Name: assessment of de novo protein synthesis rates in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-09-12T13:00:00
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Agradecemos a Chaniotakis M. y Kounakis K. por la grabación y edición de vídeo. K.P. está financiado por una subvención de la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (HFRI) y la Secretaría General de Investigación y Tecnología (GSRT). N.T. está financiado por subvenciones del Consejo Europeo de Investigación (ERC – GA695190 – MANNA), los Programas Marco de la Comisión Europea y el Ministerio de Educación de Grecia.

NOTA: Tanto las fusiones transcripcionales como las traslacionales a fluoróforos se pueden utilizar para evaluar la traducción de proteínas de novo en varios tejidos. Las tasas de síntesis de proteínas se pueden evaluar para múltiples familias de proteínas que se localizan en diferentes compartimentos celulares, incluyendo citoplasma, mitocondrias y núcleo7. Las siguientes cepas se utilizan para monitorear las tasas de síntesis de proteínas globales y neuronales, N2; Ex[p<e...

<ol>
	<li>Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E+function+in+somatic+cells+modulates+ageing+in+Caenorhabditis+elegans.">eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).</li><li>Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+as+an+integral+quality+control+mechanism+during+ageing.">Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing.</a> Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).</li><li>Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+absolute+protein+synthesis+rates+reveals+principles+underlying+allocation+of+cellular+resources.">Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources.</a> Cell. 157 (3), 624-635 (2014).</li><li>Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+monitoring+and+measurement+of+protein+translation+in+time+and+space.">Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space.</a> Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growing+Toolbox+for+Protein+Synthesis+Studies.">The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+monitoring+of+protein+synthesis+in+vivo.">Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).</li><li>Parker, R., Sheth, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+bodies+and+the+control+of+mRNA+translation+and+degradation.">P bodies and the control of mRNA translation and degradation.</a> Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).</li><li>Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+Proteostasis+by+P+Body-Mediated+Regulation+of+eIF4E+Availability+during+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).</li><li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fixed+to+FRAP:+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells.">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).</li><li>Keith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graded+Proteasome+Dysfunction+in+Caenorhabditis+elegans+Activates+an+Adaptive+Response+Involving+the+Conserved+SKN-1+and+ELT-2+Transcription+Factors+and+the+Autophagy-Lysosome+Pathway.">Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).</li><li>Kumsta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+receptor+p62/SQST-1+promotes+proteostasis+and+longevity+in+C.+elegans+by+inducing+autophagy.">The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy.</a> Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).</li><li>Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+aggregation,+and+degradation+in+disease.">Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease.</a> Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).</li></ol>

La modulación de síntesis de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Durante el envejecimiento, se perturba la síntesis de proteínas globales y específicas. Estudios recientes revelan el hecho de que el equilibrio de traducción de proteínas controla directamente la senescencia y el envejecimiento no es simplemente un subproducto del proceso de envejecimiento. En particular, los componentes básicos de la maquinaria de traducción, como el factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E), que facilita el t...

La síntesis y degradación de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Una multitud de enfermedades relacionadas con la edad son instigadas por la producción de proteínasdefectuosas 1,2. Con el fin de medir las tasas globales de traducción de proteínas, existen técnicas bioquímicas como el perfil ribosomal, que implica la secuenciación profunda de fragmentos de ARNm protegidos contra ribosomas para monitorear la expresión, así como la nueva síntesis de proteínas3. Este método, además de ser una lectura indirecta de las tasas de traslación, ya que el aumento de la asociación de ARN a los ribosomas no significa necesariamente un aumento de la traducción, tiene desventajas técnicas, como un alto costo y un requisito de una gran cantidad de material de partida. Por otro lado, los métodos basados en proteómica permiten la cuantificación directa de proteínas mediante perfiles metabólicos de pulso seguidos de análisis de espectrometría de masas4,,5. Sin embargo, se trata de un enfoque semicuantitativo con resolución temporal limitada que no se puede utilizar fácilmente in vivo. Además, el etiquetado de la proteína puede distribuirse de manera desigual en el animal/tejido de interés. Es importante destacar que ambos métodos pueden ocultar variaciones específicas de los tejidos o de las células en las tasas de traducción de proteínas en animales o tejidos enteros, respectivamente.
Caenorhabditis elegans es un organismo modelo fácil de usar que se puede cultivar en grandes cantidades6. Además, su sostenibilidad genética y transparencia permiten obtener imágenes en vivo in vivo. Este protocolo describe la metodología para detectar las tasas de síntesis de proteínas utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblancarte (FRAP). Aprovechamos la expresión transgénica de proteínas fluorescentes, ya sea en todo el organismo o en tejidos/células específicos. Los animales transgénicos pueden expresar la GFP utilizando el promotor de un gen, que se expresa ampliamente/globalmente o un promotor específico del tejido para atacar tipos celulares específicos. Esta técnica se puede extender a un promotor específico para examinar las tasas de síntesis de proteínas de una proteína específica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>8,40,004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose pads 2%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dehydrate (CaCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>17101.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>SMZ645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axio Imager Z2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50 strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Lumar V12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Petri dishes (60 x 15 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,37,010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,04,873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB liquid medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (75 x 25 x 1 mm)</td>
			<td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td>
			<td>10 006 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office 2011 Excel software package</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[pife-2GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[psod-3GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2;Ex[punc-119GFP; pRF4]</td>
			<td>Tavernarakis lab</td>
			<td></td>
			<td>Maintain animals at 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth medium (NGM) agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin stock solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD, Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1,06,40,41,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>statistical analysis software</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Prism software package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of de novo protein synthesis rates in caenorhabditis elegans

