Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Nous reconnaissons Monash Micro Imaging pour l’utilisation du microscope à balayage laser confocal vertical Nikon C1 et de la plate-forme d’histologie Monash pour le traitement des tissus rénaux.

Cette méthode permet la détection de pan ecDNA à partir de toutes les formes de mort cellulaire. La même méthode et les mêmes anticorps sont utilisés pour les tissus de biopsie rénale humaine (à partir de l’étape 4). Tous les sujets animaux et humains ont reçu l’approbation de l’Éthique de l’Université Monash et de Monash Health, Clayton, Victoria, Australie.
1. Coloration pour ecDNA avec DAPI et β-Actin
<ol><li>Induire un modèle de 20 jours de glomerulonephrite anti-m...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. 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L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

Il existe de multiples protocoles qui mesurent les marqueurs proinflammatoires dans le sérum et l’urine des patients et des modèles de souris de glomerulonephrite. Ce protocole décrit permet l’analyse des produits de la mort cellulaire (ecDNA, NETs et ecMPO) dans le glomerulus directement. Les étapes les plus cruciales de ce protocole sont la préparation et l’imagerie des tissus. Le principal élément limitant de l’utilisation d’une méthode de coloration fluorescente pour l’analyse est l’autofluoresc...

L’anticorps cytoplasmique anti neutrophile de myéloperoxydase associé à la vasculite (MPO-AAV) est une maladie auto-immune qui entraîne une insuffisance rénale causée par une lésion glomerulaire pathologique avec une mort cellulaire considérable et la libération d’acide désoxyribonucléique (ADN)1,2. L’ADN peut activer le système immunitaire en agissant comme un signal de danger. Dans des conditions normales et saines, l’emplacement nucléaire de l’ADN offre une protection contre l’exposition au système immunitaire. L’auto-ADN qui est libéré extracellulairement pendant les processus pathogènes ou l’autoimmunité est considéré par le système immunitaire comme un puissant dommage proinflammatoire associé à l’auto-protéine moléculaire (DAMP)3. L’ADN cellulaire supplémentaire (ECDNA) est libéré des cellules mourantes par plusieurs mécanismes distincts qui sont régis par des voies biochimiques distinctes, telles que l’apoptose, la nécroptose neutrophile formation de piège extracellulaire (NET), la nécrose ou la pyroptose4,5,6,7,8.
Nous décrivons ici des méthodes pour tacher et mesurer l’ecDNA libéré des cellules mourantes dans des sections de formaline fixe paraffine incorporée (FFPE) des biopsies expérimentales anti-MPO GN et rénales de patients atteints de MPO-AAV9,10. Il existe de multiples méthodes pour la détection de l’ADN double brin circulant (ADN) et des complexes d’ADN à la fois du sérum et de l’urine et des essais in vitro11,12. Ces méthodes, bien qu’exactes pour déterminer la quantité d’ECDNA, ne déterminent pas où l’ECDNA est libéré anatomiquement. Il existe des méthodes qui décrivent la mesure spécifique de l’ECDNA comme le tunel pour l’apoptose et la mesure des débris cellulaires13,14. Il n’y a aucune méthode qui décrit la mesure ecDNA a culminé de toutes les formes de mort cellulaire dans les reins de FFPE où les dommages pathologiques se produisent. Ceci est important pour déterminer si les traitements thérapeutiques expérimentaux effacent l’ECDNA des sites de lésion pathologique dans l’organe cible réel.
L’acquisition de plusieurs images à partir d’échantillons de rein crée un volume élevé de données qui est analysée couramment par un seul utilisateur. Il s’agit d’un travail intensif, long et peut être soumis à une reproductibilité peu fiable par d’autres utilisateurs, en raison de biais utilisateur. La segmentation Weka formable est un plugin logiciel open-source pour ImageJ qui utilise des outils bioinformatiques de pointe pour classer les pixels à l’aide d’algorithmes d’apprentissage automatique15,16. Cette méthode est « er entraîn » par laquelle elle apprend de la classification par l’utilisateur des segments de pixels et applique la nouvelle classification apprise à d’autres images. Cette méthode s’appuie sur des outils d’analyse communs dans le programme ImageJ qui sont utilisés pour « classer » chaque pixel dans un segment comme appartenant à une « classe » spécifique. Une fois que le programme apprend les « classificateurs », ils peuvent être utilisés pour identifier d’autres segments classifiés similaires au sein d’une même image. Ce modèle est ensuite enregistré et appliqué à d’autres ensembles d’images dans la même expérience.
Les obstacles actuels à la détermination de l’ecDNA in situ dans les sections rénales sont l’autofluorescence endogène de la fixation dans la formaline et l’analyse à forte intensité de main-d’œuvre des images. Nous décrivons ici comment éteindre cette autofluorescence, détecter l’ECDNA, et utiliser l’apprentissage automatique supervisé pour la mesure à haut débit de l’ECDNA. Nous avons déjà publié la mesure des NET et du MPO extracellulaire (ecmPO) à l’aide d’une macro dans ImageJ, nous démontrons maintenant la semi-automatisation de ces méthodes en utilisant l’apprentissage automatique supervisé1. Nous démontrons l’adaptabilité de l’outil d’apprentissage automatique, pour classer une tache alternative pour les NETs et l’eCMPO dans la même image. Ces méthodes de coloration décrites ici pour détecter l’ECDNA, les NET et l’ecMPO peuvent être traduites vers d’autres organes et maladies solides où l’ECDNA, les NETS et l’ecMPO jouent un rôle dans la perpétuation de maladies telles que la polyarthrite rhumatoïde et le lupus17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

