Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

ونحن نعترف موناش التصوير الصغرى لاستخدام نيكون C1 تستقيم مجهر الليزر confocal ومنصة الهستولوجيا موناش لمعالجة أنسجة الكلى.

هذه الطريقة تمكن من الكشف عن عموم ecDNA من جميع أشكال موت الخلايا. وتستخدم نفس الطريقة والأجسام المضادة لالأنسجة خزعة الكلى البشرية (من الخطوة 4). جميع البشر والحيوانات كان على موافقة الأخلاقيات من جامعة موناش، وموناش الصحة، كلايتون، فيكتوريا، أستراليا.
1. تلطيخ ل ecDNA مع DAPI و β -Act...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection.">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+the+significance+of+apoptosis.">Cell death: the significance of apoptosis.</a> International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).</li><li>Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+one+way+to+die:+apoptosis,+necrosis+and+reactive+oxygen+damage.">More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage.</a> Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).</li><li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+its+role+in+inflammation.">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

توجد بروتوكولات متعددة تقيس علامات البروفات في المصل والبول لكل من المرضى ونماذج الماوس من التهاب الكريات. يسمح هذا البروتوكول الموصوف بتحليل منتجات موت الخلايا (ecDNA وNETs وecMPO) داخل الكبيات مباشرة. الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو إعداد الأنسجة والتصوير. العنصر الرئيسي المقيد لاس?...

Myeloperoxidase المضادة للعدلات cytoplasmic الأجسام المضادة المرتبطة بهشاشة الأوعية الدموية (MPO-AAV) هو مرض المناعة الذاتية التي تؤدي إلى الفشل الكلوي من الإصابة الكبيبية المرضية مع موت الخلايا كبيرة وإطلاق حمض ديوكسي تريبونوكلليك (الحمض النووي)1,2. الحمض النووي يمكن تنشيط الجهاز المناعي من خلال العمل كإشارة الخطر. في ظل الظروف الصحية العادية، يوفر الموقع النووي للحمض النووي الحماية من التعرض للجهاز المناعي. الحمض النووي الذاتي الذي يتم تحريره خارج الخلية خلال العمليات المسببة للأمراض أو autoimmunity ينظر إليه من قبل الجهاز المناعي باعتباره الضرر proinflammatory قوية المرتبطة البروتين الذاتي الجزيئي (DAMP)3. يتم تحرير الحمض النووي الخلوي الإضافي (ecDNA) من الخلايا المحتضرة من خلال العديد من الآليات المتميزة التي تحكمها مسارات بيوكيميائية متميزة ، مثل المبرمج ، نخر العدلات العدلات تكوين فخ خارج الخلية (NETs) ، نخر أو pyroptosis4،5،6،,8.8
نحن وصف هنا أساليب لطخة وقياس ecDNA صدر من الخلايا المحتضرة في أقسام من البارافين ثابتة (FFPE) الكليتين من التجريبية المضادة MPO GN وخزعات الكلى من المرضى الذين يعانون من MPO-AAV9,10. توجد طرق متعددة للكشف عن تعميم الحمض النووي المزدوج (DsDNA) ومجمعات الحمض النووي من كل من المصل والبول ومن المختبرات11,12. هذه الطرق، على الرغم من دقة في تحديد كمية ecDNA، لا تحدد أين يتم تحرير ecDNA تشريحيا. هناك طرق تصف قياس محدد من ecDNA مثل موالف ل المبرمج وقياس حطام الخلية13،14. لا توجد طريقة تصف قياس ecDNA بلغت ذروتها من جميع أشكال موت الخلايا في الكلى FFPE حيث يحدث الضرر المرضي. وهذا أمر مهم لتحديد ما إذا كانت العلاجات العلاجية التجريبية وتطهير ecDNA من مواقع الإصابة المرضية في الجهاز المستهدف الفعلي.
إن الحصول على صور متعددة من عينات الكلى يخلق كمية كبيرة من البيانات التي يتم تحليلها بشكل شائع من قبل مستخدم واحد. هذا كثيف العمالة، تستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تخضع لإعادة إنتاج لا يمكن الاعتماد عليها من قبل المستخدمين الآخرين، وذلك بسبب تحيز المستخدم. تجزئة Weka القابلة للتدريب هو برنامج إضافي مفتوح المصدر لـ ImageJ يستخدم أدوات متطورة للمعلومات الحيوية لتصنيف وحدات البكسل باستخدام خوارزميات التعلم الآلي15،16. هذا الأسلوب هو "تدريب" حيث أنه يتعلم من تصنيف المستخدم من شرائح من بكسل وتطبيق التصنيف الجديد المستفادة على الصور الأخرى. تعتمد هذه الطريقة على أدوات التحليل الشائعة ضمن برنامج ImageJ التي تستخدم "لتصنيف" كل بكسل في مقطع على أنه ينتمي إلى "فئة" معينة. بمجرد أن يتعلم البرنامج "المصنفات"، يمكن استخدامها لتحديد شرائح أخرى مصنفة مماثلة داخل نفس الصورة. ثم يتم حفظ هذا النموذج وتطبيقه على مجموعات أخرى من الصور ضمن نفس التجربة.
العقبات الحالية لتحديد ecDNA في الموقع في أقسام الكلى هو ذاتي endfluorescence الذاتية من التثبيت في formalin وتحليل العمالة الكثيفة من الصور. نحن نصف هنا كيفية إخماد هذا autofluorescence، والكشف عن ecDNA، واستخدام التعلم الآلي تحت إشراف لقياس الإنتاجية عالية من ecDNA. لقد سبق أن نشرنا قياس NETs وMPO خارج الخلية (ecMPO) باستخدام ماكرو في ImageJ ، ونحن الآن نبرهن شبه أتمتة هذه الأساليب باستخدام التعلم الآلي تحت إشراف1. نحن نبرهن على قدرة على التكيف مع أداة التعلم الآلي، لتصنيف بقعة بديلة لـ NETs و ecMPO داخل نفس الصورة. ويمكن ترجمة هذه الأساليب تلطيخ المذكورة هنا للكشف عن ecDNA، NETs وecMPO إلى الأجهزة الصلبة الأخرى والأمراض حيث ecDNA, NETS وecMPO يلعب دورا في إدامة المرض مثل التهاب المفاصل الروماتويدي والذئبة17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

