Name: assessment of de novo protein synthesis rates in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-09-12T13:00:00
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हम वीडियो रिकॉर्डिंग और संपादन के लिए Chaniotakis एम और Kounakis कश्मीर का शुक्रिया अदा करते हैं । केपी को हेलेनिक फाउंडेशन फॉर रिसर्च एंड इनोवेशन (एचएफआरआई) और जनरल सेक्रेटेरिएट फॉर रिसर्च एंड टेक्नोलॉजी (जीएसआरटी) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया जाता है । एनटी को यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी - GA695190 - मन्ना), यूरोपीय आयोग फ्रेमवर्क कार्यक्रम और यूनानी शिक्षा मंत्रालय से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

नोट: फ्लोरोफोरस के ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल फ्यूजन दोनों का उपयोग कई ऊतकों में डी नोवो प्रोटीन अनुवाद का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटीन संश्लेषण दरों का आकलन कई प्रोटीन परिवारो...

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	<li>Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E+function+in+somatic+cells+modulates+ageing+in+Caenorhabditis+elegans.">eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).</li><li>Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+as+an+integral+quality+control+mechanism+during+ageing.">Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing.</a> Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).</li><li>Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+absolute+protein+synthesis+rates+reveals+principles+underlying+allocation+of+cellular+resources.">Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources.</a> Cell. 157 (3), 624-635 (2014).</li><li>Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+monitoring+and+measurement+of+protein+translation+in+time+and+space.">Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space.</a> Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. 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K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+monitoring+of+protein+synthesis+in+vivo.">Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).</li><li>Parker, R., Sheth, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+bodies+and+the+control+of+mRNA+translation+and+degradation.">P bodies and the control of mRNA translation and degradation.</a> Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).</li><li>Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+Proteostasis+by+P+Body-Mediated+Regulation+of+eIF4E+Availability+during+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).</li><li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fixed+to+FRAP:+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells.">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).</li><li>Keith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graded+Proteasome+Dysfunction+in+Caenorhabditis+elegans+Activates+an+Adaptive+Response+Involving+the+Conserved+SKN-1+and+ELT-2+Transcription+Factors+and+the+Autophagy-Lysosome+Pathway.">Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).</li><li>Kumsta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+receptor+p62/SQST-1+promotes+proteostasis+and+longevity+in+C.+elegans+by+inducing+autophagy.">The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy.</a> Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).</li><li>Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+degradation+in+disease.">Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease.</a> Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).</li></ol>

प्रोटीन संश्लेषण मॉड्यूलेशन ऑर्गेनिमल होरोस्टेसिस के लिए जरूरी है। बुढ़ापे के दौरान, वैश्विक और विशिष्ट प्रोटीन संश्लेषण बेफिक्र होता है। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि प्रोटीन अनुवाद संतुलन सी?...

प्रोटीन संश्लेषण और गिरावट ऑर्गेनिमल होरोस्टेसिस के लिए जरूरी है। उम्र से संबंधित कई बीमारियों को दोषपूर्ण प्रोटीन उत्पादन 1,2से भड़कायाजाताहै । वैश्विक प्रोटीन अनुवाद दरों को मापने के लिए, रिबोसोमल प्रोफाइलिंग जैसी जैव रासायनिक तकनीकें हैं, जिसमें अभिव्यक्ति के साथ-साथ उपन्यास प्रोटीन संश्लेषण3की निगरानी के लिए राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए टुकड़ों का गहरा अनुक्रमण शामिल है। इस विधि, अनुवाद दरों का एक अप्रत्यक्ष readout होने के अलावा, के रूप में राइबोसोम्स के लिए वृद्धि हुई आरएनए एसोसिएशन जरूरी अनुवाद में वृद्धि का मतलब यह नहीं है, इस तरह के उच्च लागत और शुरू सामग्री की एक बड़ी राशि की आवश्यकता के रूप में तकनीकी नुकसान है । दूसरी ओर, प्रोटेओमिक्स आधारित विधियां पल्स मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग द्वारा प्रत्यक्ष प्रोटीन क्वांटिफिकेशन की अनुमति देती हैं जिसके बाद मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण4,,5। हालांकि, यह सीमित लौकिक संकल्प के साथ एक अर्ध-मात्रात्मक दृष्टिकोण है जिसका उपयोग वीवो में आसानी से नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटीन की लेबलिंग को ब्याज के पशु/ऊतक में असमान रूप से वितरित किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि इन दोनों तरीकों से क्रमशः पूरे जानवरों या ऊतकों में प्रोटीन अनुवाद दरों में ऊतक-विशिष्ट या सेल-विशिष्ट विविधताओं को छुपाया जा सकता है।
कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एक आसान-से-उपयोग मॉडल जीव है जिसे बड़ी संख्या में6में उगाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इसकी आनुवंशिक योग्यता और पारदर्शिता वीवो में लाइव इमेजिंग के लिए अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल फोटोब्लैचिंग (एफआरएपी) के बाद फ्लोरेसेंस रिकवरी का उपयोग करके प्रोटीन संश्लेषण दरों का पता लगाने की पद्धति का वर्णन करता है। हम फ्लोरोसेंट प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति का लाभ उठाते हैं, या तो पूरे जीव में या विशिष्ट ऊतकों/कोशिकाओं में । ट्रांसजेनिक जानवर या तो जीन के प्रमोटर का उपयोग करके GFP व्यक्त कर सकते हैं, जो व्यापक रूप से/विश्व स्तर पर व्यक्त किया गया है या विशिष्ट कोशिका प्रकारों को लक्षित करने के लिए ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर है । इस तकनीक को एक विशिष्ट प्रोटीन की प्रोटीन संश्लेषण दरों की जांच करने के लिए एक विशिष्ट प्रमोटर तक बढ़ाया जा सकता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>8,40,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose pads 2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dehydrate (CaCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>17101.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SMZ645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axio Imager Z2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Lumar V12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,37,010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB liquid medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>10 006 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office 2011 Excel software package</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth medium (NGM) agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin stock solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,40,41,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical analysis software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Prism software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of de novo protein synthesis rates in caenorhabditis elegans

