Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Wij erkennen Monash Micro Imaging voor het gebruik van Nikon C1 rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop en het Monash Histology Platform voor de verwerking van nierweefsel.

Deze methode maakt detectie van pan ecDNA van alle vormen van celdood mogelijk. Dezelfde methode en antilichamen worden gebruikt voor menselijke nierbiopsieweefsel (vanaf stap 4). Alle dierlijke en menselijke onderwerpen hadden de goedkeuring van de Ethiek van De Universiteit van Monash, en De Gezondheid van Monash, Clayton, Victoria, Australië.
1. Kleuring voor ecDNA met DAPI en β-Actin
<ol><li>Induceer een 20-daags model van anti-myeloperoxidase glomerulonephritis (anti-MPO-GN) in 8-10 w...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection.">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+the+significance+of+apoptosis.">Cell death: the significance of apoptosis.</a> International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).</li><li>Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+one+way+to+die:+apoptosis,+necrosis+and+reactive+oxygen+damage.">More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage.</a> Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).</li><li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+its+role+in+inflammation.">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

Er bestaan meerdere protocollen die pro-inflammatoriummarkeringen meten in het serum en de urine van zowel patiënten als muismodellen van glomerulonephritis. Dit beschreven protocol maakt analyse van de producten van celdood (ecDNA, NETs en ecMPO) direct binnen de glomerulus mogelijk. De meest cruciale stappen in dit protocol is de weefselvoorbereiding en beeldvorming. Het belangrijkste beperkende element van het gebruik van een fluorescerende kleuring methode voor analyse is het weefsel autofluorescentie. Formaline vas...

Myeloperoxidase anti neutrofiele cytoplasmatische antilichaam geassocieerd vasculitis (MPO-AAV) is een auto-immuunziekte die resulteert in nierfalen van pathologische glomerulaire letsel met aanzienlijke celdood en het vrijkomen van deoxyribonucleic zuur (DNA)1,2. DNA kan het immuunsysteem activeren door op te treden als een gevaarssignaal. Onder normale gezonde omstandigheden biedt de nucleaire locatie van DNA bescherming tegen blootstelling aan het immuunsysteem. Zelf-DNA dat extracellulair vrijkomt tijdens pathogene processen of auto-immuniteit wordt door het immuunsysteem gezien als een krachtige proinflammatoire schade geassocieerd moleculaire zelf-eiwit (DAMP)3. Extra cellulair DNA (ecDNA) wordt vrijgegeven uit stervende cellen door middel van verschillende mechanismen die worden beheerst door verschillende biochemische trajecten, zoals apoptose, necroptosis neutrofiele extracellulaire valvorming (NETs), necrose of pyroptose4,5,6,7,8.
We beschrijven hierin methoden om ecDNA vrij te geven uit stervende cellen in secties van formaline vaste paraffine embedded (FFPE) nieren van experimentele anti-MPO GN en nierbiopten van patiënten met MPO-AAV9,10. Er bestaan meerdere methoden voor de detectie van circulerend dubbelstrengs DNA (dsDNA) en DNA-complexen uit zowel serum als urine en van in vitro tests11,12. Deze methoden, hoewel nauwkeurig bij het bepalen van de hoeveelheid ecDNA, bepalen niet waar de ecDNA anatomisch wordt vrijgegeven. Er zijn methoden die specifieke meting van ecDNA beschrijven, zoals tunel voor apoptose en meting van celpuin13,14. Er is geen methode die beschrijft het meten ecDNA culmineerde uit alle vormen van celdood in FFPE nieren waar de pathologische schade optreedt. Dit is belangrijk om te bepalen of experimentele therapeutische behandelingen de ecDNA wissen van de sites van pathologische schade in het eigenlijke doelorgaan.
De verwerving van meerdere afbeeldingen van niermonsters creëert een hoog volume aan gegevens die vaak door één enkele gebruiker worden geanalyseerd. Dit is arbeidsintensief, tijdrovend en kan worden onderworpen aan onbetrouwbare reproduceerbaarheid door andere gebruikers, als gevolg van vooringenomenheid van de gebruiker. Trainable Weka-segmentatie is een open-source softwareplug-in voor imagej die geavanceerde bioinformatische tools gebruikt om pixels te classificeren met behulp van machine learning-algoritmen15,16. Deze methode is "trainable" waarbij het leert van de classificatie van segmenten pixels van de gebruiker en de nieuwe geleerde classificatie toepast op andere afbeeldingen. Deze methode is gebaseerd op algemene analysetools binnen het ImageJ-programma die worden gebruikt om elke pixel in een segment te "classificeren" als behorend tot een specifieke "klasse". Zodra het programma leert de "classificaties", kunnen ze worden gebruikt om andere soortgelijke geclassificeerde segmenten te identificeren binnen dezelfde afbeelding. Dit model wordt vervolgens opgeslagen en toegepast op andere sets afbeeldingen binnen hetzelfde experiment.
Huidige obstakels voor het bepalen van ecDNA in situ in niersecties is de endogene autofluorescentie van fixatie in formaline en de arbeidsintensieve analyse van de beelden. We beschrijven hier hoe je deze autofluorescentie doven, ecDNA detecteren en gecontroleerde machine learning gebruiken voor een hoge doorvoermeting van ecDNA. We hebben eerder de meting van NETs en extracellulaire MPO (ecMPO) gepubliceerd met behulp van een macro in ImageJ, we demonstreren nu semi-automatisering van deze methoden met behulp van supervised machine learning1. We tonen het aanpassingsvermogen van de machine learning tool, om een alternatieve vlek voor NETs en ecMPO te classificeren binnen hetzelfde beeld. Deze kleuringsmethoden die hier worden beschreven voor het opsporen van ecDNA, NETs en ecMPO kunnen worden vertaald naar andere vaste organen en ziekten waar ecDNA, NETS en ecMPO een rol spelen bij het bestendigen van ziekten zoals reumatoïde artritis en lupus17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

Glomerulaire celdood is een pathologisch kenmerk van myeloperoxidase anti neutrofiele cytoplasmatische antilichaam geassocieerd vasculitis (MPO-AAV). Extracellulair deoxyribonucleïnezuur (ecDNA) komt vrij tijdens verschillende vormen van celdood, waaronder apoptose, necrose, necroptose, neutrofiele extracellulaire vallen (NETs' s) en pyroptose. Meting van deze celdood is tijdrovend met verschillende biomarkers die nodig zijn om de verschillende biochemische vormen van celdood te identificeren. Meting van ecDNA wordt over het algemeen uitgevoerd in serum en urine als surrogaat voor nierschade, niet in het eigenlijke doelorgaan waar de pathologische schade optreedt. De huidige moeilijkheid bij het onderzoeken van ecDNA in de nier is het gebrek aan methoden voor formaline vast paraffine embedded weefsel (FFPE) zowel experimenteel als in gearchiveerde menselijke nierbiopten. Dit protocol biedt een samenvatting van de stappen die nodig zijn om te vlekken voor ecDNA in FFPE weefsel (zowel menselijke als murine), blus autofluorescentie en meet de ecDNA in de resulterende beelden met behulp van een machine learning tool van de openbaar beschikbare open source ImageJ plugin trainable Weka segmentatie. Trainable Weka segmentatie wordt toegepast op ecDNA binnen de glomeruli waar het programma leert om ecDNA te classificeren. Deze classificatie wordt toegepast op latere verworven nierbeelden, waardoor de noodzaak van handmatige annotaties van elke afzonderlijke afbeelding wordt verminderd. Het aanpassingsvermogen van de trainbare Weka-segmentatie wordt verder aangetoond in nierweefsel van experimentele murineanti-MPO glomerulonephritis (GN), om NET's en ecMPO, gemeenschappelijke pathologische bijdragen aan anti-MPO GN te identificeren. Deze methode biedt objectieve analyse van ecDNA in nierweefsel dat duidelijk de werkzaamheid aantoont waarin het trainbare Weka-segmentatieprogramma ecDNA kan onderscheiden tussen gezond normaal nierweefsel en ziek nierweefsel. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om ecDNA, NETs en ecMPO in andere organen te identificeren.

Deze beelden vertegenwoordigen de meerdere stappen die nodig zijn om met succes gebruik te maken van trainbare Weka segmentatie om de arbeidsintensieve handmatige meting van ecDNA in fluorescerend gekleurd FFPE nierweefsel van een muis met geïnduceerde anti-MPO GN te minimaliseren. Deze stappen worden samengevat in figuur 1 en figuur 2 met beelden die rechtstreeks uit het Weka-segmentatieprogramma zijn genomen, waarin elke stap ...

Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Extracellulair DNA (ecDNA) dat vrijkomt bij de celdood is pro-inflammatorium en draagt bij aan ontsteking. Meting van ecDNA op de plaats van letsel kan de werkzaamheid van therapeutische behandeling in het doelorgaan bepalen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een machine learning tool om de meting van ecDNA in nierweefsel te automatiseren.

