Name: assessment of de novo protein synthesis rates in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-09-12T13:00:00
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Agradecemos a Chaniotakis M. e Kounakis K. pela gravação e edição de vídeo. K.P. é financiado por uma bolsa da Fundação Helênica de Pesquisa e Inovação (HFRI) e da Secretaria Geral de Pesquisa e Tecnologia (GSRT). A N.T. é financiada por subvenções do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC – GA695190 – MANNA), dos Programas-Quadro da Comissão Europeia e do Ministério da Educação grego.

NOTA: Tanto as fusões transcricionais quanto as translacionais aos fluoroforos podem ser usadas para avaliar a tradução de nova proteína em vários tecidos. As taxas de síntese proteica podem ser avaliadas para múltiplas famílias de proteínas localizadas em diferentes compartimentos celulares, incluindo citoplasma, mitocôndrias e núcleo7. As seguintes cepas são usadas para monitorar as taxas globais e neuronais de síntese de proteínas, N2; Ex[pife-2GFP, pR...

<ol>
	<li>Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E+function+in+somatic+cells+modulates+ageing+in+Caenorhabditis+elegans.">eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).</li><li>Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+as+an+integral+quality+control+mechanism+during+ageing.">Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing.</a> Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).</li><li>Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+absolute+protein+synthesis+rates+reveals+principles+underlying+allocation+of+cellular+resources.">Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources.</a> Cell. 157 (3), 624-635 (2014).</li><li>Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+monitoring+and+measurement+of+protein+translation+in+time+and+space.">Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space.</a> Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growing+Toolbox+for+Protein+Synthesis+Studies.">The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+monitoring+of+protein+synthesis+in+vivo.">Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).</li><li>Parker, R., Sheth, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+bodies+and+the+control+of+mRNA+translation+and+degradation.">P bodies and the control of mRNA translation and degradation.</a> Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).</li><li>Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+Proteostasis+by+P+Body-Mediated+Regulation+of+eIF4E+Availability+during+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).</li><li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fixed+to+FRAP:+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells.">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).</li><li>Keith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graded+Proteasome+Dysfunction+in+Caenorhabditis+elegans+Activates+an+Adaptive+Response+Involving+the+Conserved+SKN-1+and+ELT-2+Transcription+Factors+and+the+Autophagy-Lysosome+Pathway.">Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).</li><li>Kumsta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+receptor+p62/SQST-1+promotes+proteostasis+and+longevity+in+C.+elegans+by+inducing+autophagy.">The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy.</a> Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).</li><li>Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+degradation+in+disease.">Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease.</a> Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).</li></ol>

A modulação da síntese proteica é essencial para a homeostase do organismo. Durante o envelhecimento, a síntese de proteínas globais e específicas é perturbada. Estudos recentes revelam que o equilíbrio da tradução proteica controla diretamente a senescência e o envelhecimento não é meramente um subproduto do processo de envelhecimento. Em particular, componentes centrais da máquina de tradução, como o fator de iniciação eucariótica 4E (eIF4E), que facilita o capping de mRNA durante a iniciação da t...

A síntese e a degradação da proteína são essenciais para a homeostase do organismo. Uma infinidade de doenças relacionadas à idade são instigadas pela produção de proteína defeituosa1,,2. Para medir as taxas globais de tradução de proteínas, existem técnicas bioquímicas, como o perfil ribossômico, que envolve sequenciamento profundo de fragmentos de mRNA protegidos por ribossomos para monitorar a expressão, bem como a nova síntese proteica3. Este método, além de ser uma leitura indireta das taxas translacionais, uma vez que o aumento da associação do RNA aos ribossomos não significa necessariamente aumento da tradução, tem desvantagens técnicas, como alto custo e exigência de uma grande quantidade de material inicial. Por outro lado, os métodos baseados em proteômica permitem quantificação direta da proteína por perfil metabólico de pulso seguido de análise de espectrometria de massa4,,5. No entanto, trata-se de uma abordagem semi-quantitativa com resolução temporal limitada que não pode ser facilmente utilizada in vivo. Além disso, a rotulagem da proteína pode ser desigualmente distribuída no animal/tecido de interesse. É importante ressaltar que ambos os métodos podem ocultar variações específicas de tecidos ou células nas taxas de tradução de proteínas em animais ou tecidos inteiros, respectivamente.
Caenorhabditis elegans é um organismo modelo fácil de usar que pode ser cultivado em grande número6. Além disso, sua comodidade genética e transparência permitem imagens ao vivo in vivo. Este protocolo descreve a metodologia para detectar taxas de síntese proteica usando recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP). Aproveitamos a expressão transgênica de proteínas fluorescentes, seja em todo o organismo ou em tecidos/células específicas. Animais transgênicos podem expressar GFP usando o promotor de um gene, que é amplamente/globalmente expresso ou um promotor específico do tecido para atingir tipos de células específicas. Esta técnica pode ser estendida a um promotor específico para examinar as taxas de síntese proteica de uma proteína específica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>8,40,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose pads 2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dehydrate (CaCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>17101.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SMZ645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axio Imager Z2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Lumar V12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,37,010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB liquid medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>10 006 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office 2011 Excel software package</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth medium (NGM) agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin stock solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,40,41,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical analysis software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Prism software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of de novo protein synthesis rates in caenorhabditis elegans