Mantener un proteomo saludable es esencial para la homeostasis celular y del organismo. La perturbación del equilibrio entre el control traslacional de proteínas y la degradación instiga una multitud de enfermedades relacionadas con la edad. La disminución de los mecanismos de control de calidad de la proteostasis es un sello distintivo del envejecimiento. Los métodos bioquímicos para detectar la síntesis de proteínas de novo siguen siendo limitados, tienen varias desventajas y no se pueden realizar en células vivas o animales. Caenorhabditis elegans, siendo transparente y fácilmente modificado genéticamente, es un excelente modelo para monitorear las tasas de síntesis de proteínas mediante el uso de técnicas de imagen. Aquí, introducimos y describimos un método para medir la síntesis de proteínas de novo in vivo utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblancarte (FRAP). Los animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en células o tejidos específicos son irradiados por una poderosa fuente de luz que resulta en fotoblancarse de fluorescencia. A su vez, la evaluación de la recuperación de la fluorescencia significa una nueva síntesis de proteínas en células y/o tejidos de interés. Por lo tanto, la combinación de nematodos transgénicos, intervenciones genéticas y/o farmacológicas junto con imágenes vivas de las tasas de síntesis de proteínas puede arrojar luz sobre los mecanismos que median el colapso de la proteostasis dependiente de la edad.

Utilizando el procedimiento presentado aquí, se utilizaron nematodos transgénicos de tipo salvaje y mutante que expresan los siguientes reporteros somáticos, pife-2GFP, psod-3GFP y punc-119GFP, para evaluar las tasas de síntesis de proteínas de acuerdo con los protocolos respectivos. Particularmente, los gusanos mutantes de tipo salvaje y ife-2 que expresan la GFP citoplasmática a través de sus tejidos som?...

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Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Aquí, introducimos y describimos un método noradioactivo y no invasivo para evaluar la síntesis de proteínas de novo in vivo, utilizando el nematodo Caenorhabditis elegans y la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). Este método se puede combinar con pantallas genéticas y/o farmacológicas para identificar nuevos moduladores de la síntesis de proteínas.

Evaluación de las tasas de síntesis de proteínas de novo en Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