Begeleide machine learning voor semi-kwantificering van extracellulair DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Glomerulonephritis veroorzaakt pathologische glomerulaire verwondingen met aanzienlijke celdood en extracellulaire DNA-afgifte. Dit protocol maakt de visualisatie van extracellulair DNA op de plaats van afgifte tijdens pathologisch letsel mogelijk. Het voordeel van deze techniek is dat het extracellulair DNA van celdood in de nier meet.In tegenstelling tot serum of urine is extracellulaire DNA-meting een surrogaatmarker voor pathologische schade. Het belang van deze methode is dat zowel de extracellulaire DNA-kleuring en beeldanalyse gemakkelijk overdraagbaar zijn naar andere auto-immuunziekten zoals reumatoïde artritis en lupus. Deze methode vereist een basiskennis van nier histologie.Om de nauwkeurige detectie van glomerular extracellulair DNA mogelijk te maken, moet de onderzoeker glomeruli correct kunnen identificeren. Voor extracellulaire DNA-kleuring verwarmt u eerst de monsters van belang in een schuifrek in 60 graden Celsius gedurende 60 minuten voordat u de dia's onderdompelt in twee 40 minuten durende veranderingen van oplosmiddel in een rookkap. Na de tweede onderdompeling rehydrateert u de monsters twee keer in 100% ethanol en één keer in 70% ethanol gedurende vijf minuten per behandeling.Gebruik na de laatste behandeling tangen om de glijbanen gedurende 10 minuten in kokende antigeenophaaloplossing in een snelkookpan op hoog te plaatsen. Na het ontmaskeren van de antigeen epitopes, breng de snelkookpan van warmte in een gootsteen en onmiddellijk lopen koud leidingwater over het deksel. Laat de glijbanen gedurende 20 minuten in de antigeenophaaloplossing in evenwicht brengen voordat u de monsters twee keer in 0,01 molaire PBS op een orbitale shaker gedurende vijf minuten per wasbeurt wast.Gebruik na de tweede wasbeurt een hydrofobe pen om cirkels rond de nierweefselmonsters te tekenen en alle niet-specifieke vlekken te blokkeren met 60 microliters van 10% kippenserum in 5%runderserum albumine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervang aan het einde van de incubatie de blokkeringsoplossing zorgvuldig door 60 microliters van het primaire antilichaam van belang in een vochtigheidskamer 's nachts bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, was de dia's op een orbitale shaker in PBS gedurende twee minuten per wasbeurt alvorens 60 microliters van een geschikte fluorofofoër geconjugeerd secundair antilichaam aan elke dia voor een 40-minuten incubatie bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, was de dia's in PBS zoals aangetoond, gevolgd door behandeling in 0,3% Soedan zwart in 70% ethanol om eventuele formeel geïnduceerde autofluorescentie te doven. Na 30 minuten was je de glijbanen in leidingwater om eventuele neerslag te verwijderen en dompel je de glijbanen 10 minuten onder in PBS om verdere Soedanzwarte neerslagvorming te voorkomen. Aan het einde van de incubatie, monteer de dia's op confocale glazen coverslips met drie 60 microliter druppels montageoplossing aangevuld met DAPI en verzegel de coverslips met nagellak.Laat de glijbanen 24 uur op kamertemperatuur genezen. Bewaar ze op vier graden Celsius beschermd tegen licht tot beeldvorming door confocale laser scanning microscopie volgens de standaard protocollen. Zorg ervoor dat u de coverslips verzegelt met nagellak om elke beweging tijdens de beeldvorming te voorkomen en om de covers van ethanol schoon te maken om de beeldresolutie te verbeteren.Nadat u 20 glomeruli per dia hebt weergegeven, opent u de trainbare Weka-segmentatie-plug-in in ImageJ en zet u de eerste afbeelding op de werkbalk ImageJ. Klik op afbeeldings-, kleur- en gesplitste kanalen. Er verschijnt een afbeelding met de primaire antilichaamkleuring.Als u een samengevoegd bestand van de afzonderlijke afbeeldingen wilt maken, klikt u op kleur en voegt u kanalen samen. Er verschijnt een pop-upvak waarin wordt gevraagd om een kleur aan elk kanaal toe te wijzen. Schakel de vakjes Samengestelde maken en bronafbeeldingen bijhouden en klik op OK. Er verschijnt een samengevoegde samengestelde afbeelding.Met behulp van de primaire antilichaam kleuring als een gids, trekken een gebied van belang rond de glomerular bos. Als u een Gaussische onscherpte wilt uitvoeren