Name: in vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation
Uploaded: 2020-05-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation at JoVE.com

Siamo grati ai Servizi e Alle Strutture del Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics per l'eccezionale supporto fornito, in particolare l'intero team dei servizi biomedici (BMS) per l'eccellente allevamento di furetti e J. Peychl e il suo team del Light Microscopy Facility. Siamo particolarmente grati a Katrin Reppe e Anna Pfeffer del BMS per l'eccezionale supporto veterinario e a Lei Xing del gruppo Huttner per aver assistito con interventi chirurgici in furetto.

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in accordo con la Legislazione tedesca sul benessere degli animali dopo l'approvazione da parte della Landesdirektion Sachsen (licenze TVV 2/2015 e TVV 21/2017).
1. Preparazione per l'elettroporazione in utero
<ol><li>Preparare la miscela di DNA. In questo protocollo viene utilizzata una concentrazione finale di 1 g/L di pGFP. Sciogliere il DNA in PBS e integrare con 0.1% Fast Green per facilitare la visualizzazione. Una volta preparata, me...

In utero l'elettroporazione nel furetto è una tecnica importante, con vantaggi e svantaggi rispetto ad altri metodi. Esistono passaggi critici e limitazioni a questo metodo, nonché potenziali modifiche e applicazioni future da tenere a mente.
Dal lavoro pionieristico di Victor Borrell e colleghi sulla manipolazione genetica della neocorteccia di furetti postnatali tramite elettroporazione o iniezione virale35,42,<sup class...