Manter um proteome saudável é essencial para a homeostase celular e organismo. A perturbação do equilíbrio entre controle translacional de proteínas e degradação instiga uma infinidade de doenças relacionadas à idade. O declínio dos mecanismos de controle de qualidade da proteostase é uma marca do envelhecimento. Os métodos bioquímicos para detectar a síntese de proteínas de novo ainda são limitados, têm várias desvantagens e não podem ser realizados em células vivas ou animais. Caenorhabditis elegans, sendo transparente e facilmente geneticamente modificado, é um excelente modelo para monitorar as taxas de síntese proteica usando técnicas de imagem. Aqui, introduzimos e descrevemos um método para medir a síntese de proteína de novo in vivo utilizando a recuperação da fluorescência após o fotobleaching (FRAP). Animais transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em células ou tecidos específicos são irradiados por uma poderosa fonte de luz que resulta em fotobleaching de fluorescência. Por sua vez, a avaliação da recuperação da fluorescência significa nova síntese proteica em células e/ou tecidos de interesse. Assim, a combinação de nematoides transgênicos, intervenções genéticas e/ou farmacológicas, juntamente com imagens vivas das taxas de síntese proteica podem lançar luz sobre mecanismos que mediam o colapso da proteostase dependente da idade.

Utilizando o procedimento aqui apresentado, foram utilizados nematoides transgênicos de tipo selvagem e mutantes expressando os seguintes repórteres somáticos, pife-22GFP, psod-3GFP e punc-119GFP, para avaliar as taxas de síntese proteica de acordo com os respectivos protocolos. Particularmente, vermes mutantes do tipo selvagem e ife-2 expressando GFP citoplasmático em seus tecidos somáticos usando o promoto...

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Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Aqui, introduzimos e descrevemos um método nãoradioativo e não invasivo para avaliar a síntese de proteína de novo in vivo, utilizando o nematode Caenorhabditis elegans e recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP). Este método pode ser combinado com telas genéticas e/ou farmacológicas para identificar novos moduladores da síntese proteica.

Avaliação das taxas de síntese de proteínas de novo em Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

