Name: blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Die Autoren danken Ava Zardynezhad für das Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wird vom Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) und der Canada Foundation for Innovation for SL (32930) und der National Natural Science Foundation of China für Yujia Lin (81901576) unterstützt.

Alle Tierarbeit muss vom Institutionellen und staatlichen Ethik- und Tierschutzausschuss genehmigt werden.  Dies ist eine Nicht-Überlebens-Operation.
1. Herstellung von Materialien
<ol><li>Bereiten Sie 100 ml 70% Ethanol vor, indem Sie 70 ml 100% Ethanol mit 30 ml sterilem Wasser mischen. Autoclave alle chirurgischen Werkzeuge vor der Operation und halten Sie die Werkzeuge in 70% Ethanol vor und während der Operation, um die Sterilisation aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Inj...

<ol>
	<li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels.">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li><li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microlymphatics+and+lymph+flow.">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li><li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle.">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li><li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions,+measured+in+draining+lymph.">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li><li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels.">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li><li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation:+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct.">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism.">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread.">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li><li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens.">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li><li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules.">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li><li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex.">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li><li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone.">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li><li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression.">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li><li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GlyCAM-1,+an+endothelial+ligand+for+L-selectin,+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow.">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li><li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+organ+development:+from+ontogeny+to+neogenesis.">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li><li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment.">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li><li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice.">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route.">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li><li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema.">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).</li></ol>

Die Blockierung des Lymphflusses wird breite Anwendungen bei der Manipulation der Antigenabgabe an die LN unter gesunden und kranken Bedingungen haben. Es ist möglich, diese Methode zu verwenden, um den Zeitpunkt der Antigenabgabe zu kontrollieren, um zu untersuchen, wie der kontinuierliche Lymphfluss die Immunantwort bei entleerenden LNs reguliert. Diese Methode der Lymphflussunterbrechung kann auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie Lymphauswirkungen Zellkompartalisation, Zellaktivierung, Zellmigration und Zell-...

Die räumliche Organisation des Lymphsystems bietet strukturelle und funktionelle Unterstützung, um extrazelluläre Flüssigkeit effizient zu entfernen und Antigene und Antigen-präsentierende Zellen (APCs) zu den entwässernden LNs zu transportieren. Die ersten lymphatischen Gefäße (auch Lymphkapillaren genannt) sind aufgrund ihrer diskontinuierlichen interzellulären Verbindungen, die die effektive Sammlung von Flüssigkeiten, Zellen und anderen Materialien aus den umliegenden extrazellulärenRäumen1 erleichtern, sehr durchlässig. Die ersten lymphatischen Gefäße verschmelzen zu sammelnden Lymphgefäßen, die enge interzelluläre Verbindungen, eine kontinuierliche Kellermembran und lymphatische Muskelabdeckung haben. Das Sammeln von Lymphgefäßen ist verantwortlich für den Transport der gesammelten Lymphe zu den entwässernden LNs und schließlich die Rückkehr der Lymphe in den Kreislauf2,3. Die sammelnden Lymphgefäße, die Lymphe in die entwässernden LN treiben, sind die afferent lymphatischen Gefäße4,5,6,7. Die Behinderung der affektiven Lymphgefäße kann den Lymphfluss in die LNs blockieren, was eine nützliche Technik bei der Untersuchung der Funktion des Lymphflusses ist.
Frühere Studien haben gezeigt, dass Lymphfluss eine wichtige Rolle beim Transport von Antigenen und APCs spielt, sowie bei der Aufrechterhaltung der LN-Homöostase. Es ist allgemein bekannt, dass gewebeabgeleitete APCs, typischerweise aktivierte migrierende dendritische Zellen (DCs), durch die affemenden Lymphgefäße zu den LN reisen, um T-Zellen zu aktivieren8. Die Idee, dass Freiform-Antigene, wie Mikroben oder lösliche Antigene, passiv mit Lymphe zu den LN fließen, um LN-residente APCs zu aktivieren, hat sich in den letzten zehn Jahrendurchgesetzt 9,10,11,12. Freiform-Antigene, die mit Lymphe reisen, dauern Minuten nach der Infektion, um zu den LN zu gelangen, und die LN-Resident-Zellaktivierung kann innerhalb von 20 min nach der Stimulation auftreten. Dies ist viel schneller als die Aktivierung von migrierenden DCs, die mehr als 8 h benötigt, um in die entwässernde LN9einzusteigen. Neben dem Transport von Antigenen zur Einleitung des Immunschutzes trägt die Lymphe auch Zytokine und DCs zu den LN, um ihre Mikroumgebung zu erhalten und die Immunzellhomöostase13,14zu unterstützen. Zuvor zeigte die Blockierung des Lymphflusses durch Das Aifaktum der affepfenden Lymphgefäße, dass Lymphe erforderlich ist, um den HEV-Phänotyp aufrechtzuerhalten, der zur Unterstützung der homöostatischen T-Zelle und der B-Zelle erforderlich ist, die bis zum LN15,16,17. CCL21 ist ein kritisches Chemokin, das die Dc- und T-Zellenpositionierung im LN8,18leitet. Die Blockierung des Lymphflusses unterbricht die CCL21-Expression im LN und unterbricht möglicherweise die Positionierung und/oder Interaktion von DC- und T-Zellen im LN19. So kann die Blockierung des Lymphflusses den Antigen-/DC-Zugang zu den entwässernden LN direkt oder indirekt abschaffen, indem die LN-Mikroumgebung gestört wird, die die Immunantworten in der LN reguliert. Um die Funktion des Lymphflusses besser untersuchen zu können, wird ein experimentelles Protokoll vorgestellt (Abbildung 1), um den Lymphfluss bei Mäusen zu blockieren, indem die affemenden Lymphgefäße vom Fußpad zum pLN durchnäht werden. Diese Methode kann eine wichtige Technik für zukünftige Studien über die lymphatische Funktion bei gesunden und kranken Bedingungen sein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td></td>
			<td>University of Calgary distribution services UN1170.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>Nair Sensitive Formula Hair Removal Cr&#232;me with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>F7250-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connect one end of polyethylene tubing to 30G &#215; &#189; needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G &#215; &#189; needle. Insert the blunt end of the 30G &#215; &#189; needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 &#956;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Forcep straight</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14218-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Narketan</td>
			<td>DIN 02374994</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (26Gx3/8)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (30Gx1/2)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paton Needle Holder</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS6403</td>
			<td>Straight, Without Lock; Serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (1.25cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (2.5cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Davis and Geck CYANAMID Canada</td>
			<td>11/04</td>
			<td>0.7 metric monofilament polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1ml)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS scissors</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>14122-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>DIN02169606</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice

Lymphgefäße sind entscheidend für die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts der Gewebeflüssigkeit und die Optimierung des Immunschutzes durch den Transport von Antigenen, Zytokinen und Zellen zu entwässernden Lymphknoten (LNs). Unterbrechung des Lymphflusses ist eine wichtige Methode bei der Untersuchung der Funktion von Lymphgefäßen. Die affeken Lymphgefäße vom murinen Fußpolster bis zu den poplitealen Lymphknoten (pLNs) sind als die einzigen Wege für die Lymphdrainage in die pLNs klar definiert. Das Abtinnen dieser affemenden Lymphgefäße kann selektiv den Lymphfluss zu den pLNs verhindern. Diese Methode ermöglicht Störungen des Lymphflusses mit minimalen Schäden an den lymphatischen Endothelzellen in den entwässernden pLN, den affepfen den Lymphgefäßen sowie anderen Lymphgefäßen in der Umgebung. Diese Methode wurde verwendet, um zu untersuchen, wie Lymphe hohe endotheliale Venule (HEV) und Chemokinexpression in der LN beeinflusst und wie Lymphe durch das Fettgewebe fließt, das die LN umgibt, wenn es keine funktionellen Lymphgefäße gibt. Mit der zunehmenden Anerkennung der Bedeutung der lymphatischen Funktion wird diese Methode breitere Anwendungen haben, um die Funktion von Lymphgefäßen bei der Regulierung der LN-Mikroumgebung und der Immunantworten weiter zu entwirren.

Lymphgefäßnaht wurde in früheren Studien15,16,17,19verwendet, wo es als wichtiges Werkzeug diente, um die Funktion des Lymphflusses zu untersuchen, bevor die Molekularbiologie der Lymphgefäße besser verstanden wurde. Die Blockierung des Lymphflusses unterbricht die LN-Homöostase, was dazu führt, dass HEVs die kritische Genexpression verlieren, die für eine optimale Lymphozytenhoming an ...

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Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Ein Protokoll zur Blockierung des Lymphflusses durch chirurgische Saat ierung von afferent lymphatischen Gefäßen wird vorgestellt.

Blockierung des Lymphflusses durch Suieren von afferenten Lymphgefäßen bei Mäusen

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Diese Methode unterbricht den Lymphfluss mit minimalen Schäden an lymphatischen Endothelzellen, und mit präziser Kontrolle des Blockade-Timings kann es verwendet werden, um zu untersuchen, wie sich der Lymphfluss auf die Homöostase und Immunantworten im Lymphknoten auswirkt. Jingna Xue, eine Studentin aus meinem Labor, hilft bei der Demonstration des Verfahrens. Um ein Injektionsgerät vorzubereiten, schneiden Sie etwa 30 Zentimeter Polyethylenschläuche.Schließen Sie die Nadelspitze A an ein Ende des Schlauches an. Entfernen Sie vorsichtig eine andere Nadel, und verbinden Sie die gebrochene Seite an das andere Ende der Polyethylen-Schläuche. Dann Nadel A an einer Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze befestigen.Unmittelbar vor der Anwendung eine 10:1 Ketamin-Xylazin-Mischung in Saline zubereiten. Nach der Anästhesisierung der Maus durch Injektion von 250 Mikrolitern des Ketamin/Xylazin-Gemischs intraperitoneal, sorgen Sie für eine vollständige Anästhesie mit einer Zehenprise. Rasieren Sie das Fell um die Beine mit Haarschneidern, dann tragen Enthaarungscreme um das Bein.Nach fünf Minuten das Restfell und die Enthaarungscreme mit einem feuchten Gewebe abwischen und dann das Bein mit sterilem Wasser reinigen. Sprühen Sie 70% Ethanol um das Bein, um den Operationsbereich zu sterilisieren. Platzieren Sie die Maus in einer anfälligen Position, und verwenden Sie chirurgisches Klebeband, um den Operationsbereich auf dem rechten Bein freizulegen.Intradermally injizieren fünf Mikroliter von 1%Evans blauen Farbstoff, oder neun Zentimeter der Flüssigkeit aus dem Injektionsapparat Schläuche in den rechten Fußpolster der Maus. Massieren Sie das Fußpolster sanft, um der Flüssigkeit zu helfen, in die Lymphgefäße einzudringen. Unter einem Sezieren mikroskop, lokalisieren Sie eine Einschnittstelle fünf Millimeter vom unteren Rand der poplitealen Fossa.Mit einer Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt etwa fünf Millimeter in der Länge. Verwenden Sie dann feine Operationszangen, um den Schnitt zu dehnen und die sammelnden Lymphgefäße freizulegen. Identifizieren Sie beide affekenden Lymphgefäße, die zu den poplitealen Lymphknoten führen.Mit einem Nadelhalter die Nahtnadel vorsichtig zwischen die affemenden Lymphgefäße und die saftige Arterie einlegen. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig um die affemenden Lymphgefäße heraus. Ziehen Sie vorsichtig die Nahtschnur und lassen Sie etwa zwei Zentimeter der Nahtschnur zurück.Verwenden Sie den Nadelhalter, um den Knoten eines Chirurgen zu binden. Massieren Sie das Fußpolster vorsichtig, um sicherzustellen, dass kein Evans blauer Farbstoff die Nahtstelle passiert, und schneiden Sie dann die überschüssige Schnur mit der Schere. Nähen Sie die anderen affefenden Lymphgefäße, dann schließen Sie den Hautschnitt mit der gleichen Naht, die für die Lymphgefäße verwendet wurde.Für die Scheinkontrolle, intradermally injizieren fünf Mikroliter von 1%Evans blauen Farbstoff in den linken Fußpolster, und massieren Sie das Fußpolster. Öffnen Sie die Haut mit einem Schnitt, und schließen Sie dann die Wunde, ohne das Gefäß zu nähen. Bei der Überwachung der Maus nach der Operation sollte das rechte Bein Ödem zeigen, wobei Evans blauer Farbstoff sich auf den Oberschenkel ausbreitet, während das Kontrollbein Evans blauen Farbstoff zeigt, der auf das Fußpolster beschränkt ist.Unmittelbar nach der Operation injizieren Sie intradermally 10 Mikroliter von 2%FITC sowohl im rechten Fußpolster als auch in der linken. Zwei, sechs und 12 Stunden nach der FITC-Injektion sammeln Sie die poplitealen Lymphknoten aus der Fossa von eingeschläferten Mäusen. Entfernen Sie vorsichtig das perinodale Fettgewebe um die pLNs.Die pLNs in eine optimale Schnitttemperaturverbindung mit dem medullären Sinusbereich zur Seite der Kryoform einbetten. Verwenden Sie ein Kryotome, um 20-Mikron gefrorene Abschnitte vorzubereiten. Um die FITC-Verteilung in den pLNs zu bestimmen, stellen Sie die Kryo-Abschnitte unter einem konfokalen Mikroskop ab.Konfokale Bilder, die zwei, sechs und 12 Stunden nach der FITC-Injektion aufgenommen wurden, zeigen eine erheblich reduzierte FITC-Akkumulation in den poplitealen Lymphknoten, nachdem sie die affetienten Lymphgefäße genährt haben. Der Rest-FITC in den pLNs wurde bevorzugt in den Lymphknotennebenhöhlen angesammelt. Konfokale Bilder des perinodalen Fettgewebes zeigen, wenn Lymphgefäße durch Naht blockiert werden, FITC tritt in das Gewebe ein, wenn der Lymphknoten versäuftet, aber es ist nicht effektiv über die Lymphknoten verteilt.Beim Versuch dieser Methode ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Einsetzen der Nahtnadel zwischen dem Blutgefäß und dem Lymphgefäß entscheidend ist. Ein Scheitern dieses Schritts kann die Gefäße brechen. Nach der Durchführung dieser Methode ist es möglich, Mäuse mit Infektionen oder anderen Immunstimulationen zu immunisieren, um zu untersuchen, wie Lymphfluss den Immunschutz reguliert.Die Funktion des Lymphflusses ist nicht gut verstanden. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellmigrationen im Lymphknoten in Abwesenheit von Lymphfluss zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Die Mesenteriallymphknoten Duct Cannulated Rattenmodell: Anwendung auf die Bewertung der Darm Lymphatische Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilatation isolierter Gefäße und die Isolierung der extrazellulären Matrix von Fest-Haut Mäuse

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu identifizieren Lymphozytensubpopulationen in Murine Aorta, Niere und Lymphknoten in einem Modell von Hypertonie

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Tiefe Venenthrombose, induziert durch Stauung in den Mäusen durch Hochfrequenz-Sonographie überwacht

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...