Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

אנו מכירים את מונש מיקרו הדמיה לשימוש של ניקון C1 זקוף לייזר מיקרוסקופ מערכת סריקה בלייזר ואת פלטפורמת מונש היסטולוגיה לעיבוד של רקמת כליה.

שיטה זו מאפשרת זיהוי של פאן ecDNA מכל צורות של מוות תאים. אותה שיטה ונוגדנים משמשים לרקמת ביופסיה של האדם (משלב 4). כל החיות והנושאים האנושיים היה אישור האתיקה מאוניברסיטת מונש, ומונש בריאות, קלייטון, ויקטוריה, אוסטרליה.
1. צביעת עבור ecDNA עם DAPI ו β-Actin
<ol><li>לגרום 20 יום מודל של אנטי my...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection.">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+the+significance+of+apoptosis.">Cell death: the significance of apoptosis.</a> International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).</li><li>Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+one+way+to+die:+apoptosis,+necrosis+and+reactive+oxygen+damage.">More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage.</a> Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).</li><li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+its+role+in+inflammation.">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

פרוטוקולים מרובים קיימים כי למדוד סמנים proinflammatory בסרום ושתן של שני חולים ומודלים של העכבר של glomerulonephritis. הפרוטוקול המתואר מאפשר ניתוח של המוצרים של מוות תאים (ecDNA, רשתות ו-ecMPO) בתוך הפקולוס ישירות. הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם הכנת רקמות והדמיה. האלמנט העיקרי הגבלת שימוש בשיטת פלורס...

הנוגדן Myeloperoxidase אנטי נויטרופילים cytoplasmic הקשורים דלקת כלי דם (MPO-aav) היא מחלה אוטואימונית כי תוצאות אי ספיקת כליות מפציעה פתולוגית משמעותית עם מוות תאים משמעותי ושחרור של חומצה deoxyribonucleic (DNA)1,2. הדנ א יכול להפעיל את המערכת. החיסונית בכך שהוא מתפקד כאות סכנה בתנאים בריאים נורמליים, המיקום הגרעיני של דנ א מציע הגנה מפני חשיפה למערכת החיסונית. Self-DNA כי הוא שוחרר extracellularly במהלך תהליכים פתוגניים או חסינות אוטומטית נתפסת על ידי המערכת החיסונית כמו נזק proinflammatory הקשורים מולקולרית חלבון מולקולרי (לח)3. נוסף DNA הסלולר (ecdna) הוא שוחרר מן התאים המתים באמצעות מנגנונים ברורים מספר כי הם נשלטים על ידי מסלולים ביוכימיים ברורים, כגון אפופטוזיס, נקרופזה נויטרופילים מסחטות היווצרות המלכודת (רשתות), נמק או פירופסיס4,5,6,7,8.
אנו מתארים בזאת שיטות לכתם ולמדוד ecdna שוחרר מתאי מתים במקטעים של פורמלין קבוע פרפין מוטבע (ffpe) הכליות של ניסיוני anti-MPO GN וביופסיות כליות מחולים עם MPO-aav9,10. שיטות מרובות קיימות לזיהוי של במחזור dna תקועים כפול (dsdna) ו-dna מכלולי משני הסרום והשתן ומחוץ לחדר המבחנה11,12. שיטות אלה, למרות מדויק בקביעת כמות ecDNA, לא קובעים היכן ecDNA שוחרר מבחינה אנטומית. ישנן שיטות המתארות מדידה ספציפית של ecdna כגון tunel עבור אפופטוזיס ומדידה של פסולת תא13,14. אין שיטה המתארת מדידת ecDNA הגיע לשיאו מכל צורות של מוות תאים בכליות FFPE שבו הנזק הפתולוגי מתרחשת. חשוב לקבוע אם הטיפולים הטיפוליים הניסיוניים מרוקנים את ה-Dna מאתרי הפציעה הפתולוגית באיבר היעד הממשי.
רכישת תמונות מרובות מדגימות כליות יוצרת נפח גדול של נתונים שנותחו בדרך כלל על-ידי משתמש יחיד. זוהי עבודה אינטנסיבית, זמן רב והוא יכול להיות כפוף השגות מהימן על ידי משתמשים אחרים, עקב הטיית המשתמש. פילוח של Trainable weka הוא תוסף תוכנה לקוד פתוח עבור imagej המשתמש בכלים ביולוגיים מתקדמים כדי לסווג פיקסלים באמצעות אלגוריתמים15שללימוד מחשב 15,16. שיטה זו היא "trainable" לפיה היא לומדת מסיווג המשתמש של מקטעי פיקסלים ומחילה את הסיווג החדש למדו על תמונות אחרות. שיטה זו מסתמכת על כלי ניתוח נפוצים בתוך התוכנית ImageJ המשמשים "לסווג" כל פיקסל במקטע כשייכות ל"מחלקה" ספציפית. לאחר התוכנית לומדת את "מסווגים", הם יכולים לשמש כדי לזהות קטעים מסווגים דומים אחרים בתוך אותה תמונה. מודל זה נשמר ומוחל על קבוצות אחרות של תמונות בתוך אותו ניסוי.
המכשולים הנוכחיים כדי לקבוע ecDNA בתוך מקטעי כליות הוא אוטודוגני אוטומטי מקיבעון בפורמאלין ואת ניתוח אינטנסיבית העבודה של התמונות. אנו מתארים כאן כיצד להרוות את זה autoפלואורסצנטית, לזהות ecDNA, ולהשתמש פיקוח מחשב למידה מדידה תפוקה גבוהה של ecDNA. פרסמנו בעבר את המדידה של רשתות ומMPO (ecMPO) באמצעות מאקרו ב-ImageJ, אנו מדגימים כעת למחצה אוטומציה של שיטות אלה באמצעות מחשב מפוקח למידה1. אנו מדגימים את ההסתגלות של כלי הלמידה של המכונה, כדי לסווג כתם חלופי לרשתות ו ecMPO בתוך אותה תמונה. אלה כתמים שיטות המתוארות כאן לגילוי ecdna, רשתות ו ecMPO ניתן לתרגם איברים מוצק אחרים ומחלות שבו ecdna, רשתות ו ecMPO משחק תפקיד להנציח את המחלה כגון דלקת מפרקים שגרונית ולופוס17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