op de enkele blauwe DAPI-afbeelding, klikt u op proces, filters en Gaussische onscherpte. Stel de onscherpte in op één op twee.Het beeld zal een beetje wazig, maar de kernen zal verschijnen glad, zal de achtergrond worden verzacht. Klik vervolgens op plug-ins, segmentatie en trainbare Weka-segmentatie en gebruik het gereedschap Vrije hand om de intacte kernen te traceren. Wanneer alle kernen van belang zijn toegevoegd, gebruikt het vak Klasse één toevoegen het lijngereedschap om de achtergrondgebieden af te bakenen aan het vak klasse twee.Klik op nieuwe klasse maken en gebruik het lijngereedschap om het met DAPI bevlekte extranucleaire DNA te schetsen. Klik op trein classifier en krijg kans. Schakel de muis in om een zwart-witafbeelding van alle componenten te verkrijgen met het object selectie dat in het wit is gemarkeerd.Als u deze afbeelding wilt dupliceren, klikt u op afbeelding en dupliceert u. Onder afbeelding, aanpassen en drempel. Gebruik de muisknop om de drempel aan te passen totdat alleen het extracellulaire DNA wordt waargenomen.Klik na drempels op proces, binair en maak binair en kopieer het eerder gegenereerde glomerulaire interessegebied. Druk op Shift E voor control om bewerken, selecties en herstel te selecteren om de selectie te herstellen. Als u alleen de extracellulaire DNA-deeltjes in de glomerulus wilt meten, klikt u op analyseren van deeltjes en OK. Er wordt een resultaatblad gegenereerd met het aantal deeltjes, het gebied, de gemiddelde pixels en het percentage glomeruli dat extracellulair DNA bevat.Als u de classificatie wilt opslaan als een extracellulaire DNA-classificatie, klikt u op classificatie opslaan en slaat u de gegevens op. Als u het model opnieuw wilt aanpassen op volgende afbeeldingen, herhaalt u de eerste beeldverwerking zoals aangetoond voordat u de laadclassificatie en het opgeslagen classificatiebestand selecteert. Het logboekmenu verschijnt en voert het model uit.Zodra het model is uitgevoerd, klikt u op gegevens laden en selecteert u de extracellularDNA.arff. Klik vervolgens op resultaat maken. Als de resulterende afbeelding niet alle kernen, achtergrond of extracellulair DNA heeft opgepikt, klikt u op classificatie omscholen en voegt u indien nodig meer classificaties toe.Hier worden single channel beelden getoond die representatief DNA en bèta-actin-kleuring laten zien. Door de twee beelden samen te voegen kan een bezienswaardigheid rond het glomerulaire gebied worden getrokken voor het meten van het extracellulaire DNA in de muisnierglomeruli met behulp van trainbare Weka-segmentatie, zoals aangetoond. Dit model kan worden aangenomen om extracellulair DNA te identificeren in nierbiopsiemonsters van een controlepatiënt of vergelijking met die van een nierbiopsie van een patiënt met myeloperoxidase ANCA-geassocieerde vasculitis.Bovendien kan dit programma worden vertaald naar andere vlekken in nierweefselmonsters, bijvoorbeeld naar vlek voor neutrofiele extracellulaire vallen en de afzetting van extracellulaire myeloperoxidase in ANCA-geassocieerde vasculitis. Belangrijk is dat er geen significante verschillen worden waargenomen wanneer dezelfde gegevens door meerdere gebruikers worden geanalyseerd. De meest kritische stap van de analyse is het verstrekken van voldoende voorbeelden van achtergrond, kernen, en extracellulaire DNA met glomeruli als classifiers voor de Weka Segmentatie programma om van te leren.Deze methode is gemakkelijk overdraagbaar. Zo kan verdere analyse van de verschillende soorten celdood worden onderzocht door kleuring voor specifieke antilichamen tegen markers voor apoptose of necrose. Onze techniek kan worden gebruikt met andere ontstekingsprocessen, zoals het beoordelen van TLR expressie in auto-immuun nierziekte of extracellulaire myeloperoxidase expressie in menselijke nierbiopten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Ratiometrische Imaging van extracellulaire pH in Dental biofilms

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

A Simple Fluorescence Assay voor het kwantificeren van Canine neutrofielen extracellulaire inklembeveiliging

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detectie van lage exemplaar nummer geïntegreerde viraal DNA gevormd door In Vitro Hepatitis B-infectie

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...