सेल और ऑर्गेनिमल होमोस्टेसिस के लिए हेल्दी प्रोटेम बनाए रखना जरूरी है। प्रोटीन ट्रांसलेशनल कंट्रोल और गिरावट के बीच संतुलन का क्षुभव उम्र से संबंधित बीमारियों की एक भीड़ को भड़काता है। प्रोटेओस्टेसिस गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र की गिरावट वृद्धावस्था की एक बानगी है। डी नोवो प्रोटीन संश्लेषण का पता लगाने के लिए जैव रासायनिक तरीके अभी भी सीमित हैं, कई नुकसान हैं और जीवित कोशिकाओं या जानवरों में नहीं किया जा सकता है। कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस, पारदर्शी और आसानी से आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा रहा है, इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके प्रोटीन संश्लेषण दरों की निगरानी करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। यहां, हम फोटोब्लेचिंग (एफआरएपी) के बाद फ्लोरेसेंस रिकवरी का उपयोग करते हुए वीवो में डी नोवो प्रोटीन संश्लेषण को मापने के लिए एक विधि पेश और वर्णन करते हैं। विशिष्ट कोशिकाओं या ऊतकों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक जानवरों को एक शक्तिशाली प्रकाश स्रोत द्वारा विकिरणित किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरेसेंस फोटोब्लेचिंग होती है। बदले में, फ्लोरेसेंस वसूली का आकलन कोशिकाओं और/या ब्याज के ऊतकों में नए प्रोटीन संश्लेषण का प्रतीक है । इसलिए, ट्रांसजेनिक नेमाटोड, आनुवंशिक और/या औषधीय हस्तक्षेपों का संयोजन प्रोटीन संश्लेषण दरों की लाइव इमेजिंग के साथ उम्र पर निर्भर प्रोटेओस्टेसिस पतन मध्यस्थता तंत्र पर प्रकाश डाला जा सकता है ।

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ट्रांसजेनिक सूत्रकृमि निम्नलिखित दैहिक संवाददाताओं, पीife-22GFP, पीसोड-3जीएफपी और पीयूएनसी-119जीएफप?...

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Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

यहां, हम वीवो में डी नोवो प्रोटीन संश्लेषण का आकलन करने के लिए एक गैर-रेड्रियक और गैर-सांप्रदायिक विधि का परिचय और वर्णन करते हैं, फोटोब्लाचिंग (एफआरएपी) के बाद नेमाटोड कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस और फ्लोरेसेंस रिकवरी का उपयोग करते हैं। इस विधि को प्रोटीन संश्लेषण के उपन्यास मॉड्यूलर की पहचान करने के लिए आनुवंशिक और/या औषधीय स्क्रीन के साथ जोड़ा जा सकता है ।

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में डी नोवो प्रोटीन संश्लेषण दरों का आकलन

