Name: blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

De auteurs danken Ava Zardynezhad voor het proeflezen van het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door het Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) en de Canada Foundation for Innovation for SL (32930) en de National Natural Science Foundation of China voor Yujia Lin (81901576).

Al het dierwerk moet worden goedgekeurd door de instellings- en overheidsethiek en het comité voor de behandeling van dieren.  Dit is een niet-overlevingsoperatie.
1. Bereiding van materialen
<ol><li>Bereid 100 mL ethanol van 70% voor door 70 mL 100% ethanol te mengen met 30 mL steriel water. Autoclave alle chirurgische instrumenten voor de operatie en houd de tools in 70% ethanol voor en tijdens de operatie om sterilisatie te handhaven.</li>
	<li>Bereid een injectieapparaat voor.<ol>
<li>...

<ol>
	<li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels.">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li><li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microlymphatics+and+lymph+flow.">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li><li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle.">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li><li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions,+measured+in+draining+lymph.">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li><li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels.">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li><li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation:+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct.">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism.">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread.">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li><li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens.">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li><li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules.">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li><li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex.">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li><li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone.">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li><li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression.">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li><li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GlyCAM-1,+an+endothelial+ligand+for+L-selectin,+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow.">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li><li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+organ+development:+from+ontogeny+to+neogenesis.">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li><li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment.">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li><li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice.">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route.">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li><li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema.">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).</li></ol>

Het blokkeren van lymfestroom zal brede toepassingen hebben bij het manipuleren van antigeenlevering aan de LN in gezonde en zieke omstandigheden. Het is mogelijk om deze methode te gebruiken om de timing van de levering van antigeen te controleren om te bestuderen hoe continue lymfestroom de immuunrespons regelt bij het aftappen van LNs. Deze methode van lymfestroom onderbreking kan ook worden gebruikt om te bestuderen hoe lymfe effecten cel compartimentalisatie, celactivering, celmigratie, en celcel interacties in de L...

De ruimtelijke organisatie van het lymfestelsel biedt structurele en functionele ondersteuning om extracellulaire vloeistof efficiënt te verwijderen en antigenen en antigeen-presenterende cellen (APC's) naar de drainerende LN's te transporteren. De eerste lymfevaten (ook wel lymfekapillaries genoemd) zijn zeer doorlatend vanwege hun discontinu intercellulaire knooppunten, die de effectieve verzameling van vloeistoffen, cellen en andere materialen uit omliggende extracellulaire ruimten1vergemakkelijken. De eerste lymfevaten fuseren tot het verzamelen van lymfevaten, die strakke intercellulaire knooppunten, een continu keldermembraan en lymfespierdekking hebben. Het verzamelen van lymfevaten zijn verantwoordelijk voor het transport van verzamelde lymfe naar de drainerende LNs en uiteindelijk terug te keren lymfe naar de circulatie2,3. De verzamelende lymfevaten die lymfe in de drainerende LN voortdrijven zijn de afferente lymfevaten4,5,6,7. Obstructie van afferent lymfevaten kan de lymfestroom in de LNs blokkeren, wat een nuttige techniek is bij het bestuderen van de functie van lymfestroom.
Eerdere studies hebben aangetoond dat lymfestroom een belangrijke rol speelt bij het transport van antigenen en APC's, evenals het behoud van LN homeostase. Het is goed begrepen dat weefsel-afgeleide APC's, meestal geactiveerd migrerende dendritische cellen (DC's), reizen door de afferent lymfevaten naar de LN te activeren T-cellen8. Het idee dat antigenen in vrije vorm, zoals microben of oplosbare antigenen, passief met lymfe naar het LN stromen om LN-resident APC's te activeren, is in het afgelopen decennium 9,10,11,12. Antigenen in vrije vorm die met lymfe reizen, duren enkele minuten na de infectie om naar de LN te reizen en de LN-resident celactivering kan binnen 20 minuten na de stimulatie optreden. Dit is veel sneller dan de activering van migrerende DC's, die meer dan 8 uur duurt om de drainerende LN9in te voeren. Naast het vervoer van antigenen om immuunbescherming te starten, draagt lymfe ook cytokines en DC's naar de LN om zijn micro-omgeving te behouden en om immuuncelhomeostase13,14te ondersteunen . Eerder, het blokkeren van lymfestroom door het hechten van de afferent lymfevaten aangetoond dat lymfe nodig is om de HEV fenotype dat nodig is voor de ondersteuning van homeostatische T-cel en B-cel homing aan de LN15,16,17te handhaven . CCL21 is een kritieke chemokine die dc- en T-celpositionering in de LN8,18regisseert. Het blokkeren van lymfestroom onderbreekt CCL21-expressie in de LN en onderbreekt mogelijk dc- en T-celpositionering en/of interactie in de LN19. Zo kan het blokkeren van lymfestroom direct of indirect antigeen/DC-toegang tot de drainerende LN intrekken door de LN-micro-omgeving te verstoren die de immuunresponsen in de LN reguleert. Om de functie van lymfestroom beter te onderzoeken, wordt een experimenteel protocol gepresenteerd (Figuur 1) om de lymfestroom bij muizen te blokkeren door de affenerende lymfevaten van het voetpad naar de pLN te hechten. Deze methode kan een belangrijke techniek zijn voor toekomstige studies over lymfefunctie bij gezonde en zieke aandoeningen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td></td>
			<td>University of Calgary distribution services UN1170.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>Nair Sensitive Formula Hair Removal Cr&#232;me with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>F7250-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connect one end of polyethylene tubing to 30G &#215; &#189; needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G &#215; &#189; needle. Insert the blunt end of the 30G &#215; &#189; needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 &#956;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Forcep straight</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14218-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Narketan</td>
			<td>DIN 02374994</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (26Gx3/8)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (30Gx1/2)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paton Needle Holder</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS6403</td>
			<td>Straight, Without Lock; Serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (1.25cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (2.5cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Davis and Geck CYANAMID Canada</td>
			<td>11/04</td>
			<td>0.7 metric monofilament polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1ml)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS scissors</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>14122-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>DIN02169606</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice

Lymfevaten zijn van cruciaal belang bij het handhaven van de balans van weefselvloeistof en het optimaliseren van de immuunbescherming door het vervoer van antigenen, cytokines en cellen naar drainerende lymfeklieren (LN's). Onderbreking van de lymfestroom is een belangrijke methode bij het bestuderen van de functie van lymfevaten. De afferente lymfevaten van het murine voetpad tot de popliteale lymfeklieren (pLN's) zijn goed gedefinieerd als de enige routes voor lymfedrainage in de pLN's. Het hechten van deze afferente lymfevaten kan selectief voorkomen lymfestroom naar de pLN's. Deze methode zorgt voor interferentie in de lymfestroom met minimale schade aan de lymfe-endotheelcellen in de drainerende pLN, de afferente lymfevaten, evenals andere lymfevaten rond het gebied. Deze methode is gebruikt om te bestuderen hoe lymfe hoge endotheelvenules (HEV) en chemokine expressie in de LN beïnvloedt, en hoe lymfe stroomt door het vetweefsel rond de LN bij afwezigheid van functionele lymfevaten. Met de groeiende erkenning van het belang van lymfefunctie, zal deze methode bredere toepassingen hebben om de functie van lymfevaten verder te ontrafelen bij het reguleren van de LN-micro-omgeving en immuunresponsen.

Lymfevat hechting is gebruikt in eerdere studies15,16,17,19, waar het diende als een belangrijk instrument om de functie van lymfestroom te bestuderen voordat de moleculaire biologie van lymfevaten beter werd begrepen. Het blokkeren van lymfestroom onderbreekt LN homeostase, wat leidt tot HEV's verliezen van de kritische genexpressie die nodig is voor een optimale lymfocyten homing aan de LN<su...

Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Een protocol om lymfestroom te blokkeren door chirurgische hechting van afferent lymfevaten wordt gepresenteerd.

Het blokkeren van lymfestroom door het hechten van Afferent Lymfatische bloedvaten in muizen

