Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
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हम निकॉन सी 1 ईमानदार कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप और किडनी ऊतक के प्रसंस्करण के लिए मोनाश हिस्टोलॉजी प्लेटफॉर्म के उपयोग के लिए मोनाश माइक्रो इमेजिंग स्वीकार करते हैं।

यह विधि सेल मृत्यु के सभी रूपों से पैन ecDNA का पता लगाने में सक्षम बनाता है। एक ही विधि और एंटीबॉडी मानव गुर्दे बायोप्सी ऊतक (चरण 4 से) के लिए उपयोग किया जाता है। सभी पशु और मानव विषयों मोनाश विश्वविद्यालय स?...

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	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

कई प्रोटोकॉल मौजूद हैं जो सीरम और रोगियों और ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के माउस मॉडल दोनों के मूत्र में प्रोमिन्फ्लैमेटरी मार्कर को मापते हैं। यह वर्णित प्रोटोकॉल सीधे ग्लोमेरुलस के भीतर सेल डेथ (ईसीडीए?...

माइलोप्रोक्सिडेज एंटी न्यूट्रोफिल साइटोप्लाज्मिक एंटीबॉडी से जुड़े वैक्यूलाइटिस (एमपीओ-एएवी) एक ऑटोइम्यून रोग है जिसके परिणामस्वरूप पैथोलॉजिकल ग्लोमेरुलर चोट से गुर्दे की विफलता होती है जिसमें काफी सेल मृत्यु होती है और डिऑक्सीरिबोक्यूक्लिक एसिड (डीएनए)1,,2की रिहाई होती है। डीएनए खतरे के संकेत के रूप में कार्य करके प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय कर सकता है। सामान्य स्वस्थ परिस्थितियों में, डीएनए का परमाणु स्थान प्रतिरक्षा प्रणाली के संपर्क से सुरक्षा प्रदान करता है। आत्म-डीएनए जो रोगजनक प्रक्रियाओं या ऑटोनियुमाइंसिटी के दौरान अतिरिक्त रूप से जारी किया जाता है, प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा आणविक आत्म-प्रोटीन (नम) 3 से जुड़े एक शक्तिशाली प्रोइनफ्लेमेटरी क्षति के रूप मेंदेखा जाताहै। अतिरिक्त सेलुलर डीएनए (ecDNA) को कई अलग-अलग तंत्रों के माध्यम से मरने वाली कोशिकाओं से छोड़ा जाता है जो अलग-अलग जैव रासायनिक मार्गों द्वारा शासित होते हैं, जैसे एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलर ट्रैप फॉर्मेशन (नेट्स), नेक्रोसिस या पायरोप्टोसिस4,,5,,6,,7,,8।
हम एमपीओ-एएवी9,,10के रोगियों से प्रायोगिक एंटी-एमपीओ जीएन और किडनी बायोप्सी से फॉर्मलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (एफएफएपी) गुर्दे के वर्गों में मरने वाली कोशिकाओं से जारी ecDNA को दाग और मापने के लिए इसके तरीकों का वर्णन करते हैं। सीरम और मूत्र दोनों से और इन विट्रो में से11,12से डबल फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) और डीएनए परिसरों का पता लगाने के लिए कई