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

प्रोटीन संश्लेषण की दर रोग और उम्र बढ़ने के दौरान बेफिक्र होती है। फोटोब्लैचिंग, या एफआरएपी के बाद फ्लोरेसेंस रिकवरी, वीवो में प्रोटीन संश्लेषण की दर की माप की अनुमति देती है। हम फोटोब्लैचिंग के बाद उपन्यास प्रोटीन संश्लेषण की निगरानी के लिए एक मॉडल के रूप में पारदर्शी सी एलिगेंस कीड़े का उपयोग करते हैं, जो जीएफपी को व्यक्त करते हैं।हम ट्रांसजेनिक कीड़े का उपयोग करके फ्लोरेसेंस रिकवरी को मापने के लिए व्यावहारिक दिशानिर्देश प्रदान करते हैं, जो विभिन्न प्रमोटरों के तहत जीएफपी को व्यक्त करते हैं, या तो व्यापक रूप से व्यक्त किए जाते हैं या विशिष्ट कोशिकाओं या ऊतकों में। इसके अलावा, यह विधि वास्तविक समय में प्रोटीन संश्लेषण गति निगरानी प्रदान करती है। जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ट्रांसजेनिक सूत्रकृमि के विकास के चरणों और विकास का आकलन करने के लिए एक विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें।जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ट्रांसजेनिक जानवरों के 10 L4 लार्वा उठाओ नेमाटोड विकास मीडिया ई कोलाई के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटों पर वांछित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ले जाने । 20 डिग्री सेल्सियस के मानक तापमान पर नेमाटोड को बढ़ाएं और बढ़ाएं। चार दिन बाद, प्लेट में ट्रांसजेनिक कीड़े की मिश्रित आबादी होती है।ताजा वरीयता प्राप्त OP50 NGM प्लेटों पर प्रत्येक तनाव के 15 L4 लार्वा का चयन करें और स्थानांतरण करें। FRAP परख प्रदर्शन, और वयस्कता के दिन एक पर प्रोटीन संश्लेषण दर की निगरानी । अगले दिन, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में साइक्लोहेक्सिमाइड युक्त एनजीएम प्लेटों को तैयार करें और उपयोग करें।यूवी लाइट के साथ 15 मिनट के लिए वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों को उजागर करके बैक्टीरिया को मारें। आगर की मात्रा में बैक्टीरियल-वरीयता प्राप्त प्लेटों के शीर्ष पर साइक्लोहेक्सिमाइड को भी 500 माइक्रोग्राम प्रति एमएल अंतिम एकाग्रता जोड़ें। प्लेटों को सूखने दें।वाहन और साइक्लोहेक्सीमाइड युक्त प्लेटों पर जीएफपी व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक नेमाटोड स्थानांतरित करें। 20 डिग्री सेल्सियस के मानक तापमान पर दो घंटे के लिए जानवरों को इनक्यूबेट। केंद्र में 20 माइक्रोलीटर OP50 ड्रॉप के साथ वरीयता प्राप्त व्यक्तिगत एनजीएम प्लेटों में एक दिन के वयस्क ट्रांसजेनिक जानवरों को चुनें और स्थानांतरित करें।ढक्कन निकालें और एक epifluorescent माइक्रोस्कोप के एक 20H उद्देश्य लेंस के तहत प्रत्येक थाली जगह है । फोटोब्लैचिंग से पहले फोकस करें और एक संदर्भ छवि कैप्चर करें। 10 मिनट के लिए प्रत्येक नमूना फोटोब्लैच।फोटोब्लैचिंग के बाद किसी इमेज को कैप्चर करें। जानवरों को अलग-अलग एनजीएम प्लेटों में रखें, और उन्हें ठीक होने दें। छवि और एक epifluorescent स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर कम से कम छह घंटे के लिए हर एक घंटे में प्रत्येक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की वसूली रिकॉर्ड।2% एगर उठे पैड तैयार करें, और एग्राजिंग पैड के केंद्र में एम 9 बफर के 10 माइक्रोलीटर ड्रॉप जोड़ें। पैन-न्यूरोनल साइटोप्लाज्मिक जीएफपी को एम9 बफर की एक बूंद में व्यक्त करते हुए पांच ट्रांसजेनिक नेमाटोड स्थानांतरित करें। तरल फैलाने के लिए बरौनी का प्रयोग करें।