Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Wir würdigen Monash Micro Imaging für den Einsatz des aufrechten Konfokallaser-Scanning-Mikroskops Nikon C1 und der Monash Histology Platform für die Verarbeitung von Nierengewebe.

Diese Methode ermöglicht die Detektion von Pan ecDNA aus allen Formen des Zelltodes. Die gleiche Methode und Antikörper werden für menschliches Nierenbiopsiegewebe verwendet (ab Schritt 4). Alle tierischen und menschlichen Probanden hatten die Ethik-Zulassung von der Monash University und Monash Health, Clayton, Victoria, Australien.
1. Färbung für ecDNA mit DAPI und A-Actin
<ol><li>Induzieren Sie ein 20-Tage-Modell der Anti-Myeloperoxidase Glomerulonephritis (Anti-MPO-GN) in 8-10 Woche...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection.">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+the+significance+of+apoptosis.">Cell death: the significance of apoptosis.</a> International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).</li><li>Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+one+way+to+die:+apoptosis,+necrosis+and+reactive+oxygen+damage.">More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage.</a> Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).</li><li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+its+role+in+inflammation.">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

Es gibt mehrere Protokolle, die proinflammatorische Marker im Serum und Urin von Patienten und Mausmodellen der Glomerulonephritis messen. Dieses beschriebene Protokoll ermöglicht die direkte Analyse der Produkte des Zelltodes (ecDNA, NETs und ecMPO) innerhalb des Glomerulus. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die Gewebevorbereitung und -bildgebung. Das wichtigste einschränkende Element der Verwendung einer fluoreszierenden Färbungsmethode für die Analyse ist die Gewebe-Autofluoreszenz. Formalin fixier...