מוות של תאים פקוניים הוא תכונה פתולוגית של myeloperoxidase אנטי נויטרופילים cytoplasmic נוגדן הקשורים דלקת כלי דם (MPO-AAV). חומצת מסחטות (ecDNA) שוחררה במהלך צורות שונות של מוות תאים, כולל אפופטוזיס, נמק, נקרופסיס, מלכודות נויטרופילים ופירופסיס. מדידה של מוות זה תא הוא זמן רב עם מספר סמנים שונים הנדרשים כדי לזהות את הצורות הביוכימי השונים של מוות תאים. מדידה של ecDNA מתנהל בדרך כלל סרום ושתן כמו פונדקאית עבור נזק לכליות, לא באיבר היעד בפועל שבו הפציעה הפתולוגית מתרחשת. הקושי הנוכחי בחקירת ecdna בכליה הוא חוסר שיטות עבור הרקמה הקבועה של פורמלין מוטבע רקמת פרפין (ffpe) הן בניסויים והן בארכיון ביופסיה של כליות האדם. פרוטוקול זה מספק סיכום של השלבים הדרושים לכתם עבור ecDNA ברקמת FFPE (הן של האדם וגם murine), כיבוי באופן אוטומטי ולמדוד את ecDNA בתמונות וכתוצאה מכך באמצעות כלי למידה מכונה מתוך הזמין בפומבי הקוד הפתוח הפנויה ImageJ תוסף trainable Weka פילוח. פילוח Trainable Weka מוחל על ecDNA בתוך הפקאולי היכן התוכנית לומדת לסווג ecDNA. מסווג זה מוחל על תמונות כליות שנרכשו לאחר מכן, ומפחית את הצורך ביאורים ידניים של כל תמונה בודדת. הסתגלות של פילוח Weka trainable מוצג עוד יותר ברקמת הכליות מפני הניסוי הנסיוני האנטי-MPO של מורלין (GN), כדי לזהות רשתות וecMPO, תורמים פתולוגיים שכיחים לאנטי MPO GN. שיטה זו מספקת ניתוח אובייקטיבי של ecDNA ברקמת כליות המדגימה בבירור את היעילות שבה trainable Weka התוכנית פילוח יכול להבחין ecDNA בין רקמת כליה נורמלית בריאה ורקמות הכליה החולה. ניתן להתאים בקלות פרוטוקול זה לזיהוי ecDNA, רשתות וecMPO באיברים אחרים.

תמונות אלה מייצגות את השלבים המרובים הדרושים כדי להשתמש בהצלחה פילוח Weka trainable כדי למזער את המדידה הידנית של העבודה אינטנסיבית של ecDNA ברקמת כליות FFPE ויטראז ' מתוך עכבר עם המושרה anti-MPO GN. שלבים אלה מסוכמים באיור 1 ובאיור 2 עם תמונות שצולמו ישיר?...

Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

במהלך מוות תאי הוא proinflammatory ותורם לדלקת. מדידת ecDNA באתר פציעה יכולה לקבוע את היעילות של הטיפול הטיפולי באיבר היעד. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכלי למידה של מחשב כדי להפוך את המדידה של ecDNA ברקמת הכליות.

