Name: blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

המחברים מודים לאווה זרדינז'אד על הגהה של כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR, PJT-156035) וקרן קנדה לחדשנות עבור SL (32930), ועל ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין עבור יוג'יה לין (81901576).

כל עבודת בעלי חיים צריכה להיות מאושרת על ידי ועדת האתיקה המוסדית והבריתית והטיפול בבעלי חיים.  זה ניתוח שלא הישרדות.
1. הכנת חומרים
<ol><li>להכין 100 מ"ל של 70% אתנול על ידי ערבוב 70 מ"ל של 100% אתנול עם 30 מ"ל של מים סטריליים. Autoclave כל הכלים הכירורגיים לפני הניתוח ולשמור את הכלים ב 70% אתנו...

<ol>
	<li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels.">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li><li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microlymphatics+and+lymph+flow.">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li><li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle.">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li><li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions,+measured+in+draining+lymph.">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li><li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels.">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li><li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation:+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct.">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism.">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread.">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li><li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens.">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li><li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules.">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li><li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex.">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li><li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone.">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li><li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression.">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li><li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GlyCAM-1,+an+endothelial+ligand+for+L-selectin,+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow.">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li><li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+organ+development:+from+ontogeny+to+neogenesis.">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li><li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment.">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li><li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice.">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route.">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li><li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema.">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).</li></ol>

חסימת זרימת הלימפה יהיו יישומים רחבים במניפולציה אספקת אנטיגן ל LN בתנאים בריאים ומחלות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לשלוט בתזמון של אספקת אנטיגן על מנת ללמוד כיצד זרימת הלימפה רציפה מווסתת את התגובה החיסונית בניקוז LNs. שיטה זו של הפרעת זרימת הלימפה יכול לשמש גם כדי ללמוד כיצד לימפה משפיעה על ?...

הארגון המרחבי של מערכת הלימפה מספק תמיכה מבנית ופונקציונלית כדי להסיר ביעילות נוגדנים נוזלים חוץ תאיים והובלה ותאים אנטיגן הצגת (APCs) ל- LNs ניקוז. כלי הלימפה הראשוניים (הנקראים גם נימי לימפה) חדירים מאוד בשל הצמתים הבין-תאיים הבלתי רציפים שלהם, המקלים על האיסוף היעיל של נוזלים, תאים וחומרים אחרים מהחללים החוץ-תאייםשמסביב 1. כלי הלימפה הראשוניים מתמזגים לאיסוף כלי לימפה, בעלי צמתים בין-תאיים הדוקים, קרום מרתף רציף וכיסוי שריר הלימפה. איסוף כלי לימפה אחראים על הובלת לימפה שנאספו ל-LNs המתנקז ובסופו של דבר חזרה לימפה למחזור2,3. כלי הלימפה הנאספים שהניעו את הלימפה לתוך ה-LN המתנקז הם כלי הלימפההאדירים 4,5,6,7. חסימה של כלי לימפה אפילנטיים יכול לחסום את זרימת הלימפה לתוך LNs, שהיא טכניקה שימושית בעת לימוד הפונקציה של זרימת הלימפה.
מחקרים קודמים הראו כי זרימת הלימפה ממלאת תפקיד משמעותי בהעברת אנטיגן וAPCs, כמו גם שמירה על הומוסטאזיס LN. זה מובן היטב כי APCs נגזר רקמות, מופעל בדרך כלל נדידה תאים דנדריטיים (DCs), לנסוע דרך כלי לימפה אפרנטיים LN כדי להפעיל תאי T8. הרעיון כי אנטיגן בצורה חופשית, כגון חיידקים או אנטיגן מסיס, באופן פסיבי לזרום עם הלימפה ל LN כדי להפעיל APCs תושב LN כבר צובר קבלהבעשור האחרון 9,10,11,12. אנטיגן בצורה חופשית נסיעה עם לימפה לקחת דקות לאחר הזיהום לנסוע LN, ואת הפעלת התא תושב LN עלולה להתרחש בתוך 20 דקות לאחר הגירוי. זה הרבה יותר מהר מאשר ההפעלה של מחשבי מחשבים נודדים, אשר לוקח יותר מ 8 שעות כדי להיכנס LN9 ניקוז. מלבד הובלת אנטיגן ליזום הגנה חיסונית, הלימפה נושאת גם ציטוקינות ו-DCs ל LN כדי לשמור על המיקרו-סביבה שלה, ולתמוך בהומפואוסטזיס של תאימערכת החיסון 13,14. בעבר, חסימת זרימת הלימפה על ידי תפירת כלי הלימפה afferent הוכיח כי הלימפה נדרשת כדי לשמור על פנוטיפ HEV הנדרש לתמיכה בתא T הומאוסטטי ותא B ביות LN15,16,17. CCL21 הוא צ'מוקין קריטי הכוון את מיקום תאי DC ו- T ב- LN8,18. חסימת זרימת הלימפה מפריעה לביטוי CCL21 ב- LN ועלולה להפריע למיקום תאי DC ו-T ו/או אינטראקציה ב- LN19. לכן, חסימת זרימת הלימפה יכולה במישרין או בעקיפין לחסום את הגישה אנטיגן / DC ל LN ניקוז על ידי שיבוש microenvironment LN המסדיר את התגובות החיסוניות ב LN. כדי לחקור טוב יותר את הפונקציה של זרימת הלימפה, פרוטוקול ניסיוני מוצג(איור 1) כדילחסום את זרימת הלימפה בעכברים על ידי תפירת כלי הלימפה אפרנטיים ממשטח הרגל לpLN. שיטה זו יכולה להיות טכניקה חשובה עבור מחקרים עתידיים על תפקוד הלימפה בתנאים בריאים ומחלות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td></td>
			<td>University of Calgary distribution services UN1170.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>Nair Sensitive Formula Hair Removal Cr&#232;me with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>F7250-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connect one end of polyethylene tubing to 30G &#215; &#189; needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G &#215; &#189; needle. Insert the blunt end of the 30G &#215; &#189; needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 &#956;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Forcep straight</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14218-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Narketan</td>
			<td>DIN 02374994</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (26Gx3/8)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (30Gx1/2)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paton Needle Holder</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS6403</td>
			<td>Straight, Without Lock; Serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (1.25cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (2.5cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Davis and Geck CYANAMID Canada</td>
			<td>11/04</td>
			<td>0.7 metric monofilament polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1ml)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS scissors</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>14122-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>DIN02169606</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice

כלי הלימפה הם קריטיים בשמירה על איזון נוזל רקמות אופטימיזציה של ההגנה החיסונית על ידי הובלת אנטיגן, ציטוקינים, ותאים לתעלות הלימפה ניקוז (LNs). הפרעה של זרימת הלימפה היא שיטה חשובה בעת לימוד הפונקציה של כלי לימפה. כלי הלימפה האדמטיים האדיבים ממשטח הרגליים של המריין ועד לבלוטות הלימפה הפופוליליות (pLNs) מוגדרות היטב בשם המסלולים היחידים לניקוז הלימפה לתוך ה-pLNs. תפירת כלי לימפה שונים אלה יכולה למנוע באופן סלקטיבי את זרימת הלימפה ל-pLNs. שיטה זו מאפשרת הפרעה בזרימת הלימפה עם נזק מינימלי לתאי הלימפה הלימפה בpLN המתנקז, כלי הלימפה אפרנטיים, כמו גם כלי לימפה אחרים באזור. שיטה זו שימשה כדי ללמוד כיצד משפיע הלימפה venules אנדותל גבוה (HEV) וביטוי chemokine ב LN, ואיך הלימפה זורמת דרך רקמת שומן המקיפה את LN בהיעדר כלי לימפה פונקציונליים. עם ההכרה הגוברת בחשיבות של תפקוד הלימפה, שיטה זו תהיה יישומים רחבים יותר כדי לפענח עוד יותר את הפונקציה של כלי לימפה בוויסות microenvironment LN ותגובות חיסוניות.

תפר כלי הלימפה שימשבמחקרים קודמים 15,16,17,19,שם הוא שימש ככלי חשוב כדי ללמוד את הפונקציה של זרימת הלימפה לפני הביולוגיה המולקולרית של כלי הלימפה היה מובן טוב יותר. חסימת זרימת הלימפה מפריעה ל-LN הומאאוסטזיס, מה שמוביל לכך ש-H...

Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

פרוטוקול לחסום את זרימת הלימפה על ידי תפירה כירורגית של כלי לימפה שונים מוצג.

