Name: blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Gli autori ringraziano Ava Zardynezhad per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è supportato dal Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) e dalla Canada Foundation for Innovation for SL (32930), e dalla National Natural Science Foundation of China per Yujia Lin (81901576).

Tutto il lavoro sugli animali deve essere approvato dal comitato istituzionale e governativo per l'etica e la gestione degli animali.  Questo è un intervento di non sopravvivenza.
1. Preparazione dei materiali
<ol><li>Preparare 100 mL di etanolo al 70% mescolando 70 mL di etanolo al 100% con 30 mL di acqua sterile. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico e mantenere gli strumenti in etanolo al 70% prima e durante l'intervento chirurgico per mantenere la st...

<ol>
	<li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels.">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li><li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microlymphatics+and+lymph+flow.">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li><li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle.">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li><li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions,+measured+in+draining+lymph.">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li><li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels.">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li><li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation:+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct.">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism.">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread.">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li><li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens.">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li><li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules.">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li><li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex.">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li><li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone.">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li><li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression.">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li><li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GlyCAM-1,+an+endothelial+ligand+for+L-selectin,+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow.">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li><li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+organ+development:+from+ontogeny+to+neogenesis.">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li><li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment.">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li><li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice.">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route.">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li><li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema.">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).</li></ol>

Il blocco del flusso linfatico avrà ampie applicazioni nella manipolazione della somministrazione di antigeni alla LN in condizioni sane e mase. È possibile utilizzare questo metodo per controllare i tempi di erogazione dell'antigene al fine di studiare come il flusso linfatico continuo regola la risposta immunitaria nelle LN drenante. Questo metodo di interruzione del flusso linfatico può anche essere utilizzato per studiare come la linfa influisce sulla compartimentazione cellulare, l'attivazione cellulare, la migra...

L'organizzazione spaziale del sistema linfatico fornisce supporto strutturale e funzionale per rimuovere in modo efficiente il fluido extracellulare e trasportare antigeni e cellule che presentano antigeni (APC) nelle LN drenante. I vasi linfatici iniziali (chiamati anche capillari linfatici) sono altamente permeabili a causa delle loro giunzioni intercellulari discontinue, che facilitano l'efficace raccolta di fluidi, cellule e altri materiali dagli spazi extracellularicircostanti 1. I vasi linfatici iniziali si fondono nella raccolta di vasi linfatici, che hanno strette giunzioni intercellulari, una membrana basale continua e una copertura muscolare linfatica. La raccolta dei vasi linfatici è responsabile del trasporto della linfa raccolta nelle LN drenante e, infine, del ritorno della linfa allacircolazione 2,3. I vasi linfatici di raccolta che spingono la linfa nella LN drenante sono i vasi linfatici afferenti4,5,6,7. L'ostruzione dei vasi linfatici afferenti può bloccare il flusso linfatico nelle LN, che è una tecnica utile quando si studia la funzione del flusso linfatico.
Studi precedenti hanno dimostrato che il flusso linfatico svolge un ruolo significativo nel trasporto di antigeni e APC, oltre a mantenere l'omeostasi LN. È ben noto che le APC derivate dai tessuti, tipicamente attivate dalle cellule dendritiche migratorie (IC), viaggiano attraverso i vasi linfatici afferenti fino alla LN per attivare le cellule T8. L'idea che gli antigeni in forma libera, come microbi o antigeni solubili, fluiranno passivamente con la linfa verso l'LN per attivare gli APC residenti in LN ha ottenuto l'accettazione nell'ultimo decennio9,10,11,12. Gli antigeni in forma libera che viaggiano con la linfa prendono minuti dopo l'infezione per viaggiare verso l'LN e l'attivazione cellulare residente in LN può verificarsi entro 20 minuti dopo la stimolazione. Questo è molto più veloce dell'attivazione dei PC di migrazione, che richiede più di 8 ore per entrare nell'LN9 drenante. Oltre a trasportare antigeni per avviare la protezione immunitaria, la linfa trasporta anche citochine e TC nella LN per mantenere il suo microambiente e sostenere l'omeostasi delle celluleimmunitarie 13,14. In precedenza, il blocco del flusso linfatico suturando i vasi linfatici afferenti ha dimostrato che la linfa è necessaria per mantenere il fenotipo HEV necessario per sostenere la cellula T omeostatica e l'homing cellulare B all'LN15,16,17. CCL21 è una chemiochina critica che dirige il posizionamento delle celle DC e T nell'LN8,18. Il blocco del flusso linfatico interrompe l'espressione CCL21 nell'LN e potenzialmente interrompe il posizionamento e/o l'interazione delle cellule DC e T nell'LN19. Pertanto, il blocco del flusso linfatico può abrogare direttamente o indirettamente l'accesso all'antigene /DC all'LN drenante interrompendo il microambiente LN che regola le risposte immunitarie nella LN. Per studiare meglio la funzione del flusso linfatico, viene presentato un protocollo sperimentale (figura 1) per bloccare il flusso linfatico nei topi suturando i vasi linfatici afferenti dal pLN al pLN. Questo metodo può essere una tecnica importante per futuri studi sulla funzione linfatica in condizioni sane e masticate.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td></td>
			<td>University of Calgary distribution services UN1170.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>Nair Sensitive Formula Hair Removal Cr&#232;me with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>F7250-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connect one end of polyethylene tubing to 30G &#215; &#189; needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G &#215; &#189; needle. Insert the blunt end of the 30G &#215; &#189; needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 &#956;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Forcep straight</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14218-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Narketan</td>
			<td>DIN 02374994</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (26Gx3/8)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (30Gx1/2)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paton Needle Holder</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS6403</td>
			<td>Straight, Without Lock; Serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (1.25cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (2.5cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Davis and Geck CYANAMID Canada</td>
			<td>11/04</td>
			<td>0.7 metric monofilament polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1ml)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS scissors</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>14122-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>DIN02169606</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice

I vasi linfatici sono fondamentali per mantenere l'equilibrio dei fluidi tissutali e ottimizzare la protezione immunitaria trasportando antigeni, citochine e cellule ai linfonodi drenante (LN). L'interruzione del flusso linfatico è un metodo importante quando si studia la funzione dei vasi linfatici. I vasi linfatici afferenti dal pedana murina ai linfonodi poplitei (PLN) sono ben definiti come le uniche vie per il drenaggio linfatico nei PLN. Suturare questi vasi linfatici afferenti può prevenire selettivamente il flusso linfatico verso i PLAN. Questo metodo consente l'interferenza nel flusso linfatico con danni minimi alle cellule endoteliali linfatiche nel pLN drenante, nei vasi linfatici afferenti e in altri vasi linfatici intorno all'area. Questo metodo è stato utilizzato per studiare come la linfa influisce sulle alte venule endoteliali (HEV) e sull'espressione della chemiochina nella LN e su come la linfa fluisce attraverso il tessuto adiposo che circonda la LN in assenza di vasi linfatici funzionali. Con il crescente riconoscimento dell'importanza della funzione linfatica, questo metodo avrà applicazioni più ampie per svelare ulteriormente la funzione dei vasi linfatici nella regolazione del microambiente LN e delle risposte immunitarie.

La sutura linfatica dei vasi è stata utilizzata neglistudi precedenti 15,16,17,19, dove è servita come strumento importante per studiare la funzione del flusso linfatico prima che la biologia molecolare dei vasi linfatici fosse meglio compresa. Il blocco del flusso linfatico interrompe l'omeostasi LN, che porta gli HEV a perdere l'espressione genica critica necessaria per l'homing dei linfoci...

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Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Viene presentato un protocollo per bloccare il flusso linfatico mediante sutura chirurgica di vasi linfatici afferenti.

Blocco del flusso linfatico mediante la sutura di vasi linfatici afferenti nei topi

