodies and the control of mRNA translation and degradation.</a> Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).</li><li>Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+Proteostasis+by+P+Body-Mediated+Regulation+of+eIF4E+Availability+during+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).</li><li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fixed+to+FRAP:+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells.">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).</li><li>Keith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graded+Proteasome+Dysfunction+in+Caenorhabditis+elegans+Activates+an+Adaptive+Response+Involving+the+Conserved+SKN-1+and+ELT-2+Transcription+Factors+and+the+Autophagy-Lysosome+Pathway.">Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).</li><li>Kumsta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+receptor+p62/SQST-1+promotes+proteostasis+and+longevity+in+C.+elegans+by+inducing+autophagy.">The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy.</a> Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).</li><li>Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+degradation+in+disease.">Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease.</a> Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).</li></ol>

La modulation de synthèse protéique est essentielle à l’homéostasie organisationnelle. Pendant le vieillissement, la synthèse globale ainsi que spécifique des protéines est perturbée. Des études récentes révèlent que l’équilibre de traduction de protéine contrôle directement la sénescence et le vieillissement n’est pas simplement un sous-produit du processus de vieillissement. En particulier, les composants de base des machines de traduction tels que le facteur d’initiation eucaryote 4E (eIF4E), q...

La synthèse et la dégradation des protéines sont essentielles à l’homéostasie organisationnelle. Une multitude de maladies liées à l’âge sont provoquées par la production de protéinesdéfectueuses 1,2. Afin de mesurer les taux mondiaux de traduction des protéines, il existe des techniques biochimiques telles que le profilage ribosomal, qui implique le séquençage profond des fragments d’ARNm protégés par le ribosome pour surveiller l’expression ainsi que la synthèse des protéinesnouvelles 3. Cette méthode, en plus d’être une lecture indirecte des taux de traduction, comme l’association accrue de l’ARN aux ribosomes ne signifie pas nécessairement une traduction accrue, a des inconvénients techniques, tels que le coût élevé et une exigence d’une grande quantité de matériel de départ. D’autre part, les méthodes à base de protéomique permettent une quantification directe des protéines par le profilage métabolique des impulsions suivie d’une analyse de spectrométrie de masse4,5. Cependant, il s’agit d’une approche semi-quantitative avec une résolution temporelle limitée qui ne peut pas être facilement utilisée in vivo. En outre, l’étiquetage de la protéine peut être inégalement réparti dans l’animal/tissu d’intérêt. Fait important, ces deux méthodes peuvent dissimuler des variations spécifiques aux tissus ou des cellules dans les taux de traduction des protéines chez des animaux entiers ou des tissus, respectivement.
Caenorhabditis elegans est un organisme modèle facile à utiliser qui peut être cultivé en grand nombre6. En outre, son agrément génétique et sa transparence permettent l’imagerie vivante in vivo. Ce protocole décrit la méthodologie pour détecter les taux de synthèse des protéines à l’aide de la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Nous profitons de l’expression transgénique des protéines fluorescentes, soit dans l’organisme entier, soit dans des tissus/cellules spécifiques. Les animaux transgéniques peuvent soit exprimer le GFP en utilisant le promoteur d’un gène, qui est largement/globalement exprimé ou un promoteur spécifique aux tissus pour cibler des types de cellules spécifiques. Cette technique peut être étendue à un promoteur spécifique pour examiner les taux de synthèse des protéines d’une protéine spécifique.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>8,40,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose pads 2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dehydrate (CaCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>17101.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SMZ645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axio Imager Z2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Lumar V12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,37,010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB liquid medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>10 006 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office 2011 Excel software package</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth medium (NGM) agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin stock solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,40,41,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical analysis software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Prism software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of de novo protein synthesis rates in caenorhabditis elegans