जानवर आगर में M9 अवशोषण के कारण दो मिनट के भीतर कम आंदोलनों को प्रदर्शित करते हैं । एक बरौनी लेने का उपयोग करके निमाटोड की स्थिति बदलें। एक कवर पर्ची का उपयोग किए बिना एक epifluorescent माइक्रोस्कोप के 40H उद्देश्य लेंस पर नमूना रखें ।ध्यान केंद्रित करें और एक संदर्भ छवि पर कब्जा करें। फोटोब्लाच 90 सेकंड के लिए ब्याज का एक लक्षित क्षेत्र। फोटोब्लैचिंग के बाद किसी इमेज को कैप्चर करें।फोटोब्लैच्ड नेमाटोड पर एम9 बफर की 10 माइक्रोलीटर ड्रॉप जोड़ें। जानवरों को पांच मिनट तक ठीक होने दें। केंद्र में 20 माइक्रोलीटर OP50 ड्रॉप के साथ वरीयता प्राप्त व्यक्तिगत एनजीएम प्लेटों में निमाटोड स्थानांतरित करने के लिए बरौनी पिक या एक पिपेट का उपयोग करें।एक एपिफ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत हर एक घंटे में प्रत्येक नमूने की एक छवि कैप्चर करें। वाइल्ड-टाइप और फे-2 उत्परिवर्ती कीड़े फे-2 प्रमोटर का उपयोग करके अपने दैहिक ऊतकों में साइटोप्लाज्मिक जीएफपी व्यक्त करने से पहले की तुलना की गई थी, तुरंत फोटोब्लैचिंग के बाद, और पांच घंटे के बाद वसूली । जंगली प्रकार के जानवरों को पूरी तरह से बरामद किया, जबकि fe-2 म्यूटेंट मिनी वसूली क्षमता थी ।इस प्रकार जंगली प्रकार के कीड़े फोटोब्लैचिंग के बाद सामान्य प्रोटीन संश्लेषण शुरू करते हैं, जबकि एमआरएनए अनुवाद दीक्षा कारक फे-2 की कमी वाले कीड़े ऐसा करने में असमर्थ हैं, यह दर्शाता है कि फ्लोरोसेंट रिकवरी की दर वीवो में प्रोटीन संश्लेषण की दर को दर्शाती है। साइक्लोहेक्सीमाइड, एमआरएनए अनुवाद का एक विशिष्ट अवरोधक प्रोटीन अनुवाद अवरोध के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। दरअसल, प्रमोटर के तहत साइटोप्लाज्मिक जीएफपी व्यक्त करने वाले साइक्लोहेक्सीमाइड-उपचारित ट्रांसजेनिक जानवर फोटोब्लैचिंग पर अपनी फ्लोरेसेंस को ठीक नहीं करते हैं।एमआरएनए प्रसंस्करण निकाय प्रोटीन अनुवाद की दर को प्रभावित करते हैं। जीएफपी पैन-न्यूरोनली व्यक्त करने वाले जंगली-प्रकार और ईडीसी-3 उत्परिवर्ती सूत्रकृमि की जांच की गई थी, जो सिर क्षेत्र में लक्षित फोटोब्लैचिंग पर उनकी वसूली क्षमता के लिए जांच की गई थी । फ्लोरोसेंट रिकवरी जंगली प्रकार के कीड़े की तुलना में ईडीसी-3-कमी वाले जानवरों में बहुत धीमी है।प्रोटीन संश्लेषण मॉड्यूलेशन ऑर्गेनिमल होरोस्टेसिस के लिए जरूरी है। उम्र बढ़ने के दौरान, वैश्विक और विशिष्ट प्रोटीन संश्लेषण बेफिक्र होता है। प्रोटीन अनुवाद संतुलन सीधे सेनेसेंस और उम्र बढ़ने को नियंत्रित करता है।विशेष रूप से, अनुवाद मशीनरी के मुख्य घटकों के साथ-साथ पी-बॉडी इंटरैक्टिंग घटक उम्र बढ़ने की प्रक्रिया में तेजी लाते हैं। अनुवाद दीक्षा का क्षोभ उम्र बढ़ने में गिरावट। इसलिए, एफआरएपी द्वारा वैश्विक प्रोटीन संश्लेषण दरों को मापना उम्र बढ़ने की प्रक्रिया का सीधा रीडआउट है।

Research

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Biology

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Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

प्रोटीन की रायः के लिए एक कार्यक्षेत्र<em&gt; सिलिको में</em&gt;<em&gt; डी नोवो</emBiomolecules के&gt; डिजाइन

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में आयु के साथ अंतर्निहित प्रोटीन एकत्रीकरण में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए विधियाँ

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

De नोवो याप/TAZ द्वारा दैहिक स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन टैगिंग और 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole धुंधला Caenorhabditis एलिगेंस में द्वारा प्रोटीन उपसेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने