Name: blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Författarna tackar Ava Zardynezhad för korrekturläsning av manuskriptet. Detta arbete stöds av Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035), och Canada Foundation for Innovation for SL (32930), och av National Natural Science Foundation of China för Yujia Lin (81901576).

Allt djurarbete behöver godkännas av den institutionella och statliga etik- och djurhanteringskommittén.  Detta är en icke-överlevnad kirurgi.
1. Beredning av material
<ol><li>Förbered 100 mL av 70% etanol genom att blanda 70 mL av 100% etanol med 30 mL sterilt vatten. Autoklav alla kirurgiska verktyg före operation och hålla verktygen i 70% etanol före och under operationen för att upprätthålla sterilisering.</li>
	<li>Förbered en injektionsapparat.<ol>
<li>Skär ~30 cm polyet...

<ol>
	<li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels.">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li><li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microlymphatics+and+lymph+flow.">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li><li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle.">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li><li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions,+measured+in+draining+lymph.">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li><li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels.">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li><li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation:+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct.">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism.">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread.">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li><li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens.">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li><li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules.">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li><li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex.">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li><li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone.">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li><li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression.">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li><li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GlyCAM-1,+an+endothelial+ligand+for+L-selectin,+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow.">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li><li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+organ+development:+from+ontogeny+to+neogenesis.">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li><li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment.">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li><li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice.">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route.">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li><li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema.">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).</li></ol>

Blockerande lymfflöde kommer att ha breda tillämpningar i manipulera antigen leverans till LN i friska och sjuka förhållanden. Det är möjligt att använda denna metod för att kontrollera tidpunkten för antigenleverans för att studera hur kontinuerligt lymfflöde reglerar immunsvar vid avtappning av LNs. Denna metod för lymfflödesavbrott kan också användas för att studera hur lymfan påverkar cellfackindelning, cellaktivering, cellmigration och cell-cellinteraktioner i LN.
Möss s...

Den rumsliga organisationen av det lymfatiska systemet ger strukturella och funktionella stöd för att effektivt ta bort extracellulära vätska och transportera antigener och antigen-presentera celler (APCs) till den dränerande LNs. De inledande lymfkärl (även namngivna lymfatiska kapillärer) är mycket genomsläpplig på grund av deras diskontinuerliga intercellulära korsningar, som underlättar effektiv insamling av vätskor, celler, och andra material från omgivande extracellulära utrymmen1. De inledande lymfkärlen slås samman till att samla lymfkärl, som har snäva intercellulära korsningar, en kontinuerlig källare membran, och lymfatisk muskel täckning. Samla lymfkärl är ansvariga för transport av insamlade lymfa till dränerande LNs och så småningom återvänder lymfantill cirkulationen 2,3. De samlande lymfkärlen som driver lymfan in i den dränerande LN är de afferentalymfkärlen 4,5,6,7. Obstruktion av afferenta lymfkärl kan blockera lymfflödet i LNs, vilket är en användbar teknik när man studerar funktionen av lymfflödet.
Tidigare studier har visat att lymfflödet spelar en viktig roll i transporten av antigener och APC, samt upprätthålla LN homeostas. Det är väl underförstått att vävnadsbaserade APC-enheter, typiskt aktiverade migrerande dendritiska celler (DCs), färdas genom de afferenta lymfkärlen till LN för att aktivera T-celler8. Tanken att friform antigener, såsom mikrober eller lösliga antigener, passivt flöde med lymfa till LN för att aktivera LN-resident APC har fått acceptans under det senaste decenniet9,10,11,12. Fritt form antigener reser med lymfa ta minuter efter infektionen att resa till LN, och LN-resident cell aktivering kan ske inom 20 min efter stimuleringen. Detta är mycket snabbare än aktiveringen av migrerande DCs, som tar mer än 8 h för att komma in i dränerande LN9. Förutom att transportera antigener för att initiera immunskydd, bär lymfa också cytokiner och DCs till LN för att behålla sin mikromiljö, och för att stödja immuncell homeostas13,14. Tidigare, blockerande lymfflödet genom suturering de afferenta lymfkärl visat att lymfan krävs för att upprätthålla HEV fenotyp som krävs för att stödja homeostatiska T-cell och B-cell homing till LN15,16,17. CCL21 är en kritisk chemokine som leder DC och T cell positionering i LN8,18. Blockerande lymfflöde avbryter CCL21-uttrycket i LN och avbryter potentiellt DC- och T-cellpositionering och/eller interaktion i LN19. Blockerande lymfflöde kan således direkt eller indirekt upphäva antigen/DC-åtkomst till den dränerande LN genom att störa LN-mikromiljö som reglerar immunsvar i LN. För att bättre undersöka funktionen av lymfflödet presenteras ett experimentellt protokoll (Figur 1) för att blockera lymfflödet hos möss genom suturering av de afferenta lymfkärlen från fotplattan till pLN. Denna metod kan vara en viktig teknik för framtida studier om lymffunktion i friska och sjuka tillstånd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td></td>
			<td>University of Calgary distribution services UN1170.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>Nair Sensitive Formula Hair Removal Cr&#232;me with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>F7250-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connect one end of polyethylene tubing to 30G &#215; &#189; needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G &#215; &#189; needle. Insert the blunt end of the 30G &#215; &#189; needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 &#956;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Forcep straight</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14218-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Narketan</td>
			<td>DIN 02374994</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (26Gx3/8)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (30Gx1/2)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paton Needle Holder</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS6403</td>
			<td>Straight, Without Lock; Serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (1.25cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (2.5cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Davis and Geck CYANAMID Canada</td>
			<td>11/04</td>
			<td>0.7 metric monofilament polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1ml)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS scissors</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>14122-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>DIN02169606</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice

Lymfkärl är avgörande för att upprätthålla vävnadsvätskan balans och optimera immunskydd genom att transportera antigener, cytokiner, och celler till dränerande lymfkörtlar (LNs). Avbrott i lymfflödet är en viktig metod när man studerar funktionen av lymfkärl. De afferenta lymfkärlen från murin footpad till popliteal lymfkörtlarna (pLNs) är väldefinierade som de enda vägarna för lymfdränage in i pLNs. Suturering dessa afferenta lymfkärl kan selektivt förhindra lymfflödet till pLNs. Denna metod möjliggör störningar i lymfflödet med minimal skada på lymfatiska endotelceller i dränerande pLN, de afferenta lymfkärlen, liksom andra lymfkärl runt området. Denna metod har använts för att studera hur lymfa påverkar höga endoteliala venules (HEV) och chemokine uttryck i LN, och hur lymfa flyter genom fettvävnaden kring LN i avsaknad av funktionella lymfkärl. Med det växande erkännandet av betydelsen av lymffunktionen kommer denna metod att ha bredare tillämpningar för att ytterligare riva upp funktionen av lymfkärl i regleringen av LN-mikromiljö och immunsvar.

Lymfkärl sutur har använts i tidigare studier15,16,17,19, där det fungerade som ett viktigt verktyg för att studera funktionen av lymfflödet innan molekylärbiologi av lymfkärl var bättre förstås. Blockera lymfflödet avbryter LN homeostas, vilket leder till HEVs förlora den kritiska genuttryck som behövs för optimal lymfocyt homing till LN15,<sup ...

Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Ett protokoll för att blockera lymfa flöde genom kirurgiska suturering av afferent lymfkärl presenteras.