Le maintien d’un protéome sain est essentiel pour l’homéostasie cellulaire et organisationnelle. La perturbation de l’équilibre entre le contrôle translationnel des protéines et la dégradation provoque une multitude de maladies liées à l’âge. Le déclin des mécanismes de contrôle de la qualité de la protéostase est une caractéristique du vieillissement. Les méthodes biochimiques de détection de la synthèse des protéines de novo sont encore limitées, présentent plusieurs inconvénients et ne peuvent pas être effectuées dans des cellules vivantes ou des animaux. Caenorhabditis elegans, transparent et facilement génétiquement modifié, est un excellent modèle pour surveiller les taux de synthèse des protéines en utilisant des techniques d’imagerie. Ici, nous introduisons et décrivons une méthode pour mesurer la synthèse de la protéine de novo in vivo en utilisant la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Les animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des cellules ou des tissus spécifiques sont irradiés par une source lumineuse puissante ayant pour résultat le photobleachage de fluorescence. À son tour, l’évaluation de la récupération de fluorescence signifie une nouvelle synthèse des protéines dans les cellules et/ou les tissus d’intérêt. Par conséquent, la combinaison de nématodes transgéniques, d’interventions génétiques et/ou pharmacologiques ainsi que d’imagerie vivante des taux de synthèse des protéines peut faire la lumière sur les mécanismes de médiation de l’effondrement de la protéostase dépendante de l’âge.

À l’aide de la procédure présentée ici, des nématodes transgéniques sauvages et mutants exprimant les reporters somatiques suivants, pife-2GFP, psod-3GFP et punc-119GFP, ont été utilisés pour évaluer les taux de synthèse des protéines selon les protocoles respectifs. En particulier, les vers mutants de type sauvage et d’ife-2 exprimant le GFP cytoplasmique dans leurs tissus somatiques en utilisant ...

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Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Ici, nous introduisons et décrivons une méthode non radioactive et non invasive pour évaluer la synthèse de la protéine de novo in vivo, en utilisant le nématode Caenorhabditis elegans et la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Cette méthode peut être combinée avec des écrans génétiques et/ou pharmacologiques pour identifier de nouveaux modulateurs de synthèse protéique.

Évaluation des taux de synthèse des protéines de novo à Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