موت الخلايا الكبيبية هو سمة مرضية من النيولوبيروكسيديز المضادة للعدلات الأجسام المضادة السيتوبلازمية المرتبطة التهاب الأوعية الدموية (MPO-AAV). يتم تحرير حمض ديوكسيريبونوكليك (ecDNA) خارج الخلية (ecDNA) خلال أشكال مختلفة من موت الخلايا بما في ذلك موت الخلايا، نخر، نخر، العدلات الفخاخ خارج الخلية (NETs) و pyroptosis. قياس موت الخلية هذا يستغرق وقتا طويلا مع العديد من المؤشرات الحيوية المختلفة اللازمة لتحديد الأشكال الكيميائية الحيوية المختلفة لوفيات الخلايا. يتم قياس ecDNA بشكل عام في المصل والبول كبديل للتلف الكلوي ، وليس في الجهاز المستهدف الفعلي حيث تحدث الإصابة المرضية. الصعوبة الحالية في التحقيق ecDNA في الكلى هو عدم وجود طرق لinslyin الأنسجة المضمنة البرافين الثابتة (FFPE) على حد سواء تجريبيا وفي خزعات الكلى البشرية المؤرشفة. هذا البروتوكول يقدم ملخصا للخطوات المطلوبة لطخة ل ecDNA في أنسجة FFPE (كل من الإنسان و murine) ، وإخماد autofluorescence وقياس ecDNA في الصور الناتجة باستخدام أداة التعلم الآلي من المصدر المفتوح المتاح علنا ImageJ المساعد تدريب تجزئة Weka. يتم تطبيق تجزئة Weka القابلة للتدريب على ecDNA داخل الكبيات حيث يتعلم البرنامج تصنيف ecDNA. يتم تطبيق هذا المصنف على صور الكلى المكتسبة اللاحقة ، مما يقلل من الحاجة إلى التعليقات التوضيحية اليدوية لكل صورة على حدة. وقد ثبت أن القدرة على التكيف من تجزئة Weka القابلة للتدريب أكثر في أنسجة الكلى من التهاب الميرين التجريبي المضاد للكبيباتولونية (GN) ، لتحديد NETs وecMPO ، والمساهمين المرضية المشتركة لمكافحة MPO GN. توفر هذه الطريقة تحليلًا موضوعيًا لـ ecDNA في أنسجة الكلى يوضح بوضوح فعالية برنامج تجزئة Weka القابل للتدريب الذي يمكن أن يميز ecDNA بين أنسجة الكلى الطبيعية السليمة وأنسجة الكلى المريضة. ويمكن بسهولة تكييف هذا البروتوكول لتحديد ecDNA، NETs وecMPO في الأجهزة الأخرى.

تمثل هذه الصور الخطوات المتعددة المطلوبة لاستخدام تجزئة Weka القابلة للتدريب بنجاح لتقليل القياس اليدوي كثيف العمالة لـ ecDNA في أنسجة الكلى FFPE الملطخة بالفلور من فأرة مع GN مضادة MPO. وتتلخص هذه الخطوات في الشكل 1 والشكل 2 مع الصور المأخوذة مباش...

Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

الحمض النووي خارج الخلية (ecDNA) صدر أثناء موت الخلايا هو proinflammatory ويساهم في التهاب. قياس ecDNA في موقع الإصابة يمكن تحديد فعالية العلاج العلاجي في الجهاز المستهدف. يصف هذا البروتوكول استخدام أداة التعلم الآلي لأتمتة قياس ecDNA في أنسجة الكلى.

تحت إشراف التعلم الآلي من أجل تحديد شبه كمي للحمض النووي خارج الخلية في التهاب الجلوميرولونية

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

التهاب الجلوميرولونية يسبب إصابة الكبيات المرضية مع موت الخلايا كبيرة وإطلاق الحمض النووي خارج الخلية. هذا البروتوكول يتيح تصور الحمض النووي خارج الخلية في موقع الإفراج أثناء الإصابة المرضية. وميزة هذه التقنية هي أنه يقيس الحمض النووي خارج الخلية من موت الخلايا في الكلى.على عكس المصل أو البول ، فإن قياس الحمض النووي خارج الخلية هو علامة بديلة للضرر المرضي. أهمية هذه الطريقة هي أن كلا من تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية وتحليل الصور يمكن نقلها بسهولة إلى أمراض المناعة الذاتية الأخرى مثل التهاب المفاصل الروماتويدي والذئبة. هذه الطريقة تتطلب معرفة أساسية من الأنسجة الكلى.لتمكين الكشف الدقيق للحمض النووي الكبيّة خارج الخلية ، يجب أن يكون الباحث قادرًا على تحديد الكبيات بشكل صحيح. لطخ الحمض النووي خارج الخلية، أولا تسخين العينات من الفائدة في رف الشريحة في 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة قبل غمر الشرائح في اثنين من التغييرات 40 دقيقة من المذيبات في غطاء الدخان. بعد الغمر الثاني، اُعاد هيدرات العينات مرتين في 100٪ الإيثانول، ومرّة واحدة في 70٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق لكلّ علاج.بعد العلاج الأخير، واستخدام ملقط لوضع الشرائح في حل استرجاع المستضد الغليان في طنجرة الضغط على ارتفاع لمدة 10 دقائق. بعد كشف الغطاة المستضد، نقل طنجرة الضغط من الحرارة إلى بالوعة وتشغيل المياه الصنبور الباردة على الفور على الغطاء. السماح للشرائح لتكواز لمدة 20 دقيقة في محلول استرجاع المستضد قبل غسل العينات مرتين في 0.01 PBS الضرس على شاكر المداري لمدة خمس دقائق لكل غسل.بعد الغسيل الثاني، استخدم قلماً محمّضًا لرسم دوائر حول عينات أنسجة الكلى ومنع أي تلطيخ غير محدد مع 60 ميكروليتر من مصل الدجاج 10٪ في 5٪ من البوم المصل البقري لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، بعناية استبدال حل حجب مع 60 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية من الفائدة في غرفة الرطوبة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، اغسل الشرائح على شاكر مداري في PBS لمدة دقيقتين لكل غسيل قبل إضافة 