לימוד מכונה ללימוד למחצה של דנ א של מסחטות בפקאוסולפטיס

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Glomerulonephritis גורם לפציעה גלומרולרית פתולוגית עם מוות תאי ניכר ושחרור DNA חוץ תאי. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של דנ"א חוץ-תאי באתר השחרור במהלך פגיעה פתולוגית. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מודדת דנ"א חוץ תאי מהמוות של התאים בכליה.בניגוד לסרום או שתן, מדידת DNA חוץ-תאית היא סמן פונדקאי לנזק פתולוגי. המשמעות של שיטה זו היא כי הן כתמי DNA חוץ תאיים וניתוח תמונה ניתנים להעברה בקלות למחלות אוטואימוניות אחרות כגון דלקת מפרקים שגרונית זאבת. שיטה זו דורשת ידע בסיסי בהיסטולוגיה של הכליות.כדי לאפשר זיהוי מדויק של דנ"א חוץ-תאי גלומרולרי, החוקר חייב להיות מסוגל לזהות כראוי גלומרולי. עבור כתמי DNA חוץ-תאיים, מחממים תחילה את דגימות העניין במתלה שקופיות ב-60 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לפני שהם טובלים את המגלשות בשני שינויים של 40 דקות של ממס במכסה המנוע. לאחר הטבילה השנייה, rehydrate את הדגימות פעמיים 100% אתנול ופעם אחת ב 70% אתנול במשך חמש דקות לטיפול.לאחר הטיפול האחרון, להשתמש מלקחיים למקם את המגלשות לתוך פתרון אחזור אנטיגן רותחים סיר לחץ על גבוה במשך 10 דקות. לאחר חשיפה של אפיטופים אנטיגן, להעביר את סיר הלחץ מהחום לתוך כיור מיד להפעיל מי ברז קרים מעל המכסה. אפשר את השקופיות כדי לצייד במשך 20 דקות בתתבר אחזור אנטיגן לפני שטיפת הדגימות פעמיים ב 0.01 PBS טוחן על שייקר מסלולית במשך חמש דקות לכל לשטוף.לאחר הכביסה השנייה, השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגולים סביב דגימות רקמת הכליה ולחסום כל כתם לא ספציפי עם 60 מיקרוליטרים של סרום עוף 10% ב 5% אלבומין סרום bovine במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, בזהירות להחליף את פתרון החסימה עם 60 microliters של הנוגדן העיקרי של עניין בתא לחות לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לשטוף את המגלשות על שייקר מסלולית ב PBS במשך שתי דקות לכל לשטוף לפני הוספת 60 microliters של נוגדן פלואורופור מתאים הוסיף נוגדן משני לכל שקופית עבור דגירה של 40 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות PBS כפי שהוכח, ואחריו טיפול 0.3% סודן שחור ב 70% אתנול כדי להתוות כל שפעת אוטומטית הנגרמת על ידי פורמלין פוטנציאלי. לאחר 30 דקות, לשטוף את המגלשות במי ברז כדי להסיר כל משקע לטבול את המגלשות PBS במשך 10 דקות כדי למנוע כל היווצרות משקע שחור סודן נוסף. בסוף הדגירה, הר את השקופיות על כיסויי זכוכית קונפוקלית עם שלוש 60 טיפות מיקרוליטר של פתרון הרכבה בתוספת DAPI ולאטום את כיסויי עם לק.אפשר לשקופיות לרפא במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. לאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור עד הדמיה על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. הקפד לאטום את כיסויים עם לק כדי למנוע כל תנועה במהלך הדמיה כדי לנקות את הכיסויים של אתנול כדי לשפר את רזולוציית ההדמיה.לאחר הדמיית 20 glomeruli לכל שקופית, לפתוח את תוסף פילוח Weka להתאמה ImageJ ושחרר את התמונה הראשונה על סרגל הכלים ImageJ. לחצו על 'תמונה', 'צבע' ו'פיצול ערוצים'. תמונה המציגה את כתמי הנוגדנים העיקריים תופיע.