La mort cellulaire glomerulaire est une caractéristique pathologique de l’anticorps cytoplasmique associé à l’anticorps cytoplasmique anti neutrophile de myeloperoxidase (MPO-AAV). L’acide désoxyribonucléique extracellulaire (ECDNA) est libéré pendant différentes formes de mort cellulaire, y compris l’apoptose, la nécrose, la nécroptose, les pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et la pyroptose. La mesure de cette mort cellulaire prend beaucoup de temps avec plusieurs biomarqueurs différents nécessaires pour identifier les différentes formes biochimiques de la mort cellulaire. La mesure de l’ECDNA est généralement effectuée dans le sérum et l’urine en tant que substitut pour les dommages rénaux, pas dans l’organe cible réel où la blessure pathologique se produit. La difficulté actuelle dans l’étude ecDNA dans le rein est le manque de méthodes pour la formaline tissu incorporé de paraffine fixe (FFPE) à la fois expérimentalement et dans les biopsies de rein humain archivées. Ce protocole fournit un résumé des étapes nécessaires pour tacher pour ecDNA dans le tissu FFPE (humain et murin), étancher l’autofluorescence et mesurer l’ECDNA dans les images résultantes à l’aide d’un outil d’apprentissage automatique de la segmentation disponible au public open source de Wbeka. La segmentation weka formable est appliquée à l’ECDNA dans le glomeruli où le programme apprend à classer l’ECDNA. Ce classificateur est appliqué aux images rénales acquises ultérieures, réduisant ainsi le besoin d’annotations manuelles de chaque image individuelle. L’adaptabilité de la segmentation weka formable est démontrée plus loin dans le tissu rénal de la glomerulonephrite expérimentale de murine (GN), pour identifier les NET et l’ecMPO, les contributeurs pathologiques communs au GN anti-MPO. Cette méthode fournit une analyse objective de l’ECDNA dans les tissus rénaux qui démontre clairement l’efficacité dans laquelle le programme de segmentation Weka moyenisable peut distinguer l’ECDNA entre les tissus rénaux normaux sains et les tissus rénaux malades. Ce protocole peut facilement être adapté pour identifier l’ECDNA, les NET et l’ecMPO dans d’autres organes.

Ces images représentent les multiples étapes nécessaires pour utiliser avec succès la segmentation weka formable pour minimiser la mesure manuelle à forte intensité de main-d’œuvre de l’ecDNA dans le tissu rénal ffpe fluorescent d’une souris avec anti-MPO GN induit. Ces étapes sont résumées à la figure 1 et à la figure 2 avec des images prises directement du programme de segmentation Weka, décrivant chaque ét...

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Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

L’ADN extracellulaire (ECDNA) libéré pendant la mort cellulaire est proinflammatoire et contribue à l’inflammation. La mesure de l’ECDNA sur le site de la blessure peut déterminer l’efficacité du traitement thérapeutique dans l’organe cible. Ce protocole décrit l’utilisation d’un outil d’apprentissage automatique pour automatiser la mesure de l’ECDNA dans les tissus rénaux.

Apprentissage automatique supervisé pour la semi-quantification de l’ADN extracellulaire dans la glomerulonephrite

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

La glomerulonephritis cause des dommages glomerular pathologiques avec la mort cellulaire considérable et la libération extracellulaire d’ADN. Ce protocole permet la visualisation de l’ADN extracellulaire sur le site de libération pendant les lésions pathologiques. L’avantage de cette technique est qu’elle mesure l’ADN extracellulaire de la mort cellulaire dans le rein.Contrairement au sérum ou à l’urine, la mesure extracellulaire de l’ADN est un marqueur de substitution pour les dommages pathologiques. L’importance de cette méthode est que la coloration extracellulaire d’ADN et l’analyse d’image sont facilement transférables à d’autres maladies autoimmunes telles que la polyarthrite rhumatoïde et le lupus. Cette méthode nécessite une connaissance de base de l’histologie rénale.Pour permettre la détection précise de l’ADN extracellulaire glomerular, le chercheur doit être en mesure d’identifier correctement glomeruli. Pour la coloration extracellulaire de l’ADN, chauffez d’abord les échantillons d’intérêt dans un support de glissière à 60 degrés Celsius pendant 60 minutes avant d’immerger les glissières dans deux changements de solvant de 40 minutes dans un capot de fumée. Après la deuxième immersion, réhydrater les échantillons deux fois dans 100% d’éthanol et une fois dans 70% d’éthanol pendant cinq minutes par traitement.Après le dernier traitement, utiliser des pinces pour placer les toboggans dans la solution d’extraction d’antigène bouillant dans un autocuiseur à feu doux pendant 10 minutes. Après avoir démasqué les épitopes d’antigène, transférer l’autocuiseur de la chaleur dans un évier et faire couler immédiatement l’eau froide du robinet sur le couvercle. Laissez les glissières s’équilibrer pendant 20 minutes dans la solution de récupération de l’antigène avant de laver les échantillons deux fois en 0,01 PBS molaire sur un shaker orbital pendant cinq minutes par lavage.Après le deuxième lavage, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour des échantillons de tissu rénal et bloquer toute coloration non spécifique avec 60 microlitres de sérum de poulet à 10% dans 5% d’albumine de sérum bovin pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, remplacer soigneusement la solution de blocage par 60 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt dans une chambre d’humidité pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, lavez les glissières d’un shaker orbital en PBS pendant deux minutes par lavage avant d’ajouter 60 microlitres d’un anticorps secondaire conjugué fluorophore approprié à chaque glissière pour une incubation de 40 minutes à température ambiante.À la fin de l’incubation, laver les glissières dans PBS comme démontré, suivie d’un traitement dans 0,3% de noir du Soudan dans 70% d’éthanol pour étancher toute autofluorescence induite par la formaline potentielle. Après 30 minutes, laver les glissières dans l’eau du robinet pour enlever tout précipité et plonger les glissières dans pbs pendant 10 minutes pour empêcher toute formation de précipité noir du Soudan. À la fin de l’incubation, monter les diapositives sur des couvertures en verre confocal avec trois gouttes de 60 microlitres de solution de montage complétées par DAPI et sceller les coverslips avec du vernis à ongles.Laissez les glissières guérir pendant 24 heures à température ambiante. Conservez-les à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’à l’imagerie par microscopie à balayage laser confocale selon les protocoles standard. Assurez-vous de sceller les coverslips avec du vernis à ongles pour éviter tout mouvement pendant l’imagerie et de nettoyer les couvercles de l’éthanol pour améliorer la résolution d’imagerie.Après avoir imagerie 20 glomeruli par diapositive, ouvrez le plugin de segmentation Weka dans ImageJ et déposez la première image sur la barre d’outils ImageJ. Cliquez sur l’image, la couleur et les canaux divisés. Une image montrant la coloration primaire d’anticorps apparaîtra.Pour créer un fichier fusionné des images simples, cliquez sur la couleur et fusionnez les canaux. Une boîte popup apparaîtra demandant qu’une couleur soit attribuée