A taxa de síntese proteica é perturbada durante a doença e o envelhecimento. A recuperação da fluorescência após o fotobleaching, ou FRAP, permite a medição da taxa de síntese proteica in vivo. Usamos vermes C.elegans transparentes, que expressam GFP, como modelo para monitorar a nova síntese proteica após fotobleaching.Fornecemos diretrizes práticas para medir a recuperação da fluorescência usando vermes transgênicos, que expressam GFP sob diferentes promotores, amplamente expressos ou em células ou tecidos específicos. Além disso, este método oferece monitoramento de velocidade de síntese proteica em tempo real. Use um estereótipo dissecando para avaliar os estágios de desenvolvimento e o crescimento de nematoides transgênicos do tipo selvagem e mutantes.Escolha 10 larvas L4 de animais transgênicos selvagens e mutantes carregando o repórter fluorescente desejado em placas de mídia de crescimento de nematoide semeadas com E.coli. Incubar e cultivar os nematoides à temperatura padrão de 20 graus Celsius. Quatro dias depois, a placa contém uma população mista de vermes transgênicos.Selecione e transfira 15 larvas L4 de cada cepa em placas op50 NGM recém-semeadas. Realize o ensaio FRAP e monitore a taxa de síntese de proteínas no primeiro dia da idade adulta. No dia seguinte, prepare e use placas de GNM contendo cicloheximida como um controle positivo.Mate bactérias expondo as placas de NGM semeadas por 15 minutos com luz UV. Adicione cicloheximida na parte superior das placas bacterianas também 500 microgramas por mL concentração final no volume do ágar. Deixe as placas secarem.Transfira nematoides transgênicos expressando GFP em placas de veículo e cicloheximida. Incubar animais por duas horas na temperatura padrão de 20 graus Celsius. Escolha e transfira animais transgênicos adultos de um dia para placas individuais de GNM semeadas com uma queda de 20 microliters OP50 no centro.Remova a tampa e coloque cada placa sob uma lente objetiva de 20H de um microscópio epifluorescente. Concentre-se e capture uma imagem de referência antes de fotobleaching. Fotobleach cada amostra por 10 minutos.Capture uma imagem após fotobleaching. Mantenha os animais em placas de GNM individuais, e deixe-os se recuperar. Imagem e registro da recuperação de cada repórter fluorescente a cada uma hora por pelo menos seis horas em um estereóscópio epifluorescente.Prepare 2% das almofadas de agarose e adicione 10 microliters drop de tampão M9 no centro da almofada agarose. Transfira cinco nematoides transgênicos expressando GFP citoplasmica pan-neuronal em uma gota de tampão M9. Use um cílio para espalhar o líquido.Os animais apresentam movimentos reduzidos em dois minutos por causa da absorvância M9 no ágar. Mude a posição do nematoide usando uma picareta de cílios. Coloque a amostra na lente objetiva de 40H de um microscópio epifluorescente sem o uso de um deslizamento de tampa.Concentre-se e capture uma imagem de referência. Fotobleach uma área de interesse alvo por 90 segundos. Capture uma imagem após fotobleaching.Adicione uma gota de 10 microliters de tampão M9 em nematoides fotobleachados. Deixe os animais se recuperarem por cinco minutos. Use a picareta de cílios ou uma pipeta para transferir os nematoides para placas ngm individuais semeadas com 20 microliters OP50 drop no centro.Capture uma imagem de cada amostra a cada uma hora sob um estereóscópio epifluorescente. Vermes mutantes do tipo selvagem e fe-2 expressando GFP citoplasmático em seus tecidos somáticos usando o promotor fe-2 foram comparados antes, imediatamente após fotobleaching, e cinco horas após a recuperação. Animais selvagens totalmente recuperados enquanto os mutantes fe-2 tinham a capacidade de recuperação de minis.Assim, vermes do tipo selvagem iniciam a síntese de proteínas normal após a fotobleaching, enquanto os vermes sem fator de iniciação de tradução mRNA fe-2 são incapazes de fazê-lo, indicando que a taxa de recuperação fluorescente ilustra a taxa de síntese proteica in vivo. Cicloheximida, um inibidor específico da tradução mRNA pode ser usado como um controle positivo para a inibição da tradução de proteínas. De fato, animais transgênicos tratados com cicloheximida que expressam GFP citoplasmica sob o promotor não recuperam sua fluorescência após a fotobleaching.Os corpos de processamento de mRNA afetam a taxa de tradução de proteínas. Nematoides mutantes do tipo selvagem e edc-3 expressando GFP pan-neuronalmente foram examinados para sua capacidade de recuperação após fotobleaching direcionado na região da cabeça. A recuperação fluorescente é muito mais lenta em animais deficientes edc-3 em comparação com vermes do tipo selvagem.A modulação da síntese proteica é essencial para a homeostase do organismo. Durante o envelhecimento, a síntese de proteínas globais e específicas é perturbada. O equilíbrio de tradução de proteínas controla diretamente a senescência e o envelhecimento.Especificamente, componentes centrais da máquina de tradução, bem como componentes de interação P-body aceleram o processo de envelhecimento. Perturbação da iniciação da tradução desacelera o envelhecimento. Assim, medir as taxas globais de síntese de proteínas pelo FRAP é uma leitura direta do processo de envelhecimento.

Research

JoVE Journal

Biology

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Evitar osmótica em Caenorhabditis elegans: Função Synaptic de dois genes, Orthologues dos Direitos Humanos NRXN1 E NLGN1, Como candidatos para o autismo

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Biologia

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

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Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

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