Name: in vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation
Uploaded: 2020-05-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation at JoVE.com

我们感谢马克斯·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所的服务和设施所提供的出色支持，特别是生物医学服务 （BMS） 的整个团队为雪铁龙和 J. Peychl 及其光显微镜设施团队的出色饲养。我们特别感谢英国医学会的卡特林·雷佩和安娜·普费弗提供出色的兽医支持，以及赫特纳集团的雷星协助雪铁龙手术。

所有实验程序都是与德国动物福利立法的一致，经土地福利法（TVV 2/2015和TVV 21/2017号许可）批准后进行。
1. 子宫电穿孔的准备
<ol><li>准备DNA混合物。在此协议中，使用 1 μg/μL 的 pGFP 最终浓度。将DNA溶解在PBS中，并补充0.1%的快速绿色，以方便可视化。一旦准备好，通过上下移液几次或用手指敲击混合DNA混合物。储存在室温下，直到使用。 注：对于共电体，DNA混合物准备?...

在铁的子宫电穿孔是一种重要的技术，与其他方法相比，有优缺点。此方法有关键步骤和限制，以及潜在的修改和未来的应用程序需要记住。
自从维克多·博雷尔,及其同事在通过电穿孔或病毒注射35、42、43,42对产后雪铁龙新皮质进行基因操作方面进行开创性工作以来，雪铁龙已成为一种基因可访问的模型?...

新皮质是哺乳动物大脑的外层,，是认知功能1、2、3、4、52,34的更高认知功能。1为了在胚胎发育过程中在体内哺乳动物新皮质中实现急性基因操作，探索了两种不同的方法：病毒感染6和子宫电穿孔7。这两种方法都允许有效定位新皮质细胞，但存在一些限制。与病毒感染相比，子宫电穿孔的主要优点是能够实现新皮质内的空间特异性，这是通过调节电场方向来实现的。
自从电穿孔首次被证明有助于DNA进入体外8细胞以来，它已被应用到体内的各种脊椎动物中传递DNA。在发育神经科学中，在小鼠新皮质的子宫电穿孔中，第一次报告于2001年,9，10。该方法包括注射胚胎脑横向心室的DNA混合物，以及随后使用钳子电极应用电场，从而允许空间精度,7，11。在子宫电穿孔已应用提供核酸，以操纵内源或异位添加基因在小鼠新皮质的表达。最近，通过应用CRISPR/Cas9的细胞基在小鼠新皮质中通过子宫电穿孔进行基因组编辑的方法，在后细胞12、13和神经,祖细胞14、（2）基因组15和表观基因组16编辑中执行（1）基因破坏，取得了重要进展。13
在小鼠首次报告后不久，在子宫电穿孔中应用于胚胎鼠新皮质17，18。,18非啮齿动物仍然是一个挑战，直到第一次在子宫电穿孔雪铁龙，一种小型食肉动物，在2012年19，20。19,此后，在铁杉的子宫电穿孔中，通过标记神经祖细胞,和神经元,,20、21、22、23、操纵内源基因的表达，包括使用CRISPR/Cas9技术24，以及传递异位基因22,23,2121、22、25，包括人类特异性25基因2226，应用于研究新皮质发育21的机制。此外，在子宫电穿孔的雪铁龙已被用来解决人类新皮质发育的特点在病理条件27，28。27,
在新皮质发育的背景下，与小鼠相比，使用雪铁龙作为模型有机体的优点是，雪铁龙可以更好地概括一系列人类特征。在解剖层面，雪铁龙表现出皮质折叠的特征模式，这种折叠在人类和大多数其他灵长类动物中也存在，但在,小鼠或大鼠4、29、30、31,29,30中完全不存在。在组织学层面，雪铁龙有两个不同的辅助细菌区，分别称为内缘和外侧补助区（ISVZ和OSVZ）32、33，由内纤维层32,3323隔开。这些功能也与灵长类动物共享，包括人类，但不是与小鼠34。雪铁龙和人类中的 ISVZ 和 OSVZ 都含有丰富的神经祖细胞，而小鼠的辅助区 （SVZ） 只含有稀疏的神经祖细胞 21、32、35、36。21,32,35,36在细胞水平上，雪铁龙表现出称为基底或外径向胶质（bRG或oRG）的神经祖细胞亚型的高比例，这些亚型被认为有助于哺乳动物新皮质34、37、38,37,的进化扩张。因此，bRG在胎儿人类和胚胎雪铁龙新皮质中非常丰富，但它们在胚胎小鼠新皮质35，36,中是非常罕见的。此外，雪铁龙bRG显示形态异质性类似于人类bRG，远远优于小鼠bRG21。最后，在分子水平上，发展雪铁龙新皮质显示基因表达模式与胎儿人类新皮质非常相似，假定它们能够控制皮质折叠的发展，除其他外，39。
雪铁龙bRG的细胞生物学和分子特性使其具有很高的增殖性，类似于人类bRG。这导致神经元的产生增加和扩展和高度复杂的新皮质34的发展。这些特性使雪铁龙成为研究新皮质发育的人类特征的优秀模型生物，这种特征在小鼠26、40,中无法建模。为了充分利用雪铁龙作为模型有机体，提出了该方法。它包括E33雪铁龙胚胎的子宫电穿孔与质粒表达GFP（pGFP）在一个无处不在的启动子CAG的控制之下。然后，可以胚胎或产后对电穿孔胚胎进行分析。为了减少牺牲动物的数量，雌性雪铁龙（吉尔）通过子宫切除术进行绝育，并捐赠给宠物收养。如果目标胚胎在胚胎阶段收获，则进行第二次手术，通过剖腹产切除胚胎，而小鼠被子宫切除。如果在产后阶段分析目标胚胎，在幼崽被洗奶或牺牲后，这些幼崽被子宫切除。因此，还提出了一个用于吉尔的子宫切除术的协议。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Vicryl suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>V392ZG</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium spray</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>98017</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU)</td>
			<td>WDT</td>
			<td>6301</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cappilary holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH6S12</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol Ointment solution</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>6029009.00.00</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape sheet 45x75cm</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>2513052</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Tweezer, platinum plated 5mm</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0489</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM830</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferret Mustela putorius furo</td>
			<td>Marshall</td>
			<td>NA</td>
			<td>Experimental organism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL1500LCD</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Allgaier instrumente</td>
			<td>08-033-130</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 3C-SA</td>
			<td>Rubis Tech</td>
			<td>3C-SA</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 55</td>
			<td>Dumostar</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 5-SA</td>
			<td>Rubis Tech</td>
			<td>5-SA</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze swabs large</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>401723</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze swabs small</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>401721</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Aves labs</td>
			<td>GFP1020</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length)</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Bela-pharm</td>
			<td>K4011-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad</td>
			<td>Hans Dinslage</td>
			<td>Sanitas SHK18</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine (Betadine solution 100 mg/ml)</td>
			<td>Meda</td>
			<td>997437</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran</td>
			<td>CP</td>
			<td>21311</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tips 20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#5242 956.003</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamizol</td>
			<td>WDT</td>
			<td>99012</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum dissecting scissors</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BC600R</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-GFP</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>From Kalebic et al., eLife, 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCNA antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CBL407</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10543</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>294200104</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Braun</td>
			<td>EP100</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2 antibody</td>
			<td>R+D Systems</td>
			<td>AF2018</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clamp 13cm</td>
			<td>WDT</td>
			<td>27080</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical double spoon (Williger)</td>
			<td>WDT</td>
			<td>27232</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>WDT</td>
			<td>28800</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors small</td>
			<td>FST</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suturing needle holder</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BM149R</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23345</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 3ml</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>13439108</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation

在胚胎发育过程中，在体内操作基因表达是分析个体基因在哺乳动物发育中的作用时的首选方法。在子宫电穿孔是一种关键技术，用于操纵胚胎哺乳动物大脑体内的基因表达。这里介绍了一种用于子宫电穿孔的子宫电穿孔的龙肉，一种小型食肉动物。雪铁龙正越来越多地被用作新皮质发育的模型，因为它的新皮质表现出一系列解剖、组织学、细胞和分子特征，这些特征也存在于人类和非人类灵长类动物中，但在啮齿动物模型中却不存在，如小鼠或大鼠。在子宫电穿孔是在胚胎日（E）33，在雪铁龙的中创阶段进行。在子宫电穿孔中，目标是脑的横向心室内的神经祖细胞。在神经生成过程中，这些祖细胞产生所有其他神经细胞类型。本工作显示了E37、产后日（P）1和P16的代表性结果和分析，分别对应于子宫电穿孔后4天、9天和24天。在早期阶段，靶向细胞的后代主要由各种神经祖细胞子型组成，而在后期阶段，大多数标记的细胞是后位神经元。因此，在子宫电穿孔中，可以研究基因操纵对各类神经细胞的细胞和分子特征的影响。通过它对各种细胞群的影响，在子宫电穿孔也可用于操纵组理学和解剖特征的雪铁龙新皮质。重要的是，所有这些影响都是急性的，并且由用户确定时空特异性。

在E33的雪铁龙的子宫电穿孔中，导致在胚胎新皮质的心室表面内衬的神经祖细胞瞄准（图1）。这些细胞被称为脂肪祖细胞，并且是高度增殖的，在发育过程中产生所有其他细胞类型。在不对称分裂时，脂肪祖体产生另一个蛋白亲和一个更分化的细胞，通常是基底祖代（BP），从心室表面去层。BPs 迁移到辅助细菌区 SVZ。当电穿孔在E33进行时，许多新生的BPs迁移到SVZ的最基础?...

