Name: blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Yazarlar ava Zardynezhad'a el yazmasının okunması için teşekkür ediyor. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIHR, PJT-156035) ve Kanada Yenilik Vakfı SL (32930) ve Yujia Lin için Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81901576) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan çalışmalarının kurumsal ve devlet etiği ve hayvan işleme komitesi tarafından onaylanması gerekmektedir.  Bu sağkalım dışı bir ameliyat.
1. Malzemelerin hazırlanması
<ol><li>70 mL 100 etanol ile %100 etanol karıştırılarak 100 mL 70 etanol hazırlayın. Ameliyat öncesi tüm cerrahi araçları otoklav ve sterilizasyon korumak için ameliyat öncesi ve sırasında% 70 etanol araçları tutmak.</li>
	<li>Bir enjeksiyon cihazı hazırlayın.<ol>
<li>Yaklaşık 30 ...

<ol>
	<li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels.">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li><li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microlymphatics+and+lymph+flow.">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li><li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle.">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li><li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions,+measured+in+draining+lymph.">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li><li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels.">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li><li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation:+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct.">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li><li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism.">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread.">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li><li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens.">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li><li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules.">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li><li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex.">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li><li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone.">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li><li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression.">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li><li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GlyCAM-1,+an+endothelial+ligand+for+L-selectin,+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow.">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li><li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+organ+development:+from+ontogeny+to+neogenesis.">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li><li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment.">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li><li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice.">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route.">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li><li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema.">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).</li></ol>

Lenf akışını niçin bloke etmek, sağlıklı ve hastalıklı koşullarda LN'ye antijen teslimatını manipüle etmede geniş uygulamalara sahip olacaktır. Sürekli lenf akışının NN'lerin boşaltIlmesinde bağışıklık yanıtını nasıl düzenlediğini incelemek için antijen doğumunun zamanlamasını kontrol etmek için bu yöntemi kullanmak mümkündür. Lenf akışı kesinti Bu yöntem de lenf etkileri hücre komedizasyonu, hücre aktivasyonu, hücre göçü ve LN hücre hücre etkileşimleri nasıl çalı...

Lenfatik sistemin mekansal organizasyonu, hücre dışı sıvıyı verimli bir şekilde çıkarmak ve antijenleri ve antijen sunan hücreleri (AAP'ler) drenaj lı LN'lere verimli bir şekilde çıkarmak için yapısal ve fonksiyonel destek sağlar. İlk lenfatik damarlar (lenfatik kılcal damarlar olarak da adlandırılır) sıvıların, hücrelerin ve diğer malzemelerin çevredeki hücre dışı alanlardan etkili bir şekilde toplanmasını kolaylaştıran kesintisiz hücreler arası kavşakları nedeniyle son derece geçirbilebilirdir1. İlk lenfatik damarlar sıkı hücreler arası kavşaklar, sürekli bir bazal membran ve lenfatik kas kapsama sahip lenfatik damarları toplama içine birleştirmek. Lenfatik damarların toplanması, toplanan lenflerin drenaj LN'lerine taşınmasından ve sonunda lenflerin dolaşıma geri dönmesinden sorumludur2,3. Drenaj LN içine lenf itmek toplama lenf damarları afferent lenfatik damarlar4,5,6,7. Afferent lenfatik damarların tıkanıklığı LNs içine lenf akışını engelleyebilir, hangi lenf akışının işlevini incelerken yararlı bir tekniktir.
Önceki çalışmalar lenf akımı antijenler ve AAP'ler taşıma önemli bir rol oynadığını göstermiştir, yanı sıra LN homeostazı korumak. Doku kaynaklı AKO'ların, tipik olarak aktif olarak göç eden dendritik hücreler (DCs) ile T hücrelerini aktive etmek için LN'ye giden varlıklı lenfatik damarların t hücreleri8. Fikir serbest form antijenler, mikroplar veya çözünür antijenler gibi, ln yerleşik AAP'leri etkinleştirmek için LN lenf ile pasif akışsonon yıl içinde kabul kazanıyor olmuştur 9,10,11,12. Lenf ile seyahat serbest form antijenler LN seyahat enfeksiyon dan sonra dakika sürer, ve LN-yerleşik hücre aktivasyonu 20 dakika içinde stimülasyon oluşabilir. Bu çok göç DC'lerin aktivasyonu daha hızlıdır, hangi drenaj LN girmek için 8 saatten fazla sürer9. Bağışıklık koruma başlatmak için antijenler taşıma yanı sıra, lenf de mikroortamını korumak için LN sitokinler ve DCs taşır, ve bağışıklık hücresi homeostaz desteklemek için13,14. Daha önce, afferent lenfatik damarları dikerek lenf akışını engelleme lenfln 15, 16,17homeostatik T hücre ve B hücre homing desteklemek için gerekli HEV fenotip korumak için gerekli olduğunu gösterdi . CCL21LNDC ve T hücre konumlandırma yönlendirir kritik bir kemokin 8,18. Lenf akışının engellenmesi LN'deki CCL21 ekspresyonunu kesintiye uğratur ve LN19'dakiDC ve T hücre konumlandırmasını ve/veya etkileşimini potansiyel olarak kesintiye uğratur. Böylece, lenf akışını niçin bloke etmek, LN'deki bağışıklık yanıtlarını düzenleyen LN mikroortamını bozarak antijen/DC'nin drenaj LN'ye erişimini doğrudan veya dolaylı olarak engelleyebilir. Lenf akışının işlevini daha iyi araştırmak için, pediyeden pLN'ye kadar olan afferent lenfatik damarları dikerek farelerdeki lenf akışını engellemek için deneysel bir protokol(Şekil 1)sunulur. Bu yöntem sağlıklı ve hastalıklı koşullarda lenfatik fonksiyon üzerinde gelecekteki çalışmalar için önemli bir teknik olabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Greenfield Global</td>
			<td></td>
			<td>University of Calgary distribution services UN1170.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>Nair Sensitive Formula Hair Removal Cr&#232;me with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>F7250-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connect one end of polyethylene tubing to 30G &#215; &#189; needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G &#215; &#189; needle. Insert the blunt end of the 30G &#215; &#189; needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 &#956;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Forcep straight</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14218-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Narketan</td>
			<td>DIN 02374994</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (26Gx3/8)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (30Gx1/2)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paton Needle Holder</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS6403</td>
			<td>Straight, Without Lock; Serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (1.25cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape (2.5cmx9.1m )</td>
			<td>Transpore</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Davis and Geck CYANAMID Canada</td>
			<td>11/04</td>
			<td>0.7 metric monofilament polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1ml)</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS scissors</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>14122-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>DIN02169606</td>
			<td>The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blocking lymph flow by suturing afferent lymphatic vessels in mice

Lenfatik damarlar doku sıvıdengesini korumak ve antijenler, sitokinler ve hücreleri drenaj lenf düğümleri (LNs) taşıyarak bağışıklık koruma optimize kritik öneme vardır. Lenf akıtıcıdamarların işlevini incelerken lenf akışının kesilmesi önemli bir yöntemdir. Murine footpad popliteal lenf düğümleri için afferent lenf damarları (pLNs) iyi pLNs içine lenf drenaj için tek yol olarak tanımlanır. Bu afferent lenfatik damarları niçin seçici olarak pLN'lere lenf akışını önleyebilir. Bu yöntem drenaj pLN lenfatik endotel hücrelerine minimal hasar ile lenf akışında girişim sağlar, afferent lenfatik damarlar, yanı sıra alan etrafında diğer lenfatik damarlar. Bu yöntem lenf etkileri yüksek endotel venülleri nasıl çalışma için kullanılmıştır (HEV) ve LN kemokin ekspresyonu, ve nasıl lenf fonksiyonel lenfatik damarların yokluğunda LN çevreleyen yağ dokusu ile akar. Lenfatik fonksiyonun öneminin giderek daha fazla tanınması ile, Bu yöntem ln mikroçevre ve bağışıklık yanıtları düzenleyen lenfatik damarların işlevini daha da çözmek için daha geniş uygulamalar alacaktır.

Lenfatik damar sütür önceki çalışmalarda kullanılmıştır15,16,17,19, lenfatik damarların moleküler biyoloji daha iyi anlaşılmadan önce lenf akışının işlevini incelemek için önemli bir araç olarak görev yaptı. Bloke lenf akımı LN homeostazı keser, Hangi HEVs LN optimal lenfosit homing için gerekli kritik gen ekspresyonu kaybetmeyol açar15...

Watch this Scientific Journal Video about Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice at JoVE.com

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Afferent lenfatik damarların cerrahi dikiş ile lenf akışını engellemek için bir protokol sunulmaktadır.

Farelerde Afferent Lenfatik Damarlar Dikerek Lenf Akışını Engelleme

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Bu yöntem lenfatik endotel hücrelerine minimal hasar ile lenf akışını keser, ve abluka zamanlaması kesin kontrolü ile, lenf akışının lenf düğümünde homeostazı ve bağışıklık yanıtlarını nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir. Prosedürü niçin göstermek için yardımcı Jingna Xue, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Bir enjeksiyon cihazı hazırlamak için, polietilen boru yaklaşık 30 santimetre kesti.İğne A'nın ucunu tüpün bir ucuna bağlayın. Dikkatle başka bir iğne çıkarmak ve polietilen boru diğer ucuna kırık tarafı bağlayın. Sonra bir mililitrelik tüberkülin şırınga iğne A takın.Kullanmadan hemen önce, tuzlu bir 10:1 ketamin-ksilazin karışımı hazırlayın. Ketamin/ksilazin karışımının 250 mikrolitresini intraperitoneal olarak enjekte ederek fareyi anestezi ettikten sonra, ayak ucu tutam ile tam anestezi sağlar. Saç makası ile bacaklar etrafında kürk tıraş, sonra bacak etrafında tüy dökücü krem uygulayın.Beş dakika sonra, artık kürk ve pilatif krem nemli bir doku kullanarak silin, sonra steril su ile bacak temizleyin. Ameliyat alanını sterilize etmek için bacağın etrafına %70 etanol püskürtün. Fareyi yatkın bir konuma yerleştirin ve ameliyat alanını sağ bacakta ortaya çıkarmak için cerrahi bant kullanın.Intradermally farenin sağ ayak pedi içine enjeksiyon cihazı tüp sıvının% 1 Evans mavi boya, ya da dokuz santimetre beş mikrolitre enjekte. Sıvılenfatik damarlara girmesine yardımcı olmak için ayak yastığına hafifçe masaj edin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, popliteal fossa alt kenarından beş milimetre bir kesi sitesi bulmak.Bir makas kullanarak, yaklaşık beş milimetre uzunluğunda küçük bir kesi yapın. Sonra kesi germek ve toplama lenfdamarları ortaya çıkarmak için ince operasyon forseps kullanın. Popliteal lenf düğümlerine giden afferent lenfatik damarların her ikisini de tanımlayın.Bir iğne tutucu kullanarak, ihtiyatlı afferent lenfatik damarlar ve safenöz arter arasında dikiş iğnesi takın. Yavaşça afferent lenfatik damarların etrafında iğne çekin. Dikkatle arkasında dikiş dize yaklaşık iki santimetre bırakarak, dikiş dize çekin.Bir cerrahın düğüm bağlamak için iğne tutucu kullanın. Yavaşça hiçbir Evans mavi boya dikiş site geçer sağlamak için ayak yastığı masaj, sonra makas ile aşırı dize kesti. Dikiş diğer afferent lenfatik damarlar, daha sonra lenfatik damarlar için kullanılan aynı dikiş ile deri kesi kapatın.Sham kontrolü için, intradermally sol ayak yastığı% 1 Evans mavi boya beş mikrolitre enjekte ve ayak pedi masaj. Bir kesi ile deri açın ve sonra damar dikiş olmadan yara kapatın. Ameliyat sonrası fareyi izlerken sağ bacakta ödem gösterilmelidir, Evans mavi boya uyluk yayılırken, kontrol bacağında evans mavi boya ayak yastığıile sınırlı olarak gösterilmelidir.Ameliyattan hemen sonra, intradermally sağ ayak pedi ve sol hem de% 2 FITC 10 mikrolitre enjekte. FITC enjeksiyonundan iki, altı ve 12 saat sonra, ötenazi yapılan farelerin fossasından popliteal lenf düğümlerini toplayın. PLN'lerin etrafındaki perinodal yağ dokusunu dikkatlice çıkarın.PLN'leri, kriyo kalıbının yan tarafına bakan medüller sinüs alanı ile optimum kesme sıcaklığı bileşiğine gömün. 20 mikron dondurulmuş bölümleri hazırlamak için bir kriyotom kullanın. PLN'lerde FITC dağılımını belirlemek için, konfokal mikroskop altında kriyo-kesitleri görüntüleyin.Confocal görüntüler iki yakalanan, altı, ve 12 saat FITC enjeksiyonundan sonra afferent lenf damarları dikiş sonra popliteal lenf düğümlerinde FITC birikimi önemli ölçüde azaltılmış göstermektedir. PLN'lerde kalan FITC tercihen lenf nodu sinüslerinde birikmişti. Perinodal yağ dokusunun konfokal görüntüleri lenfdamarları dikiş tarafından bloke edildiğinde göstermek, FITC lenf düğümü sinüsler doku girer, ama etkili lenf düğümleri boyunca dağıtılan değil.Bu yöntemi denerken, bu kan damarı ve lenfatik damar arasında dikiş iğnesi ekleme kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu adımın başarısız lığı damarları kırabilir. Bu yöntemi yaptıktan sonra, lenf akışının bağışıklık korumasını nasıl düzenlediğini incelemek için fareleri enfeksiyon veya diğer bağışıklık stimülasyonu ile aşılamak mümkündür.Lenf akışının işlevi iyi anlaşılamamıştır. Bu yöntem lenf akımı yokluğunda lenf düğümünde hücre göçleri çalışmak için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Mezenterik Lenf Kanal Kanüllü Rat Modeli: Bağırsak Lenfatik İlaç Ulaştırma Değerlendirilmesine Uygulaması

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

İzole Kapların vazodilatasyon ve Sıkı cilt Fare Ekstraselüler Matrix İzolasyonu

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Derin Ven Trombozu Staz farelerde yüksek frekans Ultrasonografi tarafından izlenen tarafından indüklenen

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...