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Questo metodo interrompe il flusso linfatico con danni minimi alle cellule endoteliali linfatiche e, con un controllo preciso dei tempi di blocco, può essere utilizzato per studiare come il flusso linfatico influisce sull'omeostasi e sulle risposte immunitarie nel linfonodo. Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà Jingna Xue, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per preparare un apparato di iniezione, tagliare circa 30 centimetri di tubi in polietilene.Collegare la punta dell'ago A a un'estremità del tubo. Spostare con cura un altro ago e collegare il lato rotto all'altra estremità dei tubi in polietilene. Quindi attaccare l'ago A a una siringa tubercocina da un millilitro.Immediatamente prima dell'uso, preparare una miscela 10:1 ketamina-xiazina in salina. Dopo aver anestetizzato il topo iniettando 250 microlitri della miscela chetamina/xiazina per via intraperitoneale, assicurarsi l'anestesia completa con un pizzico di dito. Radere la pelliccia intorno alle gambe con le tosaerba, quindi applicare la crema depilatoria intorno alla gamba.Dopo cinque minuti, pulire la pelliccia residua e la crema depilatoria utilizzando un tessuto umido, quindi pulire la gamba con acqua sterile. Spruzzare il 70% di etanolo intorno alla gamba per sterilizzare l'area operativa. Posizionare il mouse in una posizione prona e utilizzare il nastro chirurgico per esporre l'area operativa sulla gamba destra.Iniettare intradermally cinque microlitri di colorante blu 1%Evans o nove centimetri del fluido dall'apparato di iniezione che si inneggiano nel pedane destro del mouse. Massaggiare delicatamente il pedana per aiutare il fluido ad entrare nei vasi linfatici. Al microscopio sezionato, individuare un sito di incisione a cinque millimetri dal bordo inferiore della fossa poplitea.Usando un paio di forbici, fai una piccola incisione lunga circa cinque millimetri. Quindi utilizzare forcep di funzionamento fine per allungare l'incisione ed esporre i vasi linfatici di raccolta. Identificare entrambi i vasi linfatici afferenti che portano ai linfonodi poplitei.Utilizzando un portaaghi, inserire con cautela l'ago di sutura tra i vasi linfatici afferenti e l'arteria safenosa. Estrarre delicatamente l'ago intorno ai vasi linfatici afferenti. Tirare con cura la corda di sutura, lasciando dietro di sé circa due centimetri della corda di sutura.Utilizzare il portaaghi per legare il nodo di un chirurgo. Massaggiare delicatamente il pedvio per assicurarsi che nessun colorante blu Evans passi il sito di sutura, quindi tagliare la corda in eccesso con le forbici. Sutura gli altri vasi linfatici afferenti, quindi chiudere l'incisione cutanea con la stessa sutura utilizzata per i vasi linfatici.Per il controllo fittizio, iniettare intradermally cinque microlitri di colorante blu 1%Evans nel foot pad sinistro e massaggiare il foot pad. Aprire la pelle con un'incisione, quindi chiudere la ferita senza suturare il vaso. Quando si monitora il post-intervento chirurgico del mouse, la gamba destra dovrebbe mostrare edema, con la tintura blu Evans che si diffonde alla coscia, mentre la gamba di controllo mostrerà la tintura blu Evans limitata al foot pad.Subito dopo l'intervento chirurgico, iniettare intradermally 10 microlitri del 2%FITC sia nel pedone destro che a sinistra. Due, sei e 12 ore dopo l'iniezione FITC, raccogliere i linfonodi poplitei dalla fossa dei topi eutanasiati. Rimuovere con cura il tessuto adiposo perinodale intorno ai pLAN.Incorporare i pLAN in un composto ottimale della temperatura di taglio con l'area del seno midollare rivolta verso il lato dello stampo criogenico. Utilizzare un criotomo per preparare sezioni congelate da 20 micron. Per determinare la distribuzione FITC nei pLAN, immagini le crio-sezioni al microscopio confocale.Le immagini confocali catturate due, sei e 12 ore dopo l'iniezione FITC mostrano un accumulo fitc sostanzialmente ridotto nei linfonodi poplitei dopo aver suturato i vasi linfatici afferenti. Il FITC residuo nei pLN è stato accumulato preferenzialmente nei seni linfonodi. Le immagini confocali del tessuto adiposo perinodale mostrano quando i vasi linfatici sono bloccati dalla sutura, il FITC entra nel tessuto quando il linfonodo sinusa, ma non è distribuito efficacemente in tutti i linfonodi.Quando si tenta questo metodo, è importante ricordare che l'inserimento dell'ago di sutura tra il vaso sanguigno e il vaso linfatico è fondamentale. Il fallimento di questo passaggio può rompere le navi. Dopo aver eseguito questo metodo, è possibile immunizzare i topi con infezione o altra stimolazione immunitaria per studiare come il flusso linfatico regola la protezione immunitaria.La funzione del flusso linfatico non è ben compresa. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le migrazioni cellulari nel linfonodo in assenza di flusso linfatico.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Misurazione dell&#39;attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

La linfa mesenterica Duct Cannulated Rat Modello: Applicazione alla valutazione di intestinale linfatico Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilatazione dei vasi isolati e l&#39;isolamento della matrice extracellulare di topi Tight-pelle

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Intracellulare colorazione e citometria a flusso per l&#39;identificazione dei linfociti sottoinsiemi all&#39;interno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Trombosi venosa profonda indotta dalla stasi in topi monitorati dall'ecografia ad alta frequenza

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule T nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...