Myeloperoxidase anti neutrophile zytoplasmatische Antikörper assoziierte Vaskulitis (MPO-AAV) ist eine Autoimmunerkrankung, die zu Nierenversagen von pathologischen glomerulären Verletzungen mit erheblichem Zelltod und Freisetzung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)1,2führt. DNA kann das Immunsystem aktivieren, indem sie als Gefahrensignal fungiert. Unter normalen gesunden Bedingungen bietet die nukleare Lage der DNA Schutz vor der Exposition gegenüber dem Immunsystem. Selbst-DNA, die extrazellulär während entweder pathogener Prozesse oder Autoimmunität freigesetzt wird, wird vom Immunsystem als eine potente proinflammatorische Schädigung assoziierter molekularer Selbstprotein (DAMP)3gesehen. Extra zelluläre DNA (ecDNA) wird aus sterbenden Zellen durch mehrere verschiedene Mechanismen freigesetzt, die durch verschiedene biochemische Bahnen gesteuert werden, wie Apoptose, Nekrotophile extrazelluläre Trapbildung (NETs), Nekrose oder Pyroptose4,5,6,7,8.
Wir beschreiben hierin Methoden zur Färbung und Messung von ecDNA, die aus sterbenden Zellen in Abschnitten von formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Nieren von experimentellen Anti-MPO-GN- und Nierenbiopsien von Patienten mit MPO-AAV9,10freigesetzt werden. Es gibt mehrere Methoden zum Nachweis von zirkulierender doppelsträngiger DNA (dsDNA) und DNA-Komplexen aus Serum und Urin sowie aus In-vitro-Assays11,12. Diese Methoden, obwohl genau bei der Bestimmung der Menge an ecDNA, bestimmen nicht, wo die ecDNA anatomisch freigesetzt wird. Es gibt Methoden, die spezifische Messung von ecDNA wie Tunel für Apoptose und Messung von Zellablagerungen13,14beschreiben. Es gibt keine Methode, die die Messung von ecDNA beschreibt, die aus allen Formen des Zelltodes in FFPE-Nieren gegipfelt, wo die pathologische Schädigung auftritt. Dies ist wichtig, um festzustellen, ob experimentelle therapeutische Behandlungen die ecDNA von den Stellen der pathologischen Verletzung im eigentlichen Zielorgan löschen.
Die Erfassung mehrerer Bilder aus Nierenproben erzeugt ein hohes Datenvolumen, das häufig von einem einzelnen Benutzer analysiert wird. Dies ist arbeitsintensiv, zeitaufwändig und kann aufgrund von Voreingenommenheit des Benutzers einer unzuverlässigen Reproduzierbarkeit durch andere Benutzer unterliegen. Trainable Weka Segmentierung ist ein Open-Source-Software-Plugin für ImageJ, das modernste bioinforschende Werkzeuge verwendet, um Pixel mit Machine Learning-Algorithmen15,16zu klassifizieren. Diese Methode ist "trainierbar", wobei sie aus der Klassifizierung von Pixelsegmenten des Benutzers lernt und die neu gelernte Klassifizierung auf andere Bilder anwendet. Diese Methode basiert auf gängigen Analysewerkzeugen innerhalb des ImageJ-Programms, die verwendet werden, um jedes Pixel in einem Segment als zu einer bestimmten "Klasse" gehörend zu "klassifizieren". Sobald das Programm die "Klassifikatoren" erlernt hat, können sie verwendet werden, um andere ähnliche klassifizierte Segmente innerhalb desselben Bildes zu identifizieren. Dieses Modell wird dann gespeichert und auf andere Bildsätze innerhalb desselben Experiments angewendet.