60 ميكرولترات من جسم مضاد ثانوي مناسب من الفلوروفور إلى كل شريحة لاحتضان لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني كما هو موضح، تليها العلاج في 0.3٪ أسود السودان في 70٪ الإيثانول لإخماد أي الفلورورس المحتملة التي تسبب في شكلين. بعد 30 دقيقة، قم بغسل الشرائح في ماء الصنبور لإزالة أي ترسبات وغمر الشرائح في PBS لمدة 10 دقائق لمنع أي تشكيل اعجال أسود في السودان. في نهاية الحضانة، قم بتركيب الشرائح على أغطية الزجاج confocal مع ثلاث قطرات 60 ميكرولتر من حل التركيب تكملها DAPI وختم الأغطية مع طلاء الأظافر.السماح للشرائح لعلاج لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخزينها في أربع درجات مئوية محمية من الضوء حتى التصوير عن طريق التصوير المجهري ليزر confocal وفقا للبروتوكولات القياسية. تأكد من ختم الأغطية بتلميع الأظافر لمنع أي حركة أثناء التصوير وتنظيف أغطية الإيثانول لتحسين دقة التصوير.بعد التصوير 20 glomeruli لكل شريحة، فتح تدريب تجزئة Weka البرنامج المساعد في ImageJ وإسقاط الصورة الأولى على شريط الأدوات ImageJ. انقر فوق الصور والألوان والقنوات المنقسمة. ستظهر صورة تُظهر تلطيخ الأجسام المضادة الأساسية.لإنشاء ملف مدمج للصور الفردية، انقر فوق قنوات الألوان والدمج. سيظهر مربع منبثق يطلب تعيين لون لكل قناة. تحقق من إنشاء مركّب والاحتفاظ بالمصادر صور مربعات وانقر فوق موافق. ستظهر صورة مركبة مدمجة.باستخدام الجسم المضاد الرئيسي تلطيخ كدليل، رسم منطقة من الاهتمام حول خصلة الكبيات. لتنفيذ طمس غاوسي على صورة DAPI زرقاء واحدة، انقر فوق عملية، والمرشحات، وطمس غاوسي. تعيين طمس في واحد إلى اثنين.سوف تصبح الصورة ضبابية قليلا، ولكن سوف تظهر على نحو سلس نواة، سيتم تخفيف الخلفية. بعد ذلك ، انقر فوق الإضافات ، والتجزئة ، وتجزئة Weka القابلة للتدريب ، واستخدام أداة اليد الحرة لتتبع النوى سليمة. عندما تم إضافة كافة النوى من الفائدة، إضافة فئة مربع واحد، استخدم أداة خط لتحديد مساحات الخلفية إلى مربع الفئة اثنين.انقر فوق إنشاء فئة جديدة واستخدام أداة الخط لتحديد الحمض النووي خارج نونويلر الملطخة بـ DAPI. انقر فوق مصنف القطار والحصول على احتمال. قم بتبديل الماوس للحصول على صورة بالأبيض والأسود لكافة المكونات مع تمييز كائن التحديد باللون الأبيض.لتكرار هذه الصورة، انقر فوق الصورة ثم انقر فوق التكرار. تحت الصورة، وضبط وعتبة. استخدم زر الماوس لضبط العتبة حتى يتم ملاحظة الحمض النووي خارج الخلية فقط.بعد العتبة، انقر فوق عملية، ثنائي، وجعل ثنائي، ونسخ المنطقة الكبيات التي تم إنشاؤها سابقا من الفائدة. اضغط على Control Shift E لتحديد التحرير والتحديدات والاستعادة لاستعادة التحديد. لقياس فقط جزيئات الحمض النووي خارج الخلية داخل الكبيات، انقر فوق تحليل الجسيمات و OK. سيتم إنشاء ورقة نتائج توضح عدد الجسيمات والمساحة والبكسل المتوسط والنسبة المئوية للحمض النووي الكبيبات التي تحتوي على الحمض النووي خارج الخلية.