La neocorteccia è il foglio esterno del cervello dei mammiferi e la sede delle funzioni cognitive superiori1,2,3,4,5. Per ottenere una manipolazione genetica acuta nella neocorteccia di mammifero in vivo durante lo sviluppo embrionale, sono stati esplorati due diversi metodi: l'infezione virale6 e l'elettroporazione utero7. Entrambi i metodi consentono un targeting efficiente delle cellule neocorticali, ma soffrono di alcune limitazioni. Il principale vantaggio dell'elettroporazione in utero rispetto all'infezione virale è la capacità di raggiungere la specificità spaziale all'interno della neocorteccia, che si ottiene regolando la direzione del campo elettrico.
Dal momento che l'elettroporazione è stata dimostrata per facilitare l'ingresso del DNA nelle cellule in vitro8, è stato applicato per fornire il DNA in vari vertebrati in vivo. Nella neuroscienza dello sviluppo, in utero l'elettroporazione della neocorteccia del topo è stata riportata per la prima volta nel 20019,10. Questo metodo consiste in un'iniezione della miscela di DNA nel ventricolo laterale del cervello embrionale e dalla successiva applicazione del campo elettrico utilizzando elettrodi tweezer, che consente la precisione spaziale7,11. In utero l'elettroporazione è stata poi applicata per fornire acidi nucleici al fine di manipolare l'espressione di geni endogeni o aggiunti ectopicamente nella neocorteccia del topo. Recentemente sono stati compiuti importanti progressi applicando la metodologia dell'editing del genoma mediato da CRISPR/Cas9 tramite l'elettroporazione in utero nella neocorteccia del topo per eseguire (1) l'interruzione genica nei neuroni postmitotici12,13 e le cellule progenitricineurali 14e (2) il genoma15 e l'epigenoma16.
Poco dopo il primo rapporto nel topo, in utero l'elettroporazione è stata applicata alla neocorteccia di rattoembrionale 17,18. I non roditori sono rimasti una sfida fino a quando il primo in utero elettroporazione di furetti, un piccolo carnivoro, è stato segnalato nel 201219,20. Da allora, in utero l'elettroporazione dei furetti è stata applicata per studiare i meccanismi di sviluppo della neocorteccia etichettando progenitori neurali e neuroni20,21,22,23, manipolando l'espressione di geni endogeni, compreso l'uso della tecnologia CRISPR/Cas924, e fornendo geni ectopici21,22,25, compresi i geni specifici dell'uomo26. Inoltre, in utero l'elettroporazione dei furetti è stata utilizzata per affrontare le caratteristiche dello sviluppo umano della neocorteccia in condizionipatologiche 27,28.
Nel contesto dello sviluppo della neocorteccia, i vantaggi dell'uso dei furetti come organismo modello rispetto ai topi sono dovuti al fatto che i furetti ricapitolano meglio una serie di caratteristiche simili a quella umana. A livello anatomico, i furetti presentano un caratteristico modello di piegatura corticale, che è presente anche nell'uomo e nella maggior parte degli altri primati, ma è completamente assente nei topi o nei ratti4,29,30,31. A livello istologico i furetti hanno due distinte zone germicolari subventricolari, denominate zone subventricolari interne ed esterne (rispettivamente ISV e OSV)32,33, separate dallo strato di fibrainterna 23. Queste caratteristiche sono condivise anche con i primati, compresi gli esseri umani, ma non con itopi 34. I fursoli e gli esseri umani sono popolati da abbondanti cellule progenitrici neurali, mentre la zona subventricolare (SV) dei topi contiene solo progenitori neurali sparse21,32,35,36. A livello cellulare, i furetti presentano un'alta percentuale di un sottotipo di progenitori neurali denominati glia radiali basali o esterni (rispettivamente bRG o oRG), che sono considerati strumentali per l'espansione evolutiva della neocorteccia mammifera34,37,38. BRG sono quindi molto abbondanti nella neocorteccia di furetti umani ed embrionali fetali, ma sono molto rari nella neocorteccia di topo embrionale35,36. Inoltre, il furetto bRG mostra un'eterogeneità morfologica simile a quella della bRG umana, di gran lunga superiore al topo bRG21. Infine, a livello molecolare, lo sviluppo della neocorteccia di furetti mostra modelli di espressione genica molto simili a quelli della neocorteccia umana fetale, che si presume controllino lo sviluppo del ripiegamento corticale, tra le altrecose 39.
Le caratteristiche biologiche e molecolari delle cellule del furetto bRG le rendono altamente proliferative, simili a bRG umane. Ciò si traduce in una maggiore produzione di neuroni e lo sviluppo di una neocorteccia espansa e altamente complessa34. Queste caratteristiche rendono i furetti eccellenti organismi modello per lo studio delle caratteristiche umane dello sviluppo della neocorteccia che non possono essere modellate neitopi 26,40. Per sfruttare appieno il furetto come organismo modello è stato sviluppato il metodo presentato. Consiste nell'elettroporazione in utero di embrioni di furetti E33 con un plasmide che esprime GFP (pGFP) sotto il controllo di un promotore onnipresente, CAG. Gli embrioni elettroporati possono quindi essere analizzati embrionalmente o postnatalmente. Al fine di ridurre il numero di animali sacrificati, i furetti femminili (jills) vengono sterilizzati dall'isterectomia e donati per l'adozione come animali domestici. Se gli embrioni mirati vengono raccolti in fasi embrionali, viene eseguito un secondo intervento chirurgico e gli embrioni vengono rimossi da un taglio cesareo, mentre le jills sono isterectomizzate. Se gli embrioni mirati vengono analizzati in fasi postnatali, le jill vengono isterectomizzate dopo che i cuccioli sono stati svezzati o sacrificati. Quindi, viene presentato anche un protocollo per l'isterectomia delle jills.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Vicryl suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>V392ZG</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium spray</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>98017</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU)</td>
			<td>WDT</td>
			<td>6301</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cappilary holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MPH6S12</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexpanthenol Ointment solution</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>6029009.00.00</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape sheet 45x75cm</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>2513052</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Tweezer, platinum plated 5mm</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0489</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM830</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferret Mustela putorius furo</td>
			<td>Marshall</td>
			<td>NA</td>
			<td>Experimental organism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>KL1500LCD</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Allgaier instrumente</td>
			<td>08-033-130</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 3C-SA</td>
			<td>Rubis Tech</td>
			<td>3C-SA</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 55</td>
			<td>Dumostar</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 5-SA</td>
			<td>Rubis Tech</td>
			<td>5-SA</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze swabs large</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>401723</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze swabs small</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>401721</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Aves labs</td>
			<td>GFP1020</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length)</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Bela-pharm</td>
			<td>K4011-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad</td>
			<td>Hans Dinslage</td>
			<td>Sanitas SHK18</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine (Betadine solution 100 mg/ml)</td>
			<td>Meda</td>
			<td>997437</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran</td>
			<td>CP</td>
			<td>21311</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tips 20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#5242 956.003</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamizol</td>
			<td>WDT</td>
			<td>99012</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum dissecting scissors</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BC600R</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-GFP</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>From Kalebic et al., eLife, 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCNA antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CBL407</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10543</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>294200104</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Braun</td>
			<td>EP100</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2 antibody</td>
			<td>R+D Systems</td>
			<td>AF2018</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clamp 13cm</td>
			<td>WDT</td>
			<td>27080</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical double spoon (Williger)</td>
			<td>WDT</td>
			<td>27232</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>WDT</td>
			<td>28800</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors small</td>
			<td>FST</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suturing needle holder</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BM149R</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23345</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 3ml</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td>13439108</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation

La manipolazione dell'espressione genica in vivo durante lo sviluppo embrionale è il metodo di scelta quando si analizza il ruolo dei singoli geni durante lo sviluppo dei mammiferi. In utero l'elettroporazione è una tecnica chiave per la manipolazione dell'espressione genica nel cervello di mammifero embrionale in vivo. Qui viene presentato un protocollo per l'elettroporazione in utero della neocorteccia embrionale dei furetti, un piccolo carnivoro. Il furetto è sempre più utilizzato come modello per lo sviluppo della neocorteccia, perché la sua neocorteccia presenta una serie di caratteristiche anatomiche, istologiche, cellulari e molecolari che sono presenti anche nei primati umani e non umani, ma assenti nei modelli di roditori, come il topo o il ratto. In utero l'elettroporazione è stata eseguita al giorno embrionale (E) 33, uno stadio di midneurogenesi in furetto. Nell'elettroporazione in utero si rivolge alle cellule progenitrici neurali che rivestono i ventricoli successivi del cervello. Durante la neurogenesi, queste cellule progenitrici danno origine a tutti gli altri tipi di cellule neurali. Questo lavoro mostra risultati rappresentativi e analisi all'E37, giorno postnatale (P) 1 e P16, corrispondenti rispettivamente a 4, 9 e 24 giorni dopo l'elettroporazione in utero. Nelle fasi iniziali, la progenie delle cellule mirate è costituita principalmente da vari sottotipi di progenitori neurali, mentre nelle fasi successive la maggior parte delle cellule etichettate sono neuroni postmitotici. Così, in utero l'elettroporazione consente lo studio dell'effetto della manipolazione genetica sulle caratteristiche cellulari e molecolari di vari tipi di cellule neurali. Attraverso il suo effetto su varie popolazioni cellulari, in utero l'elettroporazione può essere utilizzata anche per la manipolazione delle caratteristiche istologiche e anatomiche della neocorteccia del furetto. È importante sottolineare che tutti questi effetti sono acuti e vengono eseguiti con una specificità spatiotemporale determinata dall'utente.

In utero l'elettroporazione dei furetti all'E33 ha portato al targeting delle cellule del progenitore neurale che rivestono la superficie ventricolare della neocorteccia embrionale (Figura 1). Queste cellule sono chiamate progenitori apici e sono altamente proliferative, dando origine a tutti gli altri tipi di cellule durante lo sviluppo. Sulla divisione asimmetrica, i progenitori apici hanno generato un altro progenitore afonico e una cellula più differenziata, tipicamente un progenitore b...

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In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Presentato qui è un protocollo per eseguire la manipolazione genetica nel cervello furetto embrionale utilizzando in utero elettroporazione. Questo metodo consente di indirizzare le cellule progenitrici neurali nella neocorteccia in vivo.

