Name: blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Les auteurs remercient Ava Zardynezhad pour la relecture du manuscrit. Ces travaux sont appuyés par l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC, PJT-156035), la Fondation canadienne pour l’innovation pour la SL (32930) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour Yujia Lin (81901576).

Tous les travaux sur les animaux doivent être approuvés par le comité institutionnel et gouvernemental d’éthique et de manipulation des animaux.  C’est une opéra tion de non-survie.
1. Préparation des matériaux
<ol><li>Préparer 100 mL d’éthanol à 70 % en mélangeant 70 mL d’éthanol à 100 % avec 30 mL d’eau stérile. Autoclave tous les outils chirurgicaux avant la chirurgie et garder les outils dans 70% d’éthanol avant et pendant la chirurgie pour maintenir la stéri...

<ol>
	<li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels.">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li><li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microlymphatics+and+lymph+flow.">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li><li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle.">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li><li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions,+measured+in+draining+lymph.">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li><li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism.">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread.">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li><li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens.">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li><li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules.">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li><li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex.">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li><li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone.">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li><li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression.">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li><li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GlyCAM-1,+an+endothelial+ligand+for+L-selectin,+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow.">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li><li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+organ+development:+from+ontogeny+to+neogenesis.">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li><li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment.">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li><li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice.">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route.">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li><li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema.">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).</li></ol>

Le blocage du flux lymphatique aura de larges applications dans la manipulation de l’administration d’antigènes au LN dans des conditions saines et maladies. Il est possible d’utiliser cette méthode pour contrôler le moment de l’administration d’antigènes afin d’étudier comment le flux lymphatique continu régule la réponse immunitaire dans l’évacuation des LN. Cette méthode d’interruption du flux lymphatique peut également être utilisée pour étudier comment la lymphe influe sur la compartimen...

L’organisation spatiale du système lymphatique fournit un soutien structurel et fonctionnel pour éliminer efficacement le liquide extracellulaire et transporter les antigènes et les cellules présentant des antigènes (APC) vers les LN drainants. Les vaisseaux lymphatiques initiaux (également appelés capillaires lymphatiques) sont hautement perméables en raison de leurs jonctions intercellulaires discontinues, qui facilitent la collecte efficace des fluides, des cellules et d’autres matériaux des espaces extracellulairesenvironnants 1. Les vaisseaux lymphatiques initiaux fusionnent dans la collecte des vaisseaux lymphatiques, qui ont des jonctions intercellulaires serrées, une membrane continue de sous-sol, et la couverture lymphatique de muscle. La collecte des vaisseaux lymphatiques sont responsables du transport de la lymphe recueillie vers les LN drainants et, éventuellement, le retour de la lymphe à la circulation2,3. Les vaisseaux lymphatiques de collecte qui propulsent la lymphe dans le LN drainant sont les vaisseaux lymphatiques afferents4,5,6,7. L’obstruction des vaisseaux lymphatiques afferents peut bloquer le flux lymphatique dans les LNs, qui est une technique utile lors de l’étude de la fonction du flux lymphatique.
Des études antérieures ont montré que le flux lymphatique joue un rôle important dans le transport des antigènes et des APC, ainsi que dans le maintien de l’homéostasie du LN. Il est bien entendu que les APC dérivés des tissus, généralement activés cellules dendritiques migration (CD), voyagent à travers les vaisseaux lymphatiques afferents vers le LN pour activer les lymphocytes T8. L’idée que les antigènes de forme libre, tels que les microbes ou les antigènes solubles, s’écoulent passivement avec la lymphe vers le LN pour activer les APC résidents de LN a gagné l’acceptation au cours dela dernière décennie 9,10,11,12. Les antigènes de forme libre voyageant avec la lymphe prennent quelques minutes après l’infection pour se rendre au LN, et l’activation cellulaire ln-résidente peut se produire dans les 20 minutes après la stimulation. C’est beaucoup plus rapide que l’activation des CD migrateurs, qui prend plus de 8 h pour entrer dans le LN9 drainant. En plus de transporter des antigènes pour initier la protection immunitaire, la lymphe transporte également des cytokines et des DCs au LN pour maintenir son microenvironnement, et pour soutenir l’homéostasie de cellulesimmunitaires 13,14. Auparavant, le blocage du flux lymphatique en suturant les vaisseaux lymphatiques afferents a démontré que la lymphe est nécessaire pour maintenir le phénotype HEV nécessaire pour soutenir la cellule T homéostatique et la cellule B homing à la LN15,16,17. CCL21 est une chimiokine critique qui dirige le positionnement des cellules DC et T dans le LN8,18. Le blocage du flux lymphatique interrompt l’expression du CCL21 dans le LN et interrompt potentiellement le positionnement et/ou l’interaction des cellules DC et T dans le LN19. Ainsi, le blocage du flux lymphatique peut abroger directement ou indirectement l’accès à l’antigène/DC au LN drainant en perturbant le microenvironnement LN qui régule les réponses immunitaires dans le LN. Pour mieux étudier la fonction du flux lymphatique, un protocole expérimental est présenté (figure 1) pour bloquer le flux lymphatique chez la souris en suturant les vaisseaux lymphatiques afferents du pied au pLN. Cette méthode peut être une technique importante pour de futures études sur la fonction lymphatique dans des conditions saines et maladies.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td></td>
			<td>University of Calgary distribution services UN1170.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>Nair Sensitive Formula Hair Removal Cr&#232;me with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>F7250-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connect one end of polyethylene tubing to 30G &#215; &#189; needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G &#215; &#189; needle. Insert the blunt end of the 30G &#215; &#189; needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 &#956;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Forcep straight</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14218-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Narketan</td>
			<td>DIN 02374994</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (26Gx3/8)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (30Gx1/2)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paton Needle Holder</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS6403</td>
			<td>Straight, Without Lock; Serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (1.25cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (2.5cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Davis and Geck CYANAMID Canada</td>
			<td>11/04</td>
			<td>0.7 metric monofilament polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1ml)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS scissors</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>14122-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>DIN02169606</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice

Les vaisseaux lymphatiques sont essentiels au maintien de l’équilibre des fluides tissulaires et à l’optimisation de la protection immunitaire en transportant des antigènes, des cytokines et des cellules vers les ganglions lymphatiques drainants (LN). L’interruption du flux lymphatique est une méthode importante lors de l’étude de la fonction des vaisseaux lymphatiques. Les vaisseaux lymphatiques afferents du pied murin aux ganglions lymphatiques popliteal (pLNs) sont bien définis comme les seules voies pour le drainage lymphatique dans les pLN. Le suturing ces vaisseaux lymphatiques afferents peut sélectivement empêcher le flux lymphatique aux pLNs. Cette méthode permet d’interférer dans le flux lymphatique avec des dommages minimes aux cellules endothéliales lymphatiques dans le pLN drainant, les vaisseaux lymphatiques afferents, ainsi que d’autres vaisseaux lymphatiques autour de la région. Cette méthode a été utilisée pour étudier comment la lymphe affecte les venules endothéliales élevées (HEV) et l’expression de chimiokine dans le LN, et comment la lymphe coule par le tissu adipeux entourant le LN en l’absence des vaisseaux lymphatiques fonctionnels. Avec la reconnaissance croissante de l’importance de la fonction lymphatique, cette méthode aura des applications plus larges pour démêler davantage la fonction des vaisseaux lymphatiques dans la régulation du microenvironnement LN et des réponses immunitaires.

Suture des vaisseaux lymphatiques a été utilisé dans les étudesprécédentes 15,16,17,19, où il a servi d’outil important pour étudier la fonction du flux lymphatique avant la biologie moléculaire des vaisseaux lymphatiques a été mieux compris. Le blocage du flux lymphatique interrompt l’homéostasie LN, ce qui conduit à hevs perdre l’expression génétique critique nécessaire ...

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Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Un protocole pour bloquer le flux lymphatique par suturing chirurgical des vaisseaux lymphatiques afferents est présenté.

Blocage du flux lymphatique par suturing vaisseaux lymphatiques afferent chez la souris

