Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Vi anerkender Monash Micro Imaging for brug af Nikon C1 opretstående konfokal laser scanning mikroskop og Monash Histology Platform til behandling af nyrevæv.

Denne metode gør det muligt påvisning af pan ecDNA fra alle former for celledød. Den samme metode og antistoffer anvendes til humannyrebiopsivæv (fra trin 4). Alle dyre-og mennesker havde Etik godkendelse fra Monash University, og Monash Health, Clayton, Victoria, Australien.
1. Farvning for ecDNA med DAPI og β-Actin
<ol><li>Fremkald en 20 dages model af anti-myeloperoxidase glomerulonefritis (anti-MPO-GN) i 8-10 uger gamle C57/Bl6 mus, med kontrol9.<ol>
<li>Afli...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection.">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+the+significance+of+apoptosis.">Cell death: the significance of apoptosis.</a> International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).</li><li>Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+one+way+to+die:+apoptosis,+necrosis+and+reactive+oxygen+damage.">More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage.</a> Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).</li><li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+its+role+in+inflammation.">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

Der findes flere protokoller, der måler proinflammatoriske markører i serum og urin hos både patienter og musemodeller af glomerulonefritis. Denne beskrevne protokol giver mulighed for analyse af produkter af celledød (ecDNA, NETs og ecMPO) inden for glomerulus direkte. De mest afgørende skridt i denne protokol er væv forberedelse og billeddannelse. Det vigtigste begrænsende element ved at bruge en fluorescerende farvning metode til analyse er væv autofluorescens. Formalin fast paraffinvæv er underlagt autofluor...

Myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmatisk antistof associeret vaskulitis (MPO-AAV) er en autoimmun sygdom, der resulterer i nyresvigt fra patologisk glomerular skade med betydelig celledød og frigivelse af deoxyribonucleic syre (DNA)1,2. DNA kan aktivere immunsystemet ved at fungere som et faresignal. Under normale sunde forhold, den nukleare placering af DNA giver beskyttelse mod eksponering for immunsystemet. Selv-DNA, der frigives ekstracellulær under enten patogene processer eller autoimmunitet ses af immunsystemet som en potent proinflammatoriske skader forbundet molekylær selvprotein (DAMP)3. Ekstra cellulære DNA (ecDNA) frigives fra døende celler gennem flere forskellige mekanismer, der er omfattet af forskellige biokemiske veje, såsom apoptose, nekroptose neutrofile ekstracellulære fælde dannelse (NETs), nekrose eller pyroptose4,,5,,6,7,8.
Vi beskriver heri metoder til plet og måle ecDNA frigivet fra døende celler i dele af formalin fast paraffin indlejret (FFPE) nyrer fra eksperimentelle anti-MPO GN og nyre biopsier fra patienter med MPO-AAV9,10. Der findes flere metoder til påvisning af cirkulerende dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og DNA-komplekser fra både serum og urin og fra in vitro-analyser11,12. Disse metoder, selv om nøjagtige ved bestemmelse af mængden af ecDNA, ikke bestemme, hvor ecDNA frigives anatomisk. Der findes metoder, der beskriver specifik måling af ecDNA,13,14f.eks. Der er ingen metode, der beskriver måling ecDNA kulminerede fra alle former for celledød i FFPE nyrer, hvor de patologiske skader opstår. Dette er vigtigt for at afgøre, om eksperimentelle terapeutiske behandlinger rydder ecDNA fra steder af patologisk skade i det faktiske målorgan.
Erhvervelsen af flere billeder fra nyreprøver skaber en stor mængde data, der analyseres almindeligt af en enkelt bruger. Dette er arbejdskrævende, tidskrævende og kan være underlagt upålidelig reproducerbarhed af andre brugere, på grund af brugerenbias. Trainable Weka segmentering er en open source software plugin til ImageJ, der bruger banebrydende bioinformatik værktøjer til at klassificere pixels ved hjælp af machine learning algoritmer15,16. Denne metode er "trainable", hvorved den lærer af brugerens klassificering af segmenter af pixels og anvender den nye lært klassificering til andre billeder. Denne metode er baseret på fælles analyseværktøjer i ImageJ-programmet, der bruges til at "klassificere" hver pixel i et segment som tilhørende en bestemt "klasse". Når programmet lærer "klassificeringer", kan de bruges til at identificere andre lignende klassificerede segmenter inden for samme billede. Denne model gemmes og anvendes derefter på andre sæt billeder i det samme eksperiment.
Nuværende hindringer for bestemmelse ecDNA in situ i nyre sektioner er den endogene autofluorescens fra fiksering i formalin og arbejdskrævende analyse af billederne. Vi beskriver her, hvordan du slukker denne autofluorescens, registrerer ecDNA og bruger overvåget maskinlæring til måling af høj gennemløb af ecDNA. Vi har tidligere offentliggjort måling af NETs og ekstracellulære MPO (ecMPO) ved hjælp af en makro i ImageJ, vi nu demonstrere semi automatisering af disse metoder ved hjælp af overvåget machine learning1. Vi demonstrerer maskinlæringsværktøjets tilpasningsevne for at klassificere en alternativ plet til NET'er og ecMPO i det samme billede. Disse farvning metoder, der er beskrevet her for at opdage ecDNA, NETs og ecMPO kan oversættes til andre faste organer og sygdomme, hvor ecDNA, NETS og ecMPO spiller en rolle i at fastholde sygdomme som leddegigt og lupus17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

Glomerular celledød er et patologisk træk ved myeloperoxidase anti neutrofile cytoplasmatiske antistof associeret vaskulitis (MPO-AAV). Ekstracellulær deoxyribonucleic syre (ecDNA) frigives under forskellige former for celledød, herunder apoptose, nekrose, nekroptose, neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) og pyropose. Måling af denne celledød er tidskrævende med flere forskellige biomarkører, der kræves for at identificere de forskellige biokemiske former for celledød. Måling af ecDNA udføres generelt i serum og urin som et surrogat for nyreskader, ikke i det faktiske målorgan, hvor den patologiske skade opstår. Den nuværende vanskelighed ved at undersøge ecDNA i nyrerne er manglen på metoder til formalin fast paraffin indlejret væv (FFPE) både eksperimentelt og i arkiverede humane nyre biopsier. Denne protokol indeholder en oversigt over de trin, der kræves for at plette for ecDNA i FFPE væv (både human og murine), slukke autofluorescens og måle ecDNA i de resulterende billeder ved hjælp af en maskine læring værktøj fra den offentligt tilgængelige open source ImageJ plugin trainable Weka segmentering. Trainable Weka segmentering anvendes til ecDNA inden for glomeruli, hvor programmet lærer at klassificere ecDNA. Denne klassificering anvendes på efterfølgende erhvervede nyrebilleder, hvilket reducerer behovet for manuelle anmærkninger af hvert enkelt billede. Tilpasningsevnen af den trainable Weka segmentering er påvist yderligere i nyrevæv fra eksperimentelle murine anti-MPO glomerulonefritis (GN), at identificere NETs og ecMPO, fælles patologiske bidragydere til anti-MPO GN. Denne metode giver objektiv analyse af ecDNA i nyrevæv, der klart viser effekten, hvor den trainable Weka segmentering program kan skelne ecDNA mellem sunde normale nyrevæv og syge nyrevæv. Denne protokol kan nemt tilpasses til at identificere ecDNA, NETs og ecMPO i andre organer.

Disse billeder repræsenterer de mange trin, der kræves for at kunne bruge trainable Weka segmentering for at minimere arbejdskrævende manuel måling af ecDNA i fluorescerende farvede FFPE nyrevæv fra en mus med induceret anti-MPO GN. Disse trin er opsummeret i figur 1 og figur 2 med billeder taget direkte fra Weka segmentering program, der skitserer hvert trin i analyseprocessen. Målinger fra denne analyse vises derefter i <...

Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Ekstracellulært DNA (ecDNA), der frigives under celledød, er proinflammatorisk og bidrager til inflammation. Måling af ecDNA på skadesstedet kan bestemme effekten af terapeutisk behandling i målorganet. Denne protokol beskriver brugen af et maskinlæringsværktøj til at automatisere måling af ecDNA i nyrevæv.