Aktuelle Hindernisse bei der Bestimmung von ecDNA in situ in Nierenabschnitten ist die endogene Autofluoreszenz durch Fixierung im Formalin und die arbeitsintensive Analyse der Bilder. Wir beschreiben hier, wie diese Autofluoreszenz zu löschen, zu erkennen ecDNA, und verwenden überwachtes maschinelles Lernen für hohe Durchsatzmessung von ecDNA. Wir haben bereits die Messung von NETs und extrazellulärem MPO (ecMPO) mit einem Makro in ImageJ veröffentlicht, wir demonstrieren jetzt die Halbautomatisierung dieser Methoden mit überwachtem maschinellem Lernen1. Wir zeigen die Anpassungsfähigkeit des Machine Learning Tools, um einen alternativen Fleck für NETs und ecMPO innerhalb desselben Bildes zu klassifizieren. Diese hier beschriebenen Färbemethoden zum Nachweis von ecDNA, NETs und ecMPO können in andere feste Organe und Krankheiten übersetzt werden, bei denen ecDNA, NETS und ecMPO eine Rolle bei der Aufrechterhaltung von Krankheiten wie rheumatoider Arthritis und Lupus17,18spielen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

Der Glomeruläre Zelltod ist ein pathologisches Merkmal der Myeloperoxidase anti neutrophilen zytoplasmatischen Antikörperassoziierten Vaskulitis (MPO-AAV). Extrazelluläre Desoxyribonukleinsäure (ecDNA) wird bei verschiedenen Formen des Zelltodes freigesetzt, einschließlich Apoptose, Nekrose, Nekroptose, neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und Pyroptose. Die Messung dieses Zelltodes ist zeitaufwändig, wobei mehrere verschiedene Biomarker erforderlich sind, um die verschiedenen biochemischen Formen des Zelltodes zu identifizieren. Die Messung von ecDNA wird in der Regel in Serum und Urin als Ersatz für Nierenschäden durchgeführt, nicht im eigentlichen Zielorgan, wo die pathologische Verletzung auftritt. Die aktuelle Schwierigkeit bei der Untersuchung von ecDNA in der Niere ist das Fehlen von Methoden für formalin fixiertes Paraffin-eingebettetes Gewebe (FFPE) sowohl experimentell als auch in archivierten menschlichen Nierenbiopsien. Dieses Protokoll bietet eine Zusammenfassung der Schritte, die erforderlich sind, um für ecDNA in FFPE-Gewebe (sowohl menschliche als auch murine), abschrecken Autofluoreszenz und messen die ecDNA in den resultierenden Bildern mit einem Machine Learning-Tool aus der öffentlich verfügbaren Open-Source-ImageJ-Plugin trainable Weka Segmentierung. Die trainierbare Weka-Segmentierung wird auf ecDNA innerhalb der Glomeruli angewendet, wo das Programm lernt, ecDNA zu klassifizieren. Dieser Klassifizierer wird auf nachfolgende erworbene Nierenbilder angewendet, wodurch die Notwendigkeit manueller Anmerkungen für jedes einzelne Bild reduziert wird. Die Anpassungsfähigkeit der trainierbaren Weka-Segmentierung wird weiter im Nierengewebe von experimenteller muriner Anti-MPO-Glomerulonephritis (GN) nachgewiesen, um NETs und ecMPO, häufige pathologische Mitwirkende an Anti-MPO GN, zu identifizieren. Diese Methode bietet eine objektive Analyse von ecDNA im Nierengewebe, die die Wirksamkeit deutlich zeigt, in der das trainierbare Weka-Segmentierungsprogramm ecDNA zwischen gesundem normalem Nierengewebe und krankem Nierengewebe unterscheiden kann. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um ecDNA, NETs und ecMPO in anderen Organen zu identifizieren.