ליצירת קובץ ממוזג של התמונות הבודדות, לחצו על 'צבע' ומזגו ערוצים. תופיע תיבה מוקפצת המבקשת להקצות צבע לכל ערוץ. סמן את תיבות יצירת תמונות המקור ללא הפרדות צבע ושמור אותן ולחץ על אישור. תמונה ללא הפרדות צבע ממוזגת תופיע.שימוש בכתמי הנוגדנים העיקריים כמדריך, צייר אזור מעניין סביב הטופט גלומרולרי. לביצוע טשטוש גאוסיאני על תמונת DAPI כחולה אחת, לחצו על 'תהליך', 'מסננים' ו'טשטוש גאוסיאני'. תן לטשטוש 1 עד 2.התמונה תהפוך קצת מטושטשת, אבל הגרעינים ייראו חלקים, הרקע יהיה מרוכך. לאחר מכן, לחץ על תוספים, פילוח, ו- Weka פילוח להתאמה, ולהשתמש בכלי היד החופשית כדי לעקוב אחר הגרעינים שלמים. לאחר הוספת כל הגרעינים המעניינים, התיבה הוסף מחלקה אחת, השתמש בכלי הקו כדי לתווים את אזורי הרקע לתיבה מחלקה 2.לחץ על צור מחלקה חדשה ולהשתמש בכלי הקו כדי לחלק לרמות את הדנ"א החוץ-גרעיני המוכתם ב- DAPI. לחץ על מסווג הרכבת ו קבל הסתברות. החלף מצב העכבר כדי לקבל תמונה בשחור-לבן של כל הרכיבים כאשר אובייקט הבחירה מסומן בלבן.כדי לשכפל תמונה זו, לחץ על תמונה ושכפל. תחת תמונה, התאם סף. השתמש בלחצן העכבר כדי להתאים את הסף עד שרק הדנ"א החוץ-תאי נצפה.לאחר סף, לחץ על תהליך, בינארי והפוך לקובץ בינארי והעתק את אזור העניין גלומרולרי שנוצר קודם לכן. הקש Control Shift E כדי לבחור עריכה, בחירות ושחזור כדי לשחזר את הבחירה. כדי למדוד רק את חלקיקי הדנ"א החוץ-תאיים בתוך הגלומרולוס, לחץ על נתח חלקיקים וסדר. גליון תוצאות המציג את מספר החלקיקים, האזור, הפיקסלים הממוצעים ואחוזי הגלומרולי המכילים דנ"א חוץ-תאי ייווצרו.כדי לשמור את המסווג כמסווג דנ"א חוץ-תאי, לחץ על שמור מסווג ושמור את הנתונים. כדי להחיל מחדש את הדגם על התמונות הבאות, חזור על עיבוד התמונה הראשוני כפי שהודגם לפני בחירת מסווג העומס וקובץ המסווג שנשמר. תפריט יומן הרישום יצץ ויפעיל את הדגם.לאחר הפעלת המודל, לחץ על טען נתונים ובחר את ה- extracellularDNA.arff. לאחר מכן לחץ על צור תוצאה. אם התמונה המתקבלת לא הצליחה לקלוט את כל הגרעינים, הרקע או הדנ"א החוץ-תאי, לחץ על מסווג הסבה מחדש והוסף מסווגים נוספים לפי הצורך.כאן מוצגות תמונות ערוץ יחיד המציגות כתמי דנ"א מייצגים וכתמי בטא אקטין. מיזוג שתי התמונות מאפשר אזור מעניין להימשך סביב האזור גלומרולרי למדידת ה-DNA החוץ תאי בתוך גלומרולי הכליות של העכבר באמצעות פילוח Weka להתאמה כפי שהוכח. מודל זה יכול להיות מאומץ כדי לזהות DNA חוץ תאית בדגימות ביופסיה של הכליה מחולה בקרה או השוואה לזה של ביופסיה בכליות מחולה עם דלקת כליות הקשורים MYELoperoxidase ANCA.בנוסף, תוכנית זו יכולה להיות מתורגמת כתמים אחרים בתוך דגימות רקמת הכליה, למשל, כדי להכתים עבור מלכודות נויטרופילים חוץ תאיים ותצהיר של myeloperoxidase חוץ תאיים בדלקת כלי דם הקשורים ANCA. חשוב לציין, אין הבדלים משמעותיים נצפים כאשר אותם נתונים מנותחים על ידי משתמשים מרובים. השלב הקריטי ביותר של הניתוח הוא לספק מספיק דוגמאות של רקע, גרעינים, ו- DNA חוץ תאי עם glomeruli כמסווגים עבור תוכנית פילוח Weka ללמוד.שיטה זו ניתנת להעברה בקלות. לדוגמה, ניתוח נוסף של סוגים שונים של מוות תאי ניתן לחקור באמצעות כתמים עבור נוגדנים ספציפיים נגד סמנים עבור אפופטוזיס או נמק. הטכניקה שלנו יכולה לשמש עם תהליכים דלקתיים אחרים כגון הערכת ביטוי TLR במחלת כליות אוטואימונית או ביטוי myeloperoxidase חוץ תאי בביופסיות כליות אנושיות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

הדמית ratiometric של pH התאי Biofilms השיניים

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...