Overvåget maskinlæring til semi-kvantificering af ekstracellulær DNA i glomerulonefritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Glomerulonefritis forårsager patologisk glomerular skade med betydelig celledød og ekstracellulær DNA-frigivelse. Denne protokol gør det muligt at visualisere ekstracellulær DNA på frigivelsesstedet under patologisk skade. Fordelen ved denne teknik er, at det måler ekstracellulære DNA fra celledød i nyrerne.I modsætning til serum eller urin er ekstracellulær DNA-måling en surrogatmarkør for patologiske skader. Betydningen af denne metode er, at både den ekstracellulære DNA farvning og billedanalyse er let overføres til andre autoimmune sygdomme som leddegigt og lupus. Denne metode kræver en grundlæggende viden om nyre histologi.For at muliggøre nøjagtig påvisning af glomerulært ekstracellulært DNA skal forskeren kunne identificere glomeruli korrekt. For ekstracellulær DNA farvning, først varme prøver af interesse i et dias rack i 60 grader Celsius i 60 minutter, før nedsænkning af dias i to 40-minutters ændringer af opløsningsmiddel i en røghætte. Efter den anden nedsænkning rehydreres prøverne to gange i 100% ethanol og én gang i 70% ethanol i fem minutter pr. behandling.Efter den sidste behandling, bruge tang til at placere dias i kogende antigen hentning løsning i en trykkoger på høj i 10 minutter. Efter at have afpresset antigen epitoperne, skal trykkogeren overføres fra varme til en vask og straks løbe koldt vand fra hanen over låget. Lad objektglassene komme i ligevægt i 20 minutter i antigenopsamlingsopløsningen, før prøverne vaskes to gange i 0,01 molar PBS på en orbitalshaker i fem minutter pr. vask.Efter den anden vask, bruge en hydrofobe pen til at tegne cirkler omkring nyrevæv prøver og blokere enhver uspecifik farvning med 60 mikroliter af 10% kylling serum i 5% kvæg serum albumin i 30 minutter ved stuetemperatur. Ved slutningen af inkubationen erstattes blokeringsopløsningen omhyggeligt med 60 mikroliter af det primære antistof af interesse i et fugtighedskammer natten over ved fire grader Celsius. Den næste morgen, vaske dias på en orbital shaker i PBS i to minutter per vask, før du tilføjer 60 mikroliter af en passende fluorophore konjugeret sekundært antistof til hvert dias for en 40-minutters inkubation ved stuetemperatur.Ved inkubationens afslutning vaskes objektglassene i PBS som påvist, efterfulgt af behandling i 0,3% Sudan sort i 70% ethanol for at slukke enhver potentiel formalin-induceret autofluorescens. Efter 30 minutter vaskes rutsjebanerne i vand fra hanen for at fjerne bundfaldet og nedsænkes i rutsjebanerne i PBS i 10 minutter for at forhindre yderligere sudanesisk sort bundfaldsformation. I slutningen af inkubationen monteres objektglassene på konfokale glasdæksler med tre 60 mikroliterdråber monteringsopløsning suppleret med DAPI og forsegle dækslerne med neglelak.Lad objektglassene hærde i 24 timer ved stuetemperatur. Opbevar dem ved fire grader Celsius beskyttet mod lys, indtil billeddannelse ved konfokal laserscanning mikroskopi i henhold til standardprotokoller. Sørg for at forsegle dækslerne med neglelak for at forhindre bevægelse under billeddannelse og for at rengøre dækslerne på ethanol for at forbedre billedopløsningen.Efter billedbehandling 20 glomeruli per dias, skal du åbne trainable Weka Segmentering plugin i ImageJ og slippe det første billede på ImageJ værktøjslinjen. Klik på billed-, farve- og opdelte kanaler. Der vises et billede, der viser den primære antistoffarvning.Hvis du vil oprette en flettet fil med de enkelte billeder, skal du klikke på farve og flette kanaler. Der vises en pop op-boks, hvor du bliver bedt om at tildele hver kanal en farve. Kontroller opret sammensatte og holde kilde billeder kasser og klik på OK. Der vises et flettet sammensat billede.Brug den primære antistof farvning som en guide, tegne en region af interesse omkring glomerular tot. Hvis du vil udføre en Gaussisk sløring på det ene blå DAPI-billede, skal du klikke på proces, filtre og gaussisk sløring. Indstil sløringen til en til to.Billedet bliver lidt sløret, men kernerne vises glat, vil baggrunden