Name: blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Los autores agradecen a Ava Zardynezhad por la corrección del manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo del Instituto Canadiense de Investigación Sanitaria (CIHR, PJT-156035) y la Fundación Canadiense para la Innovación para SL (32930), y por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China para Yujia Linjia (81901576).

Todo el trabajo animal debe ser aprobado por el comité institucional y gubernamental de ética y manejo de animales.  Esta es una cirugía de no supervivencia.
1. Preparación de materiales
<ol><li>Preparar 100 ml de etanol al 70% mezclando 70 ml de etanol 100% con 30 ml de agua estéril. Autoclave todas las herramientas quirúrgicas antes de la cirugía y mantener las herramientas en 70% etanol antes y durante la cirugía para mantener la esterilización.</li>
	<li>Prepare un aparato de i...

<ol>
	<li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels.">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li><li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microlymphatics+and+lymph+flow.">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li><li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle.">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li><li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions,+measured+in+draining+lymph.">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li><li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels.">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li><li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation:+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct.">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism.">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread.">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li><li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens.">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li><li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules.">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li><li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex.">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li><li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone.">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li><li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression.">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li><li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GlyCAM-1,+an+endothelial+ligand+for+L-selectin,+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow.">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li><li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+organ+development:+from+ontogeny+to+neogenesis.">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li><li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment.">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li><li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice.">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route.">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li><li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema.">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).</li></ol>

El bloqueo del flujo linfático tendrá amplias aplicaciones en la manipulación del suministro de antígenos al LN en condiciones saludables y enfermas. Es posible utilizar este método para controlar el momento de la administración de antígenos con el fin de estudiar cómo el flujo linfático continuo regula la respuesta inmune en el drenaje de LNs. Este método de interrupción del flujo linfático también se puede utilizar para estudiar cómo afecta la linfa a la compartimentación celular, la activación celular,...

La organización espacial del sistema linfático proporciona soporte estructural y funcional para eliminar eficientemente el líquido extracelular y transportar antígenos y células que presentan antígenos (APC) a los LN drenantes. Los vasos linfáticos iniciales (también llamados capilares linfáticos) son altamente permeables debido a sus uniones intercelulares discontinuas, que facilitan la recolección efectiva de líquidos, células y otros materiales de los espacios extracelulares circundantes1. Los vasos linfáticos iniciales se funden en vasos linfáticos recolectan, que tienen uniones intercelulares estrechas, una membrana sótano continua y cobertura muscular linfática. La recolección de los vasos linfáticos son responsables de transportar la linfa recogida a los LN drenantes y eventualmente devolver la linfa a la circulación2,3. Los vasos linfáticos recolectantes que introducen la linfa en el LN drenante son los vasos linfáticos aferentes4,5,6,7. La obstrucción de los vasos linfáticos aferentes puede bloquear el flujo linfático hacia los LN, que es una técnica útil al estudiar la función del flujo linfático.
Estudios anteriores han demostrado que el flujo linfático juega un papel importante en el transporte de antígenos y APC, así como el mantenimiento de la homeostasis LN. Se entiende bien que los APC derivados del tejido, típicamente activados células dendríticas migratorias (DC), viajan a través de los vasos linfáticos aferentes a la LN para activar las células T8. La idea de que los antígenos de forma libre, como microbios o antígenos solubles, fluyen pasivamente con linfa a la LN para activar los APC residentes en LN ha ido ganando aceptación en la última década9,10,11,12. Los antígenos de forma libre que viajan con la linfa tardan minutos después de la infección para viajar al LN, y la activación de la célula residente en LN puede ocurrir dentro de los 20 minutos después de la estimulación. Esto es mucho más rápido que la activación de controladores de dominio de migración, que tarda más de 8 h en entrar en el LN9de drenaje. Además de transportar antígenos para iniciar la protección inmunitaria, la linfa también lleva citoquinas y DC a la LN para mantener su microambiente, y para apoyar la homeostasis de células inmunitarias13,14. Anteriormente, el bloqueo del flujo linfático suturando los vasos linfáticos aferentes demostró que la linfa es necesaria para mantener el fenotipo HEV necesario para apoyar la célula T homeostática y la localización de células B a la LN15,16,17. CCL21 es una quimiocina crítica que dirige el posicionamiento de células DC y T en el LN8,18. El bloqueo del flujo linfático interrumpe la expresión CCL21 en el LN y puede interrumpir el posicionamiento y/o la interacción de los células DC y T en el LN19. Por lo tanto, el bloqueo del flujo linfático puede abrogar directa o indirectamente el acceso de antígeno/CC al LN drenante interrumpiendo el microambiente LN que regula las respuestas inmunitarias en el LN. Para investigar mejor la función del flujo linfático, se presenta un protocolo experimental (Figura 1) para bloquear el flujo linfático en ratones suturando los vasos linfáticos aferentes desde la almohadilla hasta el pLN. Este método puede ser una técnica importante para futuros estudios sobre la función linfática en condiciones saludables y enfermas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td></td>
			<td>University of Calgary distribution services UN1170.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>Nair Sensitive Formula Hair Removal Cr&#232;me with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>F7250-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connect one end of polyethylene tubing to 30G &#215; &#189; needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G &#215; &#189; needle. Insert the blunt end of the 30G &#215; &#189; needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 &#956;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Forcep straight</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14218-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Narketan</td>
			<td>DIN 02374994</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (26Gx3/8)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (30Gx1/2)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paton Needle Holder</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS6403</td>
			<td>Straight, Without Lock; Serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (1.25cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (2.5cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Davis and Geck CYANAMID Canada</td>
			<td>11/04</td>
			<td>0.7 metric monofilament polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1ml)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS scissors</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>14122-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>DIN02169606</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice

Los vasos linfáticos son fundamentales para mantener el equilibrio de líquidos tisulares y optimizar la protección inmune mediante el transporte de antígenos, citoquinas y células a los ganglios linfáticos de drenaje (LN). La interrupción del flujo linfático es un método importante al estudiar la función de los vasos linfáticos. Los vasos linfáticos aferentes desde la almohadilla murina hasta los ganglios linfáticos popliteales (pNN) están bien definidos como las únicas rutas para el drenaje linfático en los pNN. Suturar estos vasos linfáticos aferentes puede prevenir selectivamente el flujo linfático a los pNN. Este método permite la interferencia en el flujo linfático con un daño mínimo a las células endoteliales linfáticas en el pLN drenante, los vasos linfáticos aferentes, así como otros vasos linfáticos alrededor de la zona. Este método se ha utilizado para estudiar cómo afecta la linfa los altos veules endoteliales (HEV) y la expresión de quimiocina en el LN, y cómo la linfa fluye a través del tejido adiposo que rodea el LN en ausencia de vasos linfáticos funcionales. Con el creciente reconocimiento de la importancia de la función linfática, este método tendrá aplicaciones más amplias para desentrañar aún más la función de los vasos linfáticos en la regulación del microambiente LN y las respuestas inmunitarias.

La sutura de vasos linfáticos se ha utilizado en estudios anteriores15,16,17,19, donde sirvió como una herramienta importante para estudiar la función del flujo linfático antes de que se entendiera mejor la biología molecular de los vasos linfáticos. El bloqueo del flujo linfático interrumpe la homeostasis LN, lo que lleva a que los HEVs pierdan la expresión génica crítica necesaria p...

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Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Se presenta un protocolo para bloquear el flujo linfático mediante la sutura quirúrgica de los vasos linfáticos aferentes.

Bloqueo del flujo linfático mediante la sutura de los vasos linfáticos aferentes en ratones