In Vivo Targeting di cellule progenitrici neurali in Ferret Neocortex di In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Questo protocollo ci permette di eseguire una manipolazione genetica in vivo in un modello animale chiave che ci permette di studiare l'espansione e la piegatura di una neocorteccia in via di sviluppo. Il principale vantaggio di questo metodo è nell'utilizzare un'elevata specificità spaziale e temporale nel colpire quelle cellule staminali neurali che sono il tipo di cellula chiave per lo sviluppo cerebrale. Prima di iniziare la procedura, tirare i capillari in vetro su un estrattore a micro pipetta e utilizzare le forcep per tagliare la parte distale del capillare per regolare il diametro della punta capillare.Il giorno 33 embrionale, aggiungere l'appropriata concentrazione di DNA in PBS, integrata con 0,1%Fast Green con miscelazione delicata, e posizionare un furetto femminile incinta a 3 ore, anestetizzato, su un tavolo operativo con un riscaldatore. Confermare il livello appropriato di sedazione toccando la pelle perioculare e pizzicando la pelle tra la seconda e la terza o la terza e la quarta dita dei piedi di entrambi gli arti posteriori. L'isoflurane può causare effetti avversi, tra cui nausea e vertigini.Quando si maneggia l'isoflurane in forma liquida, utilizzare l'attrezzatura di protezione. Durante l'intervento chirurgico, utilizzare contenitori appropriati per catturare il gas. Iniettare l'animale per via sottocutanea con analgesico, antibiotico e glucosio e posizionare un unguento sugli occhi dell'animale.Utilizzare i tosaerba per radere l'addome e pulire la pelle esposta con una soluzione di acqua, sapone e iodio. Quindi, asciugare la pelle con tamponi di garza e disinfettare con alcool e scrub allo iodio. Per l'elettroporazione in utero, posizionare un drappo sterile sull'animale e utilizzare un bisturi per fare un'incisione cutanea di circa 5 centimetri alla linea alba.Usa le forbici per tagliare lo strato muscolare e posizionare tamponi di garza intorno al sito di incisione. Bagnare la garza con PBS e posizionare l'utero sui tamponi. Utilizzando una pipetta con una punta lunga, caricare uno dei capillari di vetro tirato con 5 microlitri di soluzione di DNA per embrione da iniettare.Attaccare il capillare caricato a un supporto e collegare l'altro lato del supporto a un tubo e a un boccaglio. Individuare la testa del primo embrione e posizionare una sorgente luminosa in fibra ottica accanto alla testa. Utilizzando l'iride pigmentata come punto di riferimento, penetrare nella pelle, nel cranio e nel tessuto cerebrale con la punta del capillare di vetro e utilizzare la pipettazione della bocca per facilitare la consegna di 3-5 microlitri della soluzione di iniezione nel ventricolo di uno degli emisferi cerebrali.Poiché la soluzione iniettata contiene lo 0,1% di Verde veloce, un'iniezione riuscita comporterà una colorazione verde scuro del ventricolo iniettato, che ora sarà visibile come struttura a forma di rene. Dopo l'iniezione, posizionare gli elettrodi di pinzetta sull'utero sopra la testa dell'embrione con il polo positivo sopra l'area da prendere di mira e il polo negativo sotto l'area iniettata. Impostare la lunghezza dell'impulso dell'elettroporate su 50 millisecondi, la tensione dell'impulso su 100 volt, l'intervallo di impulsi su un secondo e il numero di impulsi su cinque.Una volta impostati tutti i parametri, premere Pulse" e far cadere rapidamente diverse gocce di PBS caldo sull'embrione elettroporato. Quando tutti gli embrioni sono stati elettroporati, riportare l'utero alla cavità peritoneale e utilizzare una sutura 4-0 per chiudere lo strato muscolare con il peritoneo. Chiudere la pelle in modo simile e coprire la ferita con spray all'alluminio.Quindi riportare l'animale nella sua gabbia con una fonte di calore e monitorare fino alla piena recumbency. Quattro giorni dopo l'elettroporazione al giorno 37 embrionale, la maggior parte delle cellule mirate e la loro progenie si trovano ancora nelle zone germinali e le cellule sono raramente osservate ulteriormente basalmente all'interno della piastra corticale. L'identità del progenitore può essere esaminata per immunofluorescenza per marcatori di cellule cicliche, come il PCNA, mentre un sottoinsieme di progenitori sottoposti a mitosi può essere mostrato da marcatori come fosfo-istone 3.Al giorno zero postnatale, otto giorni dopo l'elettroporazione, la progenie delle cellule mirate si diffuse in tutti gli strati istologici. Usando una combinazione di marcatori del fattore di trascrizione, possono essere rivelate diverse popolazioni di progenitori basali. Ad esempio, Sox2 è un marcatore di cellule progenitrici prolifeative, incluso il glia radiale basale.E la proteina cerebrale T-box 2 è un marcatore dei progenitori basali neurogenici, che sono principalmente progenitori intermedi. Entro il giorno 16 postnatale, la maggior parte delle cellule mirate smette di dividersi e differenziarsi in neuroni e glia, con la neocorteccia del giorno postnatale del furetto 16 che mostra il caratteristico schema pieghevole. L'elettroporazione in utero degli embrioni di furetto è un metodo estremamente potente per studiare la funzione dei geni.Ci ha permesso di studiare i geni che sono stati implicati nell'espansione della neocorteccia nell'evoluzione, compresi i geni specifici dell'uomo. E usando questo potente metodo, siamo stati davvero in grado di scoprire le caratteristiche chiave di come funzionava probabilmente l'espansione evolutiva della neocorteccia umana.

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