Name: blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Forfatterne takker Ava Zardynez for korrekturlæsning af manuskriptet. Dette arbejde støttes af Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) og Canada Foundation for Innovation for SL (32930) og af National Natural Science Foundation of China for Yujia Lin (81901576).

Alt dyrearbejde skal godkendes af den institutionelle og statslige etiske komité og dyrenes håndtering.  Dette er en ikke-overlevelse kirurgi.
1. Fremstilling af materialer
<ol><li>Der tilberedes 100 ml 70 % ethanol ved at blande 70 ml 100 % ethanol med 30 ml sterilt vand. Autoklave alle kirurgiske værktøjer før operationen og holde værktøjerne i 70% ethanol før og under operationen for at opretholde sterilisation.</li>
	<li>Gør et injektionsapparat klar.<ol>
<li>Skær ~ 30 cm poly...

<ol>
	<li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels.">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li><li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microlymphatics+and+lymph+flow.">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li><li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle.">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li><li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions,+measured+in+draining+lymph.">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li><li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels.">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li><li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation:+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct.">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism.">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread.">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li><li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens.">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li><li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules.">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li><li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex.">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li><li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone.">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li><li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression.">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li><li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GlyCAM-1,+an+endothelial+ligand+for+L-selectin,+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow.">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li><li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+organ+development:+from+ontogeny+to+neogenesis.">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li><li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment.">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li><li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice.">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route.">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li><li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema.">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).</li></ol>

Blokering lymfeknuder flow vil have brede anvendelser i at manipulere antigen levering til LN i sunde og syge betingelser. Det er muligt at bruge denne metode til at kontrollere timingen af antigen levering for at undersøge, hvordan kontinuerlig lymfeknuder flow regulerer immunrespons i dræning LNs. Denne metode til afbrydelse af lymfeflowet kan også bruges til at undersøge, hvordan lymfeknuder påvirker celleopdeling, celleaktivering, cellemigration og cellecelleinteraktioner i LN.
Mus, d...

Den rumlige organisering af lymfesystemet giver strukturel og funktionel støtte til effektivt at fjerne ekstracellulær væske og transportere antigener og antigen-præsenterende celler (APC'er) til de drænende LN'er. De første lymfekar (også kaldet lymfekapiller) er meget gennemtrængelige på grund af deres diskontinuerlige intercellulære vejkryds, som letter den effektive indsamling af væsker, celler og andre materialer fra omkringliggende ekstracellulære rum1. De første lymfekar fusionere i indsamling lymfekar, som har stramme intercellulære kryds, en kontinuerlig kælder membran, og lymfemuskel dækning. Indsamling lymfekar er ansvarlige for transport af indsamlede lymfeknuder til drænende LNs og i sidste ende vender tilbagelymfeknuder til omsætning 2,3. Indsamling lymfekar, der driver lymfeknuder ind i dræning LN er afferent lymfekar4,5,6,7. Obstruktion af afferente lymfekar kan blokere lymfestrømmen ind i LNs, hvilket er en nyttig teknik, når man studerer funktionen af lymfeknuder flow.
Tidligere undersøgelser har vist, at lymfeknuder flow spiller en væsentlig rolle i transport af antigener og APC'er, samt opretholde LN homøostase. Det er velkendt, at vævsbaserede APC'er, typisk aktiverede migrerende dendritiske celler (DCs), rejser gennem de affebende lymfekar til LN for at aktivere T-celler8. Tanken om, at frit-form antigener, såsom mikrober eller opløselige antigener, passivt flow med lymfeknuder til LN at aktivere LN-hjemmehørende APC'er har vundet accept i det seneste årti9,10,11,12. Free-form antigener rejser med lymfeknuder tage minutter efter infektionen til at rejse til LN, og LN-hjemmehørende celle aktivering kan forekomme inden for 20 min efter stimulation. Dette er meget hurtigere end aktivering af migrerende DC'er, som tager mere end 8 timer at komme ind i dræning LN9. Ud over at transportere antigener til at indlede immunbeskyttelse, lymfeknuder også bærer cytokiner og DC'er til LN at opretholde sin mikromiljø, og til at støtte immuncelle homøostase13,14. Tidligere viste blokering af lymfeknuder ved at suturere de afferente lymfekar, at lymfeknuder er nødvendige for at opretholde den HEV-fænotype, der kræves til støtte for homøostatisk T-celle og B-celle, derhovertil LN 15,16,17. CCL21 er en kritisk chemokine, der dirigerer DC og T celle positionering i LN8,18. Blokering af lymfeflow afbryder CCL21-udtrykket i LN og afbryder potentielt placeringen af DC- og T-celler og/eller interaktionen i LN19. Således, blokering lymfeknuder flow kan direkte eller indirekte ophæve antigen / DC adgang til dræning LN ved at forstyrre LN mikromiljø, der regulerer immunrespons i LN. For bedre at undersøge funktionen af lymfeflow præsenteres en eksperimentel protokol (Figur 1) for at blokere lymfestrømmen hos mus ved at suturere de afferente lymfekar fra fodpladen til pLN. Denne metode kan være en vigtig teknik til fremtidige undersøgelser af lymfefunktion i sunde og syge tilstande.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td></td>
			<td>University of Calgary distribution services UN1170.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>Nair Sensitive Formula Hair Removal Cr&#232;me with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>F7250-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connect one end of polyethylene tubing to 30G &#215; &#189; needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G &#215; &#189; needle. Insert the blunt end of the 30G &#215; &#189; needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 &#956;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Forcep straight</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14218-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Narketan</td>
			<td>DIN 02374994</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (26Gx3/8)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (30Gx1/2)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paton Needle Holder</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS6403</td>
			<td>Straight, Without Lock; Serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (1.25cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (2.5cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Davis and Geck CYANAMID Canada</td>
			<td>11/04</td>
			<td>0.7 metric monofilament polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1ml)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS scissors</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>14122-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>DIN02169606</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice

Lymfekar er afgørende for at opretholde vævsvæskebalancen og optimere immunbeskyttelsen ved at transportere antigener, cytokiner og celler til dræning af lymfeknuder (LNs). Afbrydelse af lymfeflow er en vigtig metode, når man studerer funktionen af lymfekar. De afferente lymfekar fra murine footpad til popliteal lymfeknuder (pLNs) er veldefineret som de eneste ruter for lymfedrænage i pLNs. Suturing disse afferente lymfekar kan selektivt forhindre lymfeknuder flow til pLNs. Denne metode giver mulighed for interferens i lymfeknuder flow med minimal skade på lymfe endotelceller i dræning pLN, den afferente lymfekar, samt andre lymfekar omkring området. Denne metode er blevet brugt til at undersøge, hvordan lymfeknuder påvirker høje endotel venler (HEV) og chemokine udtryk i LN, og hvordan lymfe strømmer gennem fedtvæv omkring LN i mangel af funktionelle lymfekar. Med den voksende anerkendelse af betydningen af lymfefunktion, vil denne metode har bredere anvendelser for yderligere at optrævle funktionen af lymfekar i reguleringen af LN mikromiljø og immunrespons.

Lymfekar sutur har været anvendt i tidligereundersøgelser 15,16,17,19, hvor det tjente som et vigtigt redskab til at studere funktionen af lymfeflow før molekylærbiologi af lymfekar var bedre forstået. Blokering lymfeknuder flow afbryder LN homøostase, hvilket fører til HEVs miste den kritiske genekspression er nødvendig for optimal lymfocyt homing til LN15,...

Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

En protokol til at blokere lymfeflow ved kirurgisk sutur af afferent lymfekar præsenteres.