Le taux de synthèse des protéines est perturbé pendant la maladie et le vieillissement. La récupération de fluorescence après photobleaching, ou FRAP, permet la mesure du taux de synthèse de protéine in vivo. Nous utilisons des vers C.elegans transparents, qui expriment gfp, comme un modèle pour surveiller la synthèse de protéines nouvelles après photobleaching.Nous fournissons des lignes directrices pratiques pour mesurer la récupération de la fluorescence en utilisant des vers transgéniques, qui expriment GFP sous différents promoteurs, soit largement exprimés ou dans des cellules ou des tissus spécifiques. En outre, cette méthode offre une surveillance de la vitesse de synthèse des protéines en temps réel. Utilisez un stéréomicroscope disséquant pour évaluer les stades de développement et la croissance des nématodes transgéniques de type sauvage et mutant.Choisissez 10 larves L4 d’animaux transgéniques sauvages et mutants transportant le reporter fluorescent désiré sur des plaques de croissance des nématodes ensemencées avec E.coli. Incuber et cultiver les nématodes à la température standard de 20 degrés Celsius. Quatre jours plus tard, la plaque contient une population mixte de vers transgéniques.Sélectionnez et transférez 15 larves L4 de chaque souche sur des plaques OP50 NGM fraîchement ensemencées. Effectuez l’analyse FRAP et surveillez le taux de synthèse des protéines le premier jour de l’âge adulte. Le lendemain, préparez et utilisez des plaques NGM contenant du cycloheximide comme contrôle positif.Tuer les bactéries en exposant les plaques NGM ensemencées pendant 15 minutes avec la lumière UV. Ajouter le cycloheximide sur le dessus des plaques bactériennes ensemencées trop 500 microgrammes par mL de concentration finale dans le volume de l’agar. Laisser sécher les assiettes.Transférer les nématodes transgéniques exprimant le GFP sur les plaques contenant des véhicules et des cycloheximides. Incuber les animaux pendant deux heures à la température normale de 20 degrés Celsius. Cueillez et transférez des animaux transgéniques adultes d’une journée dans des plaques NGM individuelles ensemencées avec une baisse op50 de 20 microlitres au centre.Retirez le couvercle et placez chaque plaque sous une lentille objective de 20 H d’un microscope épifluorescent. Concentrez-vous et capturez une image de référence avant de la photobleaching. Photobleach chaque échantillon pendant 10 minutes.Capturez une image après le photobleaching. Gardez les animaux dans des plaques NGM individuelles et laissez-les récupérer. Image et enregistrer la récupération de chaque journaliste fluorescent toutes les une heure pendant au moins six heures à un stéréomicroscope épifluorescent.Préparer 2% coussinets agarose, et ajouter 10 microlitres goutte de tampon M9 au centre de la garniture agarose. Transférer cinq nématodes transgéniques exprimant le GFP cytoplasmique pan-neuronal dans une goutte de tampon M9. Utilisez un cil pour répandre le liquide.Les animaux affichent des mouvements réduits en moins de deux minutes en raison de l’absorption de M9 dans l’agar. Modifiez la position du nématode à l’aide d’un pic de cils. Placez l’échantillon à la lentille objective de 40 H d’un microscope épifluorescent sans utiliser de glissement de couvercle.Concentrez-vous et capturez une image de référence. Photobleach une zone d’intérêt ciblée pendant 90 secondes. Capturez une image après le photobleaching.Ajoutez une goutte de 10 microlitres de tampon M9 sur les nématodes photobleached. Laissez les animaux récupérer pendant cinq minutes. Utilisez le pic de cils ou une pipette pour transférer les nématodes à des plaques NGM individuelles ensemencées avec 20 microlitres OP50 goutte dans le centre.Capturez une image de chaque échantillon toutes les une heures sous un stéréomicroscope épifluorescent. Les vers mutants de type sauvage et fe-2 exprimant le GFP cytoplasmique dans tous leurs tissus somatiques en utilisant le promoteur fe-2 ont été comparés avant, immédiatement après photobleaching, et cinq heures après rétablissement. Animaux de type sauvage entièrement récupérés tandis que les mutants fe-2 avaient la capacité de récupération minis.Ainsi, les vers de type sauvage initient la synthèse normale des protéines après photobleaching, tandis que les vers dépourvus de facteur d’initiation à l’ARNm fe-2 sont incapables de le faire, ce qui indique que le taux de récupération fluorescente illustre le taux de synthèse des protéines in vivo. Cycloheximide, un inhibiteur spécifique de la traduction de l’ARNm peut être utilisé comme un contrôle positif pour l’inhibition de la traduction des protéines. En effet, les animaux transgéniques traités au cycloheximide exprimant le GFP cytoplasmique sous le promoteur ne récupèrent pas leur fluorescence lors du photobleaching.les organismes de traitement de l’ARNm influent sur le taux de traduction des protéines. Des nématodes mutants de type sauvage et edc-3 exprimant gfp pan-neuronally ont été examinés pour leur capacité de rétablissement sur le photobleaching ciblé à la région de tête. La récupération fluorescente est beaucoup plus lente chez les animaux déficients en edc-3 que chez les vers de type sauvage.La modulation de synthèse des protéines est essentielle pour l’homéostasie de l’organisme. Pendant le vieillissement, la synthèse globale et spécifique des protéines est perturbée. L’équilibre de traduction des protéines contrôle directement la sénescence et le vieillissement.Plus précisément, les composants de base des machines de traduction ainsi que les composants d’interaction P-body accélèrent le processus de vieillissement. La perturbation de l’initiation à la traduction ralentit le vieillissement. Par conséquent, la mesure des taux mondiaux de synthèse des protéines par FRAP est une lecture directe du processus de vieillissement.

Research

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Biology

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embryos, the genetic ...

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De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

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