لحفظ المصنف كمصنف الحمض النووي خارج الخلية، انقر فوق حفظ المصنف وحفظ البيانات. لإعادة تطبيق الطراز على الصور اللاحقة، كرر معالجة الصورة الأولية كما هو موضح قبل تحديد مصنف التحميل وملف المصنف المحفوظ. قائمة السجل سوف يطفو على المنبثقة وتشغيل النموذج.بمجرد تشغيل النموذج، انقر فوق تحميل البيانات وحدد extracellularDNA.arff. ثم انقر فوق إنشاء نتيجة. إذا فشلت الصورة الناتجة في التقاط جميع النوى أو الخلفية أو الحمض النووي خارج الخلية، فانقر على مصنف إعادة التدريب وإضافة المزيد من المصنفات حسب الضرورة.هنا، تظهر صور قناة واحدة الحمض النووي التمثيلي وتلطيخ بيتا أكتين. دمج الصورتين يسمح منطقة ذات أهمية أن يتم رسمها حول المنطقة الكبيبية لقياس الحمض النووي خارج الخلية داخل كبيبات الكلى الماوس باستخدام تجزئة Weka التدريب كما هو موضح. يمكن اعتماد هذا النموذج لتحديد الحمض النووي خارج الخلية في عينات خزعة الكلى من مريض التحكم أو مقارنة مع خزعة الكلى من مريض مصاب بالتهاب الأوعية الدموية المرتبط بـ ANCA.وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ترجمة هذا البرنامج إلى بقع أخرى داخل عينات أنسجة الكلى، على سبيل المثال، إلى وصمة عار عن الفخاخ العدلات خارج الخلية وترسب النخاع خارج الخلية في التهاب الأوعية الدموية المرتبط ANCA. الأهم من ذلك، لا توجد اختلافات كبيرة عند تحليل نفس البيانات من قبل عدة مستخدمين. الخطوة الأكثر أهمية من التحليل هو تقديم ما يكفي من الأمثلة من الخلفية، النوى، والحمض النووي خارج الخلية مع كبيبات كمصنفات لبرنامج تجزئة ويكا للتعلم من.هذا الأسلوب قابل للتحويل بسهولة. على سبيل المثال، يمكن إجراء مزيد من التحليل لأنواع مختلفة من موت الخلايا من خلال التلطيخ للأجسام المضادة المحددة ضد علامات ل المبرمج أو النخر. يمكن استخدام أسلوبنا مع العمليات الالتهابية الأخرى مثل تقييم تعبير TLR في أمراض الكلى الذاتية أو تعبير النخاع خارج الخلية في خزعات الكلى البشرية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

الفخاخ خارج الخلية العدلات : كيفية إنشاء وتصور لهم

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

تطوير خلية من نوع معين الأبتامرات gp120 المضادة لفيروس الإيدز لتسليم سيرنا

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان<em&gt; في المختبر</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

التصوير Ratiometric الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في الأغشية الحيوية الأسنان

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

طرق لدراسة الدهون التعديلات في العدلات وتشكيل لاحقة من الفخاخ خارج الخلية العدلات

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

والإسفار الفحص بسيطة لالكمي من الكلاب خارج الخلية العدلات فخ الإصدار

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

الكشف عن نسخة منخفضة العدد الحمض النووي الفيروسي المتكاملة التي شكلتها في المختبر عدوى التهاب الكبد باء

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...