Blokering Lymfeknuder Flow ved suturering afferent lymfekar i mus

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Denne metode afbryder lymfeknuder flow med minimal skade på lymfe endotelceller, og med præcis kontrol af blokade timing, kan det bruges til at undersøge, hvordan lymfeflow påvirker homøostase og immunrespons i lymfeknuden. Bidrage til at demonstrere proceduren vil være Jingna Xue, en kandidat studerende fra mit laboratorium. For at forberede en injektion apparat, skæres ca 30 centimeter af polyethylen slanger.Tilslut spidsen af nålen A til den ene ende af slangen. Forsigtigt løsne en anden nål, og tilslut den knækkede side til den anden ende af polyethylen slanger. Fastgør derefter kanylen A til en en milliliter tuberkulinsprøjte.Umiddelbart før brug, forberede en 10:1 ketamin-xylazine blanding i saltvand. Efter bedøvelse af musen ved at injicere 250 mikroliter af ketamin / xylazin blandingen intraperitoneally, sikre fuld bedøvelse med en tå knivspids. Barber pelsen omkring benene med hårklippere, og påfør derefter hårfjerningscreme omkring benet.Efter fem minutter tørres den resterende pels og hårfjerningscremen af med et fugtigt væv, og benet rengøres derefter med sterilt vand. Spray 70% ethanol omkring benet for at sterilisere arbejdsområdet. Placer musen i en udsat position, og brug kirurgisk tape til at eksponere operationsområdet på højre ben.Intradermally injicere fem mikroliter af 1% Evans blå farvestof, eller ni centimeter af væsken fra injektion apparat slange i højre fodpude af musen. Masser forsigtigt fodpladen for at hjælpe væsken ind i lymfekar. Under et dissekerende mikroskop skal du finde et indsnitssted fem millimeter fra den nederste kant af poplitealfossa.Ved hjælp af en saks, lave et lille snit cirka fem millimeter i længden. Brug derefter fine operation kraftaser til at strække snittet og udsætte indsamling lymfekar. Identificer begge de afferente lymfekar, der fører til popliteal lymfeknuder.Ved hjælp af en nåleholder skal du forsigtigt indsætte suturnålen mellem de afferente lymfekar og den saphenøse arterie. Træk forsigtigt nålen ud omkring de afferente lymfekar. Træk forsigtigt i suturstrengen, hvilket efterlader omkring to centimeter af suturstrengen bagved.Brug kanyleholderen til at binde en kirurgs knude. Masser forsigtigt fodpuden for at sikre, at ingen Evans blå farvestof passerer suturstedet, og skær derefter den overskydende snor med en saks. Sutur de andre afferente lymfekar, derefter lukke huden snit med samme sutur, der blev brugt til lymfekar.For fingeret kontrol, intradermalt injicere fem mikroliter af 1% Evans blå farvestof i venstre fod pad, og massage foden pad. Åbn huden med et snit, og luk derefter såret uden at suturering fartøjet. Når du overvåger musen efter operationen, bør højre ben vise ødem, med Evans blå farvestof breder sig til låret, mens kontrolbenet vil vise Evans blå farvestof begrænset til foden pad.Umiddelbart efter operationen injicerer intradermalt 10 mikroliter af 2% FITC i både højre fodpude og venstre. To, seks og 12 timer efter INJEKTION AF FITC indsamles popliteal lymfeknuder fra fossa af aflivede mus. Fjern forsigtigt perinodal fedtvævet omkring pLN'erne.Integrer pLN'erne i optimal skæretemperaturforbindelse med medullær sinusområdet, der vender mod siden af kryoformen. Brug en kryotomi til at forberede 20-mikron frosne sektioner. For at bestemme FITC-fordelingen i pLN'erne skal du afbilde kryosektionerne under et konfokalt mikroskop.Konfokale billeder taget to, seks og 12 timer efter FITC injektion viser væsentligt reduceret FITC ophobning i popliteal lymfeknuder efter suturering af afferent lymfekar. Den resterende FITC i pLNs blev fortrinsvis akkumuleret i lymfeknude bihuler. Konfokale billeder af perinodal fedtvæv viser, når lymfekar er blokeret ved suturering, FITC kommer ind i vævet, når lymfeknuden bihuler, men det er ikke effektivt fordelt over hele lymfeknuder.Når du forsøger denne metode, er det vigtigt at huske, at indsætte suturnålen mellem blodkar og lymfekar er kritisk. Hvis dette trin ikke er på kan knækkes. Efter at have udført denne metode, er det muligt at immunisere mus med infektion eller anden immun stimulation til at undersøge, hvordan lymfeflow regulerer immunbeskyttelse.Funktionen af lymfeflow er ikke godt forstået. Denne metode kan bruges til at studere celle migrationer i lymfeknuden i mangel af lymfeknuder flow.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Den mesenterielymfeknuderne Duct kanyle Rat Model: Ansøgning om vurdering af intestinal lymfatisk Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilation af isoleret Fartøjer og isoleringen af ​​den ekstracellulære matrix af Tight-hud Mus

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Intracellulær Farvning og flowcytometri at identificere lymfocytundergrupper inden Murine Aorta, Nyre og lymfeknuder i en model af hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Dyb venøs trombose induceret af Stasis i mus overvåges af høj frekvens ultralyd

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Fordøjelsen af Murine leveren en Flow Cytometric analyse af lymfatisk Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Bestemmelse af regulerende T celle Subsets i Murine Thymus, pancreas afdrypning lymfeknude og milten ved hjælp af flowcytometri

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...