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In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

这里介绍的是一个方案，用于在胚胎雪铁龙大脑中使用子宫电穿孔进行基因操作。此方法允许在体内神经祖细胞靶向神经祖细胞。

通过子宫电位对脑神经祖细胞进行神经祖细胞的振动定位

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

该协议允许我们在一个关键的动物模型中进行体内基因操作，使我们能够研究一个正在发育的新皮质的扩展和折叠。这种方法的主要优点是利用高空间和时间特异性来靶向那些神经干细胞，这些神经干细胞是大脑发育的关键细胞类型。在开始手术之前，将玻璃毛细管拉到微型移液器拉拔器上，并使用钳子切断毛细管的端骨部分，以调整毛细管尖端的直径。在胚胎第33天，在PBS中加入适当的DNA浓度，辅以0.1%的快速绿色与温和混合，并放置一个3小时禁食，麻醉，怀孕的雌性雪铁龙在手术台上与热垫。通过触摸眼皮和捏皮肤之间的皮肤第二和第三或第三和第四脚趾之间的两个后肢确认适当的水平。异氟兰可引起不良反应，包括恶心和头晕。在以液体形式处理异氟兰时，请使用防护设备。在手术过程中，使用适当的毒气罐捕获气体。将动物皮下注射镇痛剂、抗生素和葡萄糖，并在动物的眼睛上放置软膏。使用剪子剃腹部，用水、肥皂和碘溶液清洁裸露的皮肤。然后，用纱布擦拭擦干皮肤，用酒精和碘磨砂消毒。在子宫电穿孔中，在动物上放置一个无菌的窗帘，并使用手术刀在线巴伊布处进行大约5厘米的皮肤切口。使用剪刀切割肌肉层，并在切口部位周围放置纱布棉签。用 PBS 将纱布弄湿，将子宫放在拭子上。使用带长尖端的移液器，将一个拉玻璃毛细管与每个胚胎的5微升DNA溶液混合在一起。将加载的毛细管连接到支架上，然后将支架的另一侧连接到管子和喉舌上。找到第一个胚胎的头部，并在头部旁边放置光纤光源。使用色素虹膜作为参考点，用玻璃毛细管的尖端穿透皮肤、头骨和脑组织，并使用口腔通量，以方便将3-5微升的注射溶液输送到脑半球之一的心室。由于注射溶液含有0.1%的快速绿色，成功注射将导致注射心室的深绿色染色，现在将可见为肾形结构。注射后，将钳子电极放在胚胎头部上方的子宫上，将正极放在要瞄准的区域上方，将负极放在注射区域下方。将电脉冲的脉冲长度设置为 50 毫秒，将脉冲电压设置为 100 伏特，将脉冲间隔设置为 1 秒，将脉冲数设置为 5。当所有参数都设置好后，按脉冲"，并迅速将几滴热 PBS 滴到电穿孔胚胎上。当所有胚胎都进行电穿孔时，将子宫返回到腹腔，并使用 4-0 缝合线用腹膜关闭肌肉层。以类似的方式关闭皮肤，用铝喷雾覆盖伤口。然后用热源将动物返回到其笼子并进行监测，直到完全恢复。在胚胎第37天电穿孔四天后，大多数靶向细胞及其后代仍在生殖区，细胞很少在皮质板内进一步观察。前代体身份可以通过循环细胞的标记物（如PCNA）的免疫荧光来检查，而接受线粒体病的祖体子体可以通过磷蛋白3等标记物显示。在产后零日，电穿孔8天后，靶细胞的后代扩散到所有组织学层。使用转录因子标记的组合，可以揭示不同的基底祖体种群。例如，Sox2 是增殖祖细胞的标记，包括基底径向胶质。T盒脑蛋白2是神经源基底祖体的标志，主要是中间祖体。到产后第16天，大多数目标细胞停止分裂和分化成神经元和胶质，产后第16天雪铁龙表现出典型的折叠模式。雪铁龙胚胎的子宫电穿孔是研究基因功能的极强方法。它使我们能够研究与进化中新皮质扩张有关的基因，包括人类特异性基因。使用这种强大的方法，我们确实已经能够找出人类新皮质的进化扩张可能如何工作的关键特征。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

睾酮和社会决策，结合行为内分泌和实验经济学：

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

科研

神经科学

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

在子宫内的电穿孔其次原发性神经文化为研究基因的功能在皮层神经元的一个子集

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

在发展中国家斑马鱼的前脑的神经祖细胞克隆相关的定时实时成像

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

小鼠视网膜神经节细胞的转染在体内电穿孔

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

在完整的感觉器官前体细胞的活细胞成像果蝇蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

在子宫内电穿孔：鼠标控制时空基因Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

使用超声波血脑屏障破坏和锰增强MRI的脑功能成像

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

扩展胚胎及成体神经干细胞<em&gt;在子宫内</em电穿孔或病毒立体定向注射

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

外用转基因大鼠通过代<em&gt;在子宫内</em&gt;电穿孔和<em&gt;在体内</em&gt;生物发光筛选

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

同时<em&gt;体外</em两个由视网膜&gt;功能测试<em&gt;在体内</em&gt;电图系统

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...