חסימת זרימת הלימפה על ידי תפירת כלי לימפה אפילנט בעכברים

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

שיטה זו מפריעה לזרימת הלימפה עם נזק מינימלי לתאי אנדותל הלימפה, ועם שליטה מדויקת בתזמון המצור, ניתן להשתמש בה כדי לחקור כיצד זרימת הלימפה משפיעה על הונוסטזיס ותגובות חיסוניות בצומת הלימפה. עוזר להדגים את ההליך יהיה ג'ינגנה שו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להכין מנגנון הזרקה, לחתוך כ 30 ס"מ של צינורות פוליאתילן.חבר את קצה המחט A לקצה אחד של הצינור. בזהירות לנתק מחט אחרת, ולחבר את הצד השבור לקצה השני של צינורות פוליאתילן. ואז לצרף מחט A למזרק שחפת מיליליטר אחד.מיד לפני השימוש, להכין 10:1 קטמין-xylazine תערובת מלוחים. לאחר הרדמה של העכבר על ידי הזרקת 250 מיקרוליטרים של תערובת קטמין/קסילאזין תוך-אפית, להבטיח הרדמה מלאה עם קמצוץ בוהן. לגלח את הפרווה סביב הרגליים עם קוצץ שיער, ולאחר מכן להחיל קרם depilatory סביב הרגל.לאחר חמש דקות, לנגב את הפרווה שיורית ואת קרם depilatory באמצעות רקמה לחה, ולאחר מכן לנקות את הרגל עם מים סטריליים. יש לרסס 70% אתנול סביב הרגל כדי לעקר את אזור ההפעלה. מניחים את העכבר בתקרת נוטה, ולהשתמש בקלטת כירורגית כדי לחשוף את אזור הניתוח ברגל ימין.מוזרקים תוך-תאית חמישה מיקרוליטרים של צבע כחול 1%Evans, או תשעה סנטימטרים של הנוזל מצנרת ההזרקה צינורות לתוך כרית הרגל הימנית של העכבר. לעסות בעדינות את כף הרגל כדי לעזור לנוזל להיכנס כלי הלימפה. תחת מיקרוסקופ לנתח, לאתר אתר חתך חמישה מילימטרים מהקצה התחתון של אופוסה popliteal.באמצעות זוג מספריים, לעשות חתך קטן כחמישה מילימטרים אורך. לאחר מכן השתמש מלקעות פעולה בסדר כדי למתוח את החתך ולחשוף את כלי הלימפה איסוף. זהה את שני כלי הלימפה afferent המוביל בלוטות הלימפה popliteal.באמצעות מחזיק מחט, בזהירות להכניס את מחט התפר בין כלי הלימפה afferent ואת העורק saphenous. משוך בעדינות את המחט סביב כלי הלימפה. בזהירות למשוך את חוט התפר, משאיר כשני סנטימטרים של חוט התפר מאחור.השתמש במחזיק המחט כדי לעזור לקשור קשר של מנתח. לעסות בעדינות את כרית כף הרגל כדי להבטיח שום צבע כחול אוונס עובר את אתר התפר, ולאחר מכן לחתוך את החוט עודף עם מספריים. תפר את כלי הלימפה אדישים אחרים, ולאחר מכן לסגור את החתך בעור עם אותו תפר ששימש עבור כלי הלימפה.לשליטה מזויפת, להזריק תוך אדרה חמישה microliters של 1% צבע כחול אוונס כרית רגל שמאל, לעסות את כרית הרגל. פתח את העור עם חתך, ולאחר מכן לסגור את הפצע מבלי לתתבוע את הכלי. בעת ניטור העכבר לאחר הניתוח, הרגל הימנית צריכה להראות בצקת, עם צבע כחול אוונס מתפשט לירך, בעוד רגל הבקרה תראה צבע כחול אוונס מוגבל כרית הרגל.מיד לאחר הניתוח, להזריק תוך אדרה 10 microliters של 2%FITC הן כרית רגל ימין והן בצד שמאל. שעתיים, שש ו-12 שעות לאחר הזרקת FITC, אוספים את בלוטות הלימפה הפופליטיות מהפוסה של עכברים שעברו המתת לחץ. בזהירות להסיר את רקמת שומן perinodal סביב pLNs.להטמיע את pLNs בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית עם אזור סינוס medullary פונה לצד של עובש קריו. השתמש קריוטום להכין חלקים קפואים 20 מיקרון. כדי לקבוע את התפלגות FITC ב- pLNs, צלמו את קטעי ההקפאה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.תמונות קונפוקל שנתפסו שעתיים, שש, ו 12 שעות לאחר הזרקת FITC להראות מופחת באופן משמעותי הצטברות FITC בבלוטות הלימפה popliteal לאחר תופר את כלי הלימפה afferent. FITC שיורית ב- pLNs הצטברה באופן מועדף בסינוסים הלימפה. תמונות confocal של רקמת שומן perinodal להראות כאשר כלי הלימפה נחסמים על ידי תפור, FITC נכנס לרקמה כאשר בלוטות הלימפה סינוסים, אבל זה לא מופץ ביעילות לאורך בלוטות הלימפה.כאשר מנסים שיטה זו, חשוב לזכור כי החדרת מחט התפר בין כלי הדם לבין כלי הלימפה היא קריטית. כישלון של צעד זה עלול לשבור את כלי הדם. לאחר ביצוע שיטה זו, ניתן לחסן עכברים עם זיהום או גירוי חיסוני אחר כדי ללמוד כיצד זרימת הלימפה מווסתת את ההגנה החיסונית.הפונקציה של זרימת הלימפה אינה מובנת היטב. שיטה זו יכולה לשמש לחקר נדידת תאים בצומת הלימפה בהעדר זרימת הלימפה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

לימפה Duct cannulated עכברוש דגם mesenteric: בקשה להערכה של המעיים הלימפה תרופות תחבורה

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilation של כלי מבודד והבידוד של מטריקס של עכברים צמוד עור

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

תאיים מכתים cytometry זרימה לזהות לימפוציטים קבוצות משנה בתוך Murine אבי העורקים, כליות בלוטות לימפה מודל של יתר לחץ דם

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

פקקת ורידים עמוקה שנגזרות Stasis בעכברים המנוטרת על-ידי בדיקת אולטרה סאונד בתדירות גבוהה

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...