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Este método interrumpe el flujo linfático con un daño mínimo a las células endoteliales linfáticas, y con un control preciso de la sincronización del bloqueo, se puede utilizar para estudiar cómo el flujo linfático afecta a la homeostasis y las respuestas inmunitarias en el ganglio linfático. Ayudar a demostrar el procedimiento será Jingna Xue, una estudiante graduada de mi laboratorio. Para preparar un aparato de inyección, corte aproximadamente 30 centímetros de tubo de polietileno.Conecte la punta de la aguja A a un extremo del tubo. Desaloje con cuidado otra aguja y conecte el lado roto al otro extremo del tubo de polietileno. A continuación, conecte la aguja A a una jeringa de tuberculina de un mililitro.Inmediatamente antes de su uso, preparar una mezcla de ketamina-xiazina 10:1 en solución salina. Después de anestesiar el ratón inyectando 250 microlitros de la mezcla de ketamina/xiazina intraperitonealmente, asegurar la anestesia completa con un pellizco de los dedos del dedo. Afeitar el pelaje alrededor de las piernas con cortapelos, luego aplicar crema depilatoria alrededor de la pierna.Después de cinco minutos, limpie el pelaje residual y la crema depilatoria usando un tejido húmedo, luego limpie la pierna con agua estéril. Rocíe 70% de etanol alrededor de la pierna para esterilizar el área de operación. Coloque el ratón en una posición propensa y utilice cinta quirúrgica para exponer el área de operación en la pierna derecha.Inyecte intradérgicamente cinco microlitros de 1%Evans de tinte azul, o nueve centímetros del fluido del tubo del aparato de inyección en la almohadilla del pie derecho del ratón. Masajee suavemente el reposapiés para ayudar a que el líquido entre en los vasos linfáticos. Bajo un microscopio diseccionado, localice un sitio de incisión a cinco milímetros del borde inferior de la fosa popliteal.Usando un par de tijeras, haga una pequeña incisión de aproximadamente cinco milímetros de longitud. Luego usa fórceps de operación fina para estirar la incisión y exponer los vasos linfáticos recolectan. Identificar los dos vasos linfáticos aferentes que conducen a los ganglios linfáticos popliteales.Con un soporte para agujas, inserte con precaución la aguja de sutura entre los vasos linfáticos aferentes y la arteria safenosa. Tire suavemente de la aguja alrededor de los vasos linfáticos aferentes. Tire con cuidado de la cuerda de sutura, dejando alrededor de dos centímetros de la cuerda de sutura detrás.Utilice el soporte de la aguja para ayudar a atar el nudo de un cirujano. Masajee suavemente la almohadilla para los pies para asegurarse de que ningún tinte azul Evans pase el sitio de la sutura, luego corte la cuerda sobrante con tijeras. Suturar los otros vasos linfáticos aferentes, luego cerrar la incisión de la piel con la misma sutura que se utilizó para los vasos linfáticos.Para el control falso, inyectar indestro veces cinco microlitros de 1%Evans tinte azul en la almohadilla del pie izquierdo, y masajear la almohadilla de pie. Abra la piel con una incisión y luego cierre la herida sin suturar el vaso. Al monitorear el ratón después de la cirugía, la pierna derecha debe mostrar edema, con tinte azul Evans extendiéndose al muslo, mientras que la pierna de control mostrará el tinte azul Evans restringido a la almohadilla del pie.Inmediatamente después de la cirugía, inyectar indestro como intradérgicamente 10 microlitros de 2%FITC tanto en la almohadilla derecha como en la izquierda. Dos, seis y 12 horas después de la inyección de FITC, recoger los ganglios linfáticos popliteales de la fosa de ratones eutanizados. Retire cuidadosamente el tejido adiposo perinodal alrededor de los pLN.Incruste los pLN en un compuesto de temperatura de corte óptimo con el área medular del seno orientada al lado del molde criogénico. Usa un criotomo para preparar secciones congeladas de 20 micras. Para determinar la distribución fitC en los pNN, imagine las criosecciones bajo un microscopio confocal.Las imágenes confocales capturadas dos, seis y 12 horas después de la inyección de FITC muestran una acumulación de FITC sustancialmente reducida en los ganglios linfáticos popliteales después de suturar los vasos linfáticos aferentes. El FITC residual en los pNN se acumuló preferentemente en los senos paranasales de los ganglios linfáticos. Las imágenes confocales del tejido adiposo perinodal muestran cuando los vasos linfáticos están bloqueados por sutura, FITC entra en el tejido cuando el ganglio linfático senos paranases, pero no se distribuye eficazmente a través de los ganglios linfáticos.Al intentar este método, es importante recordar que insertar la aguja de sutura entre el vaso sanguíneo y el vaso linfático es fundamental. El fracaso de este paso puede romper los vasos. Después de realizar este método, es posible inmunizar a los ratones con infección u otra estimulación inmune para estudiar cómo el flujo linfático regula la protección inmune.La función del flujo linfático no se entiende bien. Este método se puede utilizar para estudiar las migraciones celulares en el ganglio linfático en ausencia de flujo linfático.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

No quirúrgico instilación intratraqueal de ratones con el análisis de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón por citometría de flujo

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

La linfa mesentérica Conducto canulado Rata Modelo: Aplicación de la Evaluación de Intestinal Linfático Transporte de Drogas

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

La tinción intracelular y citometría de flujo para identificar subconjuntos de linfocitos dentro de murino aorta, riñón y los ganglios linfáticos en un modelo de hipertensión

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Trombosis venosa profunda inducida por estasis en los ratones controlados por sonografía de alta frecuencia

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...