blive blødgjort. Klik derefter på plugins, segmentering og trainable Weka Segmentation, og brug værktøjet til fri hånd til at spore de intakte kerner. Når alle de kerner af interesse er blevet tilføjet, tilføje klasse en boks, skal du bruge linjeværktøjet til at afgrænse de områder af baggrunden til klasse to boks.Klik på opret ny klasse, og brug linjeværktøjet til at skitsere det DAPI-farvede ekstranukleare DNA. Klik på togseer, og få sandsynlighed. Slå musen til for at få et sort-hvidt billede af alle komponenterne med markeringsobjektet fremhævet med hvid.Hvis du vil dublere dette billede, skal du klikke på billede og dublere. Juster og betærser under billede. Brug museknappen til at justere tærsklen, indtil kun det ekstracellulære DNA overholdes.Efter tærskelring skal du klikke på proces, binær og oprette binære filer, og kopiere det tidligere genererede glomerular region af interesse. Tryk på Skift E for at markere rediger, markeringer og gendannelse for at gendanne markeringen. Hvis du kun vil måle de ekstracellulære DNA-partikler i glomerulus, skal du klikke analysere partikler og OK. Der genereres et resultatark, der viser antallet af partikler, område, gennemsnitlige pixel og procentdelen af glomeruli, der indeholder ekstracellulært DNA.Hvis du vil gemme klassificeringen som en ekstracellulær DNA-klassificering, skal du klikke på Gem klassificering og gemme dataene. Hvis du vil genanvende modellen på efterfølgende billeder, skal du gentage den første billedbehandling som vist, før du vælger indlæsningsklassesator og den gemte klassificeringsfil. Logmenuen vises og kører modellen.Når modellen er kørt, skal du klikke på indlæs data og vælge den ekstracellulæreDNA.arff. Klik derefter på opret resultat. Hvis det resulterende billede ikke har kunnet opfange alle de kerner, baggrund eller ekstracellulære DNA, skal du klikke på omskolingsklasses og tilføje flere klassificeringer efter behov.Her vises billeder med en enkelt kanal, der viser repræsentative DNA- og beta-akter i farvning. Sammenlægning af de to billeder gør det muligt at tegne en region af interesse omkring glomerular området til måling af det ekstracellulære DNA i musenyren glomeruli ved hjælp af trainable Weka Segmentering som påvist. Denne model kan anvendes til at identificere ekstracellulær DNA i nyrebiopsi prøver fra en kontrol patient eller sammenligning med en nyre biopsi fra en patient med myeloperoxidase ANCA-associeret vaskulitis.Desuden kan dette program oversættes til andre pletter i nyrevævsprøver, for eksempel, at pletten for neutrofil ekstracellulære fælder og deposition af ekstracellulær myeloperoxidase i ANCA-associeret vaskulitis. Det er vigtigt, at der ikke observeres væsentlige forskelle, når de samme data analyseres af flere brugere. Det mest kritiske trin i analysen er at give nok eksempler på baggrund, kerner, og ekstracellulære DNA med glomeruli som klassificeringer for Weka Segmentering program til at lære af.Denne metode kan nemt overføres. For eksempel kan yderligere analyse af de forskellige typer celledød undersøges ved farvning for specifikke antistoffer mod markører for apoptose eller nekrose. Vores teknik kan bruges sammen med andre inflammatoriske processer såsom vurdering af TLR-ekspression i autoimmun nyresygdom eller ekstracellulær myeloperoxidaseekspression i humane nyrebiopsier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Måling af ekstracellulær DNA udledning og kvantitativ NET Formation i humane neutrofiler<em&gt; In vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Ratiometrisk Imaging af ekstracellulære pH i Dental biofilm

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder til at studere Lipidforandringer i neutrofiler og den efterfølgende dannelse af neutrofile ekstracellulær fælder

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

A Simple Fluorescens Assay for Kvantificering af Canine Neutrofil Ekstracellulær Trap Frigivelse

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Påvisning af lav kopi nummer integreret Viral DNA dannet af In Vitro Hepatitis B infektion

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...