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Cette méthode interrompt le flux lymphatique avec un minimum de dommages aux cellules endothéliales lymphatiques, et avec un contrôle précis du moment du blocus, il peut être utilisé pour étudier comment le flux lymphatique affecte l’homéostasie et les réponses immunitaires dans le ganglion lymphatique. Jingna Xue, étudiante diplômée de mon laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Pour préparer un appareil d’injection, couper environ 30 centimètres de tube de polyéthylène.Connectez la pointe de l’aiguille A à une extrémité du tube. Déloger soigneusement une autre aiguille et relier le côté cassé à l’autre extrémité du tube de polyéthylène. Fixez ensuite l’aiguille A à une seringue à tuberculine d’un millilitre.Immédiatement avant l’utilisation, préparer un mélange kétamine-xylazine 10:1 en solution saline. Après anesthésier la souris en injectant 250 microlitres du mélange kétamine/xylazine intraperitoneally, assurer l’anesthésie complète avec une pincée d’orteil. Raser la fourrure autour des jambes avec des tondeuses à cheveux, puis appliquer de la crème depilatory autour de la jambe.Après cinq minutes, essuyer la fourrure résiduelle et la crème depilatory à l’aide d’un tissu humide, puis nettoyer la jambe avec de l’eau stérile. Vaporiser 70% d’éthanol autour de la jambe pour stériliser la zone d’opération. Placez la souris dans une position couchée, et utilisez du ruban chirurgical pour exposer la zone d’opération sur la jambe droite.Intradermally injecter cinq microlitres de 1%Evans colorant bleu, ou neuf centimètres du fluide de l’appareil d’injection tube dans le coussin du pied droit de la souris. Masser doucement le pavé pour aider le fluide à pénétrer dans les vaisseaux lymphatiques. Sous un microscope disséquant, localiser un site d’incision à cinq millimètres du bord inférieur de la fossa popliteal.À l’aide d’une paire de ciseaux, faire une petite incision d’environ cinq millimètres de longueur. Ensuite, utilisez des forceps d’opération fine pour étirer l’incision et exposer les vaisseaux lymphatiques de collecte. Identifier les deux vaisseaux lymphatiques afferents menant aux ganglions lymphatiques popliteal.À l’aide d’un porte-aiguille, insérez prudemment l’aiguille de suture entre les vaisseaux lymphatiques afferents et l’artère saphenous. Tirez doucement l’aiguille autour des vaisseaux lymphatiques afferents. Tirez soigneusement la corde de suture, en laissant environ deux centimètres de la corde de suture derrière.Utilisez le porte-aiguille pour aider à attacher le nœud d’un chirurgien. Masser doucement le coussin pour les pieds pour s’assurer qu’aucun colorant bleu Evans ne passe devant le site de suture, puis coupez l’excédent de ficelle avec des ciseaux. Suture les autres vaisseaux lymphatiques afferents, puis fermer l’incision cutanée avec la même suture qui a été utilisé pour les vaisseaux lymphatiques.Pour le contrôle factice, intradermally injecter cinq microlitres de 1%Evans colorant bleu dans le coussin du pied gauche, et masser le coussin pour les pieds. Ouvrez la peau avec une incision, puis fermez la plaie sans suturing le navire. Lors de la surveillance de la souris après la chirurgie, la jambe droite devrait montrer l’oedème, avec evans colorant bleu s’étendant à la cuisse, tandis que la jambe de contrôle montrera Evans colorant bleu limité à la garniture du pied.Immédiatement après la chirurgie, injectez intradermally 10 microlitres de 2%FITC dans le coussin droit de pied et la gauche. Deux, six et 12 heures après l’injection de FITC, recueillent les ganglions lymphatiques popliteal des fossa des souris euthanasiées. Retirez soigneusement le tissu adipeux périodal autour des pLN.Intégrer les pLN dans le composé optimal de température de coupe avec la zone médullaire de sinus faisant face au côté du moule de cryo. Utilisez un cryotome pour préparer des sections congelées de 20 microns. Pour déterminer la distribution du FITC dans les pLN, imagez les cryo-sections sous un microscope confocal.Les images confocales capturées deux, six et 12 heures après injection de FITC montrent l’accumulation sensiblement réduite de FITC dans les ganglions lymphatiques popliteal après avoir suturing les vaisseaux lymphatiques afferents. Le FITC résiduel dans les pLNs a été préférentiellement accumulé dans les sinus de ganglion lymphatique. Les images confocales du tissu adipeux périodal montrent quand les vaisseaux lymphatiques sont bloqués par suturing, FITC entre dans le tissu quand les sinus de ganglion lymphatique, mais il n’est pas efficacement distribué dans les ganglions lymphatiques.Lorsque vous essayez cette méthode, il est important de se rappeler que l’insertion de l’aiguille de suture entre le vaisseau sanguin et le vaisseau lymphatique est essentielle. La défaillance de cette étape peut briser les navires. Après avoir effectué cette méthode, il est possible d’immuniser les souris atteintes d’une infection ou d’une autre stimulation immunitaire pour étudier comment le flux lymphatique régule la protection immunitaire.La fonction du flux lymphatique n’est pas bien comprise. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les migrations cellulaires dans le ganglion lymphatique en l’absence de flux lymphatique.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mesure de l&#39;activité calpaïne dans des cellules fixées et de la Vie par cytométrie en flux

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Recherche

Immunologie et infection

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Non-chirurgicale instillation intratrachéale de souris avec analyse des poumons et les ganglions lymphatiques drainant poumon par cytométrie en flux

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Le lymphatiques mésentériques Duct Cannulated Rat Modèle: application à l&#39;évaluation des lymphatique intestinale transport des médicaments

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilatation des vaisseaux isolés et l&#39;isolement de la matrice extracellulaire de souris Tight-peau

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Intracellulaires Coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin Aorte, Reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de l&#39;hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Thrombose veineuse profonde induite par stase chez les souris surveillé par échographie de haute fréquence

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs dans le Thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate à l’aide de cytométrie en flux

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...