Blockering Lymfflödet genom suturering afferenta lymfkärl hos möss

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Denna metod avbryter lymfflödet med minimal skada på lymfatiska endotelceller, och med exakt kontroll av blockad timing, det kan användas för att studera hur lymfflödet påverkar homeostas och immunsvar i lymfkörtknutor. Att hjälpa till att demonstrera proceduren blir Jingna Xue, en doktorand från mitt laboratorium. För att förbereda en injektionsapparat, skär cirka 30 centimeter av polyetenrör.Anslut nålspetsen A till ena änden av slangen. Försiktigt rubba en annan nål, och anslut den trasiga sidan till den andra änden av polyeten slangar. Sätt sedan fast nål A på en en milliliter tuberkulinspruta.Omedelbart före användning, förbereda en 10:1 ketamin-xylazine blandning i saltlösning. Efter sövning musen genom att injicera 250 mikroliter av ketamin / xylazin blandningen intraperitoneally, säkerställa full anesthetization med en tå nypa. Raka pälsen runt benen med hårklippningsmaskiner, applicera sedan avhårningskräm runt benet.Efter fem minuter, torka bort kvarvarande päls och depilatory grädde med hjälp av en fuktig vävnad, rengör sedan benet med sterilt vatten. Spraya 70%etanol runt benet för att sterilisera driftområdet. Placera musen i ett utsatt läge, och använd kirurgisk tejp för att exponera operationsområdet på höger ben.Intradermally injicera fem mikroliter av 1%Evans blå färgämne, eller nio centimeter av vätskan från injektionsapparaten slangar i höger fot pad av musen. Massera försiktigt fotplattan för att hjälpa vätskan in i lymfkärlen. Under ett dissekerande mikroskop, lokalisera ett snitt plats fem millimeter från botten kanten av popliteal fossa.Med hjälp av en sax, gör ett litet snitt ungefär fem millimeter i längd. Använd sedan fina operation-forceps för att sträcka snittet och exponera de samlande lymfkärlen. Identifiera båda de afferenta lymfkärl som leder till de popliteal lymfkörtlarna.Med hjälp av en nålhållare, försiktigt in suturen nålen mellan afferenta lymfkärl och saphenous artär. Dra försiktigt ut nålen runt de afferenta lymfkärlen. Dra försiktigt sutursträngen och lämna cirka två centimeter av sutursträngen bakom.Använd nålhållaren för att hjälpa till att knyta en kirurgsknop. Massera försiktigt fotdynan för att säkerställa att inget Evans blått färgämne passerar suturplatsen, skär sedan den överflödiga strängen med sax. Suturera de andra afferenta lymfkärlen, stäng sedan huden snitt med samma sutur som användes för de lymfatiska fartyg.För den simulerade kontrollen injicerar intradermally fem mikroliter av 1%Evans blått färgämne i vänster fotdyna och massera fotdynan. Öppna huden med ett snitt, och stäng sedan såret utan att suturera kärlet. Vid övervakning av musen efter operationen, det högra benet bör visa ödem, med Evans blå färgämne sprider sig till låret, medan kontrollbenet kommer att visa Evans blå färgämne begränsas till foten pad.Omedelbart efter operationen injicera intradermally 10 mikroliter av 2%FITC i både höger fot pad och vänster. Två, sex och 12 timmar efter FITC-injektionen samlar du in de popliteala lymfkörtlarna från fossa av avlivade möss. Avlägsna noggrant perinodal fettvävnaden runt pLNs.Bädda in pLNs i optimal skärtemperatur förening med medullary sinus området vänd mot sidan av kryo mögel. Använd en cryotome för att förbereda 20-micron frysta sektioner. För att bestämma FITC-fördelningen i pLN-erna, avbilda kryosektionerna under ett konfokalmikroskop.Confocal bilder tagna två, sex och 12 timmar efter FITC injektion visar avsevärt minskad FITC ackumulering i popliteal lymfkörtlarna efter suturering de afferenta lymfkärlen. Resterande FITC i pLNs var företrädesvis ackumuleras i lymfkörtel bihålorna. Confocal bilder av perinodal fettvävnad visar när lymfkärl blockeras av suturering, FITC kommer in i vävnaden när lymfkörtknutorna bihålorna, men det är inte effektivt distribueras i hela lymfkörtlarna.När du försöker denna metod, Det är viktigt att komma ihåg att infoga suturen nålen mellan blodkärlet och det lymfatiska kärlet är kritisk. Fel på detta steg kan bryta fartygen. Efter att ha utfört denna metod, Det är möjligt att immunisera möss med infektion eller annan immunstimulering för att studera hur lymfflödet reglerar immunförsvaret.Funktionen av lymfflödet är inte väl förstått. Denna metod kan användas för att studera cell migrationer i lymfkörten i avsaknad av lymfa flöde.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mätning Calpain aktivitet inom fast och levande celler med flödescytometri

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Icke-kirurgisk intratrakeal instillation av möss med analys av lungor och Lungsjukas Tömning lymfkörtlar med flödescytometri

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Den kröslymfknutor Duct kanylerad Rat Model: Ansökan om bedömning av Intestinal Lymfatisk Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Vasodilatation av isolerade fartyg och isolering av den extracellulära matrisen av Tight-skin Möss

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Intracellulär färgning och flödescytometri för att identifiera lymfocytundergrupper inom Murina Aorta, njure och lymfkörtlar i en modell of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolering och In Vitro kultur av murina och mänskliga alveolära makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Djup ventrombos som induceras av Stasis hos möss som övervakas av högfrekvent ultraljud

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Rötning av murina levern för ett flöde flödescytometrisk analys av lymfatiska endotelceller

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Bestämning av regulatoriska T-Cell Subsets i murina tymus, pankreas dränerande lymfkörtel och mjälte med flödescytometri

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...