à chaque canal. Vérifiez le créer composite et garder les boîtes d’images source et cliquez sur OK. Une image composite fusionnée apparaîtra.En utilisant la coloration primaire des anticorps comme guide, dessinez une région d’intérêt autour de la touffe glomerulaire. Pour effectuer un flou gaussien sur l’image DAPI bleue unique, cliquez sur le processus, les filtres et le flou gaussien. Réglez le flou à un à deux.L’image deviendra un peu floue, mais les noyaux apparaîtront lisses, l’arrière-plan sera adouci. Ensuite, cliquez sur plugins, segmentation, et la segmentation weka trainable, et utilisez l’outil main libre pour tracer les noyaux intacts. Lorsque tous les noyaux d’intérêt ont été ajoutés, ajouter la boîte de classe 1, utiliser l’outil de ligne pour délimité les zones d’arrière-plan à la boîte de classe deux.Cliquez sur créer une nouvelle classe et utilisez l’outil de ligne pour décrire l’ADN extranucléaire taché de DAPI. Cliquez sur classificateur de train et obtenir la probabilité. Basculer la souris pour obtenir une image en noir et blanc de tous les composants avec l’objet de sélection mis en évidence en blanc.Pour dupliquer cette image, cliquez sur l’image et dupliquez. Sous l’image, ajuster et seuil. Utilisez le bouton de la souris pour ajuster le seuil jusqu’à ce que seul l’ADN extracellulaire soit observé.Après le seuil, cliquez sur le processus, binaire, et faire binaire, et copier la région glormerular précédemment généré d’intérêt. Contrôle de presse Shift E pour sélectionner les modifications, sélections et restauration pour restaurer la sélection. Pour mesurer uniquement les particules d’ADN extracellulaires dans le glomerulus, cliquez sur analyser les particules et OK. Une feuille de résultats montrant le nombre de particules, la zone, les pixels moyens et le pourcentage de glomeruli contenant de l’ADN extracellulaire sera générée.Pour enregistrer le classificateur en tant que classificateur d’ADN extracellulaire, cliquez sur enregistrer classifier et enregistrer les données. Pour réappliquer le modèle aux images ultérieures, répétez le traitement initial de l’image tel qu’il a été démontré avant de sélectionner le classificateur de charge et le fichier classificateur enregistré. Le menu journal apparaîtra et exécutera le modèle.Une fois que le modèle s’est exécuté, cliquez sur les données de charge et sélectionnez l’extracellulaireDNA.arff. Cliquez ensuite sur créer le résultat. Si l’image résultante n’a pas réussi à capter tous les noyaux, l’arrière-plan ou l’ADN extracellulaire, cliquez sur retrain classifier et ajouter plus de classificateurs si nécessaire.Ici, des images à canal unique montrant l’ADN représentatif et la coloration bêta-actine sont affichées. La fusion des deux images permet de tirer une région d’intérêt autour de la zone glomerular pour la mesure de l’ADN extracellulaire dans le glomeruli de rein de souris utilisant la segmentation formable de Weka comme démontré. Ce modèle peut être adopté pour identifier l’ADN extracellulaire dans les spécimens de biopsie rénale d’un patient témoin ou la comparaison à celle d’une biopsie rénale d’un patient présentant la vascularite ANCA myeloperoxidase.En outre, ce programme peut être traduit à d’autres taches dans les échantillons de tissu rénal, par exemple, à la tache pour les pièges extracellulaires neutrophiles et le dépôt de myeloperoxidase extracellulaire dans la vascularite anca-associée. Fait important, aucune différence significative n’est observée lorsque les mêmes données sont analysées par plusieurs utilisateurs. L’étape la plus critique de l’analyse est de fournir suffisamment d’exemples d’arrière-plan, de noyaux et d’ADN extracellulaire avec glomeruli comme classificateurs pour le programme de segmentation Weka à apprendre.Cette méthode est facilement transférable. Par exemple, une analyse plus poussée des différents types de mort cellulaire peut être étudiée par la coloration d’anticorps spécifiques contre des marqueurs d’apoptose ou de nécrose. Notre technique peut être employée avec d’autres processus inflammatoires tels que l’évaluation de l’expression de TLR dans la maladie rénale autoimmune ou l’expression extracellulaire de myeloperoxidase dans les biopsies humaines de rein.

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