La tasa de síntesis de proteínas se perturba durante la enfermedad y el envejecimiento. La recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo, o FRAP, permite la medición de la tasa de síntesis de proteínas in vivo. Utilizamos gusanos C.elegans transparentes, que expresan GFP, como modelo para monitorear la síntesis de proteínas novedosa después de la fotoblanquida.Proporcionamos directrices prácticas para medir la recuperación de la fluorescencia mediante el uso de gusanos transgénicos, que expresan la GFP bajo diferentes promotores, ya sea ampliamente expresados o en células o tejidos específicos. Además, este método ofrece monitoreo de la velocidad de síntesis de proteínas en tiempo real. Utilice un estereomicroscopio diseccionado para evaluar las etapas del desarrollo y el crecimiento de nematodos transgénicos de tipo salvaje y mutantes.Escoge 10 larvas L4 de animales transgénicos salvajes y mutantes que lleven al reportero fluorescente deseado sobre placas de medios de crecimiento de nematodos sembradas con E.coli. Incubar y cultivar los nematodos a la temperatura estándar de 20 grados centígrados. Cuatro días más tarde, la placa contiene una población mixta de gusanos transgénicos.Seleccione y transfiera 15 larvas L4 de cada cepa en placas OP50 NGM recién sembradas. Realice el ensayo FRAP y monitorice la tasa de síntesis de proteínas en el primer día de la edad adulta. Al día siguiente, preparar y utilizar placas NGM que contienen cicloheximida como un control positivo.Elimine las bacterias exponiendo las placas NGM de semillas durante 15 minutos con luz UV. Añadir cicloheximida en la parte superior de placas de semillas bacterianas también 500 microgramos por ml de concentración final en el volumen de agar. Deje que las placas se sequen.Transfiera nematodos transgénicos que expresen GFP en placas que contengan cicloheximida. Incubar animales durante dos horas a una temperatura estándar de 20 grados centígrados. Escoja y transfiera animales transgénicos adultos de un día a placas NGM individuales sembradas con una caída de 20 microlitros OP50 en el centro.Retire la tapa y coloque cada placa debajo de una lente objetivo 20H de un microscopio epifluorescente. Enfoque y capture una imagen de referencia antes de photoblación. Fotoblecir cada muestra durante 10 minutos.Capturar una imagen después de la fotoblancada. Mantenga a los animales en placas NGM individuales y déjelos recuperarse. Imagen y registro de la recuperación de cada reportero fluorescente cada una hora durante al menos seis horas a un estereomicroscopio epifluorescente.Prepara almohadillas de 2% de agarosa y añade 10 microlitros de tampón M9 en el centro de la almohadilla de agarosa. Transfiera cinco nematodos transgénicos que expresen GFP citoplasmático pan-neuronal a una gota de tampón M9. Use una pestaña para esparcir el líquido.Los animales muestran movimientos reducidos en dos minutos debido a la absorción de M9 en el agar. Cambie la posición del nematodo mediante un pico de pestañas. Coloque la muestra en la lente objetivo 40H de un microscopio epifluorescente sin usar un resbalón de cubierta.Enfoque y capture una imagen de referencia. Fotoblecir un área de interés objetivo durante 90 segundos. Capturar una imagen después de la fotoblancada.Agregue una gota de 10 microlitros de tampón M9 en nematodos fotoblanes. Deja que los animales se recuperen durante cinco minutos. Utilice el pico de pestañas o una pipeta para transferir los nematodos a placas NGM individuales sembradas con 20 microlitros OP50 gota en el centro.Capture una imagen de cada muestra cada una hora bajo un estereomicroscopio epifluorescente. Los gusanos mutantes de tipo salvaje y fe-2 que expresan GFP citoplasmáticos a través de sus tejidos somáticos mediante el uso del promotor fe-2 fueron comparados antes, inmediatamente después del fotoblanqueo, y cinco horas después de la recuperación. Los animales de tipo salvaje se recuperaron por completo, mientras que los mutantes fe-2 tenían la capacidad de recuperación de minis.Por lo tanto, los gusanos de tipo salvaje inician la síntesis normal de proteínas después de la fotoblanqueo, mientras que los gusanos que carecen del factor de iniciación de la traducción de ARNm fe-2 no pueden hacerlo, lo que indica que la tasa de recuperación fluorescente ilustra la tasa de síntesis de proteínas in vivo. Cicloheximida, un inhibidor específico de la traducción de ARNm se puede utilizar como un control positivo para la inhibición de la traducción de proteínas. De hecho, los animales transgénicos tratados con cicloheximida que expresan GFP citoplasmático bajo el promotor no recuperan su fluorescencia al fotoblancarse.Los cuerpos de procesamiento de ARNm afectan la tasa de traducción de proteínas. Los nematodos mutantes de tipo salvaje y edc-3 que expresaban GFP pan-neuronalmente fueron examinados para detectar su capacidad de recuperación tras el fotoblanqueo dirigido en la región principal. La recuperación fluorescente es mucho más lenta en animales con deficiencia de edc-3 en comparación con los gusanos de tipo salvaje.La modulación de síntesis de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Durante el envejecimiento, se perturba la síntesis de proteínas globales y específicas. El equilibrio de traducción de proteínas controla directamente la senescencia y el envejecimiento.Específicamente, los componentes principales de la maquinaria de traducción, así como los componentes que interactúan con el cuerpo P aceleran el proceso de envejecimiento. La perturbación de la iniciación de la traducción desacelera el envejecimiento. Por lo tanto, medir las tasas globales de síntesis de proteínas por FRAP es una lectura directa del proceso de envejecimiento.

Research

JoVE Journal

Biology

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