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Deze methode onderbreekt de lymfestroom met minimale schade aan lymfe-endotheelcellen, en met nauwkeurige controle van de blokkadetiming, kan het worden gebruikt om te bestuderen hoe lymfestroom homeostase en immuunreacties in de lymfeklier beïnvloedt. Helpen om de procedure aan te tonen zal Jingna Xue, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om een injectieapparaat voor te bereiden, snijdt u ongeveer 30 centimeter polyethyleenbuizen.Sluit het puntje van de naald A aan op het ene uiteinde van de slang. Maak voorzichtig een andere naald los en sluit de gebroken kant aan het andere uiteinde van polyethyleenbuizen. Bevestig vervolgens naald A aan een tuberculinspuit van één milliliter.Bereid onmiddellijk voor gebruik een 10:1 ketamine-xylazinemengsel in zoutoplossing. Na het verdoven van de muis door het injecteren van 250 microliters van de ketamine / xylazine mengsel intraperitoneally, zorgen voor volledige verdoving met een teen snuifje. Scheer de vacht rond de benen met haarknippers en breng vervolgens ontharingscrème rond het been aan.Na vijf minuten, veeg de resterende vacht en de ontharingscrème met behulp van een vochtig weefsel, dan schoon het been met steriel water. Spray 70% ethanol rond het been om het operatiegebied te steriliseren. Plaats de muis in een gevoelige positie en gebruik chirurgische tape om het operatiegebied op het rechterbeen bloot te leggen.Intradermally injecteren vijf microliters van 1%Evans blauwe kleurstof, of negen centimeter van de vloeistof uit het injectieapparaat buizen in de rechter voetpad van de muis. Masseer het voetpad voorzichtig om de vloeistof in de lymfevaten te laten komen. Zoek onder een ontledenmicroscoop een incisieplaats van vijf millimeter vanaf de onderrand van de popliteal fossa.Met behulp van een schaar, maak een kleine incisie ongeveer vijf millimeter in lengte. Gebruik vervolgens fijne werking tangen om de incisie te rekken en bloot de verzamelende lymfevaten. Identificeer beide afferente lymfevaten die leiden tot de popliteale lymfeklieren.Met behulp van een naaldhouder, voorzichtig steek de hechtaald tussen de afferent lymfevaten en de saphenous slagader. Trek de naald voorzichtig uit rond de afferente lymfevaten. Trek voorzichtig aan de hechtsnaar, waardoor ongeveer twee centimeter van de hechtsnaar achterblijft.Gebruik de naaldhouder om de knoop van een chirurg te binden. Masseer het voetkussen voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen Evans blauwe kleurstof de hechtplaats passeert en snijd vervolgens de overtollige snaar met een schaar. Hecht de andere afferente lymfevaten en sluit vervolgens de huidincisie met dezelfde hechting die werd gebruikt voor de lymfevaten.Voor de sham controle, intradermally injecteren vijf microliters van 1%Evans blauwe kleurstof in de linker voet pad, en masseer het voetpad. Open de huid met een incisie en sluit de wond zonder het vat te hechten. Bij het toezicht op de muis na de operatie, moet het rechterbeen tonen oedeem, met Evans blauwe kleurstof verspreiden naar de dij, terwijl de controle been zal Evans blauwe kleurstof beperkt tot het voetkussen te tonen.Onmiddellijk na de operatie, intradermally injecteren 10 microliters van 2%FITC in zowel de rechter voet pad en de linkerkant. Twee, zes en 12 uur na de injectie met FITC verzamelen de popliteale lymfeklieren van de fossa van geëuthanaseerde muizen. Verwijder voorzichtig het perinodal vetweefsel rond de pNN's.Sluit de pLNs in optimale snijtemperatuurverbinding met het medullaire sinusgebied dat naar de zijkant van de cryomal wordt gericht. Gebruik een cryotoom om bevroren secties van 20 micron voor te bereiden. Om de FITC-verdeling in de pLN's te bepalen, beeldt u de cryo-secties onder een confocale microscoop.Confocale beelden vastgelegd twee, zes en 12 uur na FITC injectie tonen aanzienlijk verminderde FITC accumulatie in de popliteale lymfeklieren na het hechten van de afferent lymfevaten. De resterende FITC in de pNN's werd bij voorkeur opgehoopt in de lymfeklier sinussen. Confocale beelden van het perinodal vetweefsel laten zien wanneer lymfevaten worden geblokkeerd door hechting, FITC het weefsel binnenkomt wanneer de lymfeklier sinussen, maar het is niet effectief verspreid over de lymfeklieren.Bij een poging tot deze methode, is het belangrijk om te onthouden dat het inbrengen van de hechtaaldaald tussen het bloedvat en het lymfevat is van cruciaal belang. Het uitvallen van deze stap kan de vaten breken. Na het uitvoeren van deze methode is het mogelijk om muizen te immunize met infectie of andere immuunstimulatie om te bestuderen hoe lymfestroom immuunbescherming reguleert.De functie van lymfestroom is niet goed begrepen. Deze methode kan worden gebruikt om celmigraties in de lymfeklier te bestuderen bij afwezigheid van lymfeklier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Niet-chirurgische intratracheale Instillatie van Muizen met Analyse van de longen en Lung drainerende lymfeklieren door middel van flowcytometrie

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

De Mesenteriale Lymfe Duct gecanuleerde Rat Model: Toepassing op de beoordeling van Intestinal Lymfatische Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilatatie van geïsoleerde Schepen en de isolatie van de extracellulaire matrix van Tight-skin Muizen

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Intracellulaire kleuring en flowcytometrie om lymfocyten in muizen Aorta, nieren en lymfeklieren te identificeren in een Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Diep-veneuze trombose geïnduceerd door Stasis in muizen gecontroleerd door hoge frequentie Ultrasonografie

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Spijsvertering van de lymfkliertest lever voor een analyse van de cytometrische stroom van lymfatische endotheliale cellen

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...