Diese Bilder stellen die verschiedenen Schritte dar, die erforderlich sind, um die trainierbare Weka-Segmentierung erfolgreich zu verwenden, um die arbeitsintensive manuelle Messung von ecDNA in fluoreszierend gefärbtem FFPE-Nierengewebe von einer Maus mit induziertem Anti-MPO GN zu minimieren. Diese Schritte sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 mit Bildern zusammengefasst, die direkt aus dem Weka-Segmentierungsprogramm aufgenomm...

Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Extrazelluläre DNA (ecDNA), die während des Zelltodes freigesetzt wird, ist proinflammatorische und trägt zu Entzündungen bei. Die Messung von ecDNA an der Verletzungsstelle kann die Wirksamkeit der therapeutischen Behandlung im Zielorgan bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines Machine Learning-Tools zur Automatisierung der Messung von ecDNA im Nierengewebe.

Überwachtes maschinelles Lernen zur Semiquantifizierung der extrazellulären DNA bei Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Glomerulonephritis verursacht pathologische glomeruläre Verletzungen mit erheblichem Zelltod und extrazellulärer DNA-Freisetzung. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung extrazellulärer DNA am Freisetzungsort bei pathologischen Verletzungen. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie extrazelluläre DNA aus dem Zelltod in der Niere misst.Im Gegensatz zu Serum oder Urin ist die extrazelluläre DNA-Messung ein Ersatzmarker für pathologische Schäden. Die Bedeutung dieser Methode ist, dass sowohl die extrazelluläre DNA-Färbung als auch die Bildanalyse leicht auf andere Autoimmunerkrankungen wie rheumatoide Arthritis und Lupus übertragbar sind. Diese Methode erfordert Grundkenntnisse der Nierenhistologie.Um den genauen Nachweis von glomerulärer extrazellulärer DNA zu ermöglichen, muss der Forscher in der Lage sein, Glomeruli korrekt zu identifizieren. Für die extrazelluläre DNA-Färbung zunächst die Proben von Interesse in einem Dia-Rack in 60 Grad Celsius für 60 Minuten erhitzen, bevor die Dias in zwei 40-minütige Lösungsmittelwechsel in einer Dunstabzugshaube eingetaucht werden. Nach dem zweiten Eintauchen die Proben zweimal in 100% Ethanol und einmal in 70% Ethanol für fünf Minuten pro Behandlung rehydrieren.Nach der letzten Behandlung verwenden Sie Zange, um die Dias in kochende Antigen-Retrieval-Lösung in einem Schnellkochtopf auf hoch für 10 Minuten zu platzieren. Nach dem Entlarven der Antigen-Epitope den Schnellkochtopf von der Hitze in ein Waschbecken geben und sofort kaltes Leitungswasser über den Deckel laufen lassen. Lassen Sie die Dias für 20 Minuten in der Antigen-Retrieval-Lösung ausdemieren, bevor Sie die Proben zweimal in 0,01 Molar PBS auf einem Orbital-Shaker für fünf Minuten pro Wäsche waschen.Nach der zweiten Wäsche verwenden Sie einen hydrophoben Pen, um Kreise um die Nierengewebeproben zu ziehen und jede unspezifische Färbung mit 60 Mikrolitern 10% Hühnerserum in 5% Rinderserumalbumin für 30 Minuten bei Raumtemperatur zu blockieren. Am Ende der Inkubation die Blockierlösung vorsichtig durch 60 Mikroliter des primären Antikörpers von Interesse in einer Feuchtigkeitskammer über Nacht bei vier Grad Celsius ersetzen. Am nächsten Morgen waschen Sie die Dias auf einem Orbital-Shaker in PBS für zwei Minuten pro Wäsche, bevor Sie 60 Mikroliter eines geeigneten fluorophorkonjugierten Sekundärantikörpers zu jedem Dia für eine 40-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen.Waschen Sie am Ende der Inkubation die Dias in PBS, wie gezeigt, gefolgt von einer Behandlung in 0,3% Sudan schwarz in 70% Ethanol, um mögliche formalininduzierte Autofluoreszenz zu löschen. Waschen Sie nach 30 Minuten die Rutschen in Leitungswasser, um alle Ausscheidungen zu entfernen, und tauchen Sie die Dias 10 Minuten lang in PBS ein, um eine weitere sudanesische schwarze Niederschlagsbildung zu verhindern. Am Ende der Inkubation die Dias auf konfokale Glasabdeckungen mit drei 60-Mikroliter-Tropfen Montagelösung, ergänzt mit DAPI, montieren und die Abdeckungen mit Nagellack versiegeln.Lassen Sie die Dias 24 Stunden bei Raumtemperatur aushärten. Bewahren Sie sie bei vier Grad Celsius vor Licht bis zur Bildgebung durch konfokale Laserscanmikroskopie nach Standardprotokollen auf. Versiegeln Sie die Abdeckungen mit Nagellack, um Bewegungen während der Bildgebung zu verhindern und die Abdeckungen von Ethanol zu reinigen, um die bildgebende Auflösung zu verbessern.Öffnen Sie nach der Abbildung von 20 Glomeruli pro Folie das trainierbare Weka Segmentation Plugin in ImageJ und lassen Sie das erste Bild auf die ImageJ-Symbolleiste. Klicken Sie auf Bild,- und geteilte Kanäle. Es wird ein Bild mit der primären Antikörperfärbung angezeigt.Um eine zusammengeführte Datei der einzelnen Bilder zu erstellen, klicken Sie auf Farbe und führen Sie Kanäle zusammen. Es wird ein Popup-Feld angezeigt, in dem sie darum bittet, jedem Kanal eine Farbe zuzuweisen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Composite erstellen, quellbilder beibehalten und auf OK klicken. Ein zusammengeführtes zusammengesetztes Bild wird angezeigt.Zeichnen Sie die primäre Antikörperfärbung als Leitfaden, ziehen Sie eine Region von Interesse um den glomerulären Büschel. Um eine Gaußsche Unschärfe auf dem einzelnen blauen DAPI-Bild auszuführen, klicken Sie auf Prozess, Filter und Gaußsche Unschärfe. Stellen Sie die Unschärfe auf eins bis zwei fest.Das Bild wird ein wenig verschwommen, aber die Kerne erscheinen glatt, der Hintergrund wird aufgeweicht. Klicken Sie als Nächstes auf Plugins, Segmentierung und trainierbare Weka-Segmentierung, und verwenden Sie das kostenlose Handwerkzeug, um die intakten Kerne zu verfolgen. Wenn alle Kerne von Interesse hinzugefügt wurden, verwenden Sie das Feld "Hinzufügen Klasse 1", um die Hintergrundbereiche für das Feld Klasse 2 zu kennstrecken.Klicken Sie auf Neue Klasse erstellen, und verwenden Sie das Linienwerkzeug, um die DAPI-befleckte extranukleare DNA zu skizzieren. Klicken Sie auf Zugklassifier und erhalten Sie Wahrscheinlichkeit. Schalten Sie die Maus um, um ein Schwarzweißbild aller Komponenten zu erhalten, wobei das Auswahlobjekt weiß hervorgehoben ist.Um dieses Bild zu duplizieren, klicken Sie auf Bild und Duplikat. Unter Bild, anpassen und Schwellenwert. Verwenden Sie die Maustaste, um den Schwellenwert anzupassen, bis nur die extrazelluläre DNA beobachtet wird.Klicken Sie nach dem Schwellenwert auf Prozess, Binärdatei und erstellen Sie Binärdateien, und kopieren Sie den zuvor generierten glomerularen Bereich von Interesse. Drücken Sie die Steuertaste E, um Bearbeiten, Auswahlen und Wiederherstellung auszuwählen, um die Auswahl wiederherzustellen. Um nur die extrazellulären DNA-Partikel innerhalb des Glomerulus zu messen, klicken Sie auf Partikel analysieren und OK. Es wird ein Ergebnisblatt mit der Anzahl der Partikel, der Fläche, der durchschnittlichen Pixel und des Prozentsatzes der Glomeruli generiert, die extrazelluläre DNA enthalten.Um den Klassifier als extrazellulären DNA-Klassifier zu speichern, klicken Sie auf Klassifier speichern und speichern Sie die Daten. Um das Modell erneut auf nachfolgende Bilder anzuwenden, wiederholen Sie die anfängliche Bildverarbeitung, wie gezeigt, bevor Sie den Lastklassifier und die gespeicherte Klassifierdatei auswählen. Das Protokollmenü wird angezeigt und das Modell ausgeführt.Sobald das Modell ausgeführt wurde, klicken Sie auf Daten laden, und wählen Sie die extracellularDNA.arff aus. Klicken Sie dann auf Ergebnis erstellen. Wenn das resultierende Bild nicht alle Kerne, Hintergründe oder extrazelluläre DNA aufnehmen konnte, klicken Sie auf Klassifikator umschulen, und fügen Sie bei Bedarf weitere Klassifikatoren hinzu.Hier werden Einkanalbilder gezeigt, die repräsentative DNA- und Beta-Actin-Färbungen zeigen. Durch die Zusammenführung der beiden Bilder kann ein Bereich von Interesse um den glomerulären Bereich gezogen werden, um die extrazelluläre DNA innerhalb der Mausnierenglomeruli mit trainierbarer Weka-Segmentierung zu messen, wie gezeigt. Dieses Modell kann angenommen werden, um extrazelluläre DNA in Nierenbiopsieproben von einem Kontrollpatienten oder Vergleich mit der einer Nierenbiopsie von einem Patienten mit Myeloperoxidase ANCA-assoziierte Vaskulitis zu identifizieren.Darüber hinaus kann dieses Programm in andere Flecken in Nierengewebeproben übersetzt werden, zum Beispiel, um für neutrophile extrazelluläre Fallen und die Ablagerung von extrazellulärer Myeloperoxidase bei ANCA-assoziierter Vaskulitis zu färben. Wichtig ist, dass keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden, wenn dieselben Daten von mehreren Benutzern analysiert werden. Der kritischste Schritt der Analyse besteht darin, genügend Beispiele für Hintergrund, Kerne und extrazelluläre DNA mit Glomeruli als Klassifikatoren für das Weka Segmentierungsprogramm bereitzustellen, von denen man lernen kann.Diese Methode ist leicht übertragbar. Beispielsweise kann eine weitere Analyse der verschiedenen Arten des Zelltodes durch Färbung für spezifische Antikörper gegen Marker für Apoptose oder Nekrose untersucht werden. Unsere Technik kann mit anderen entzündlichen Prozessen wie der Beurteilung der TLR-Expression bei autoimmunen Nierenerkrankungen oder der extrazellulären Myeloperoxidase-Expression in menschlichen Nierenbiopsien verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Entwicklung von Zell-spezifischen Anti-HIV-gp120-Aptamere für siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Ratiometrisch Imaging von extrazellulären pH in Dental Biofilme

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Erkennung von niedrigen Kopie Nummer integrierte virale DNA gebildet durch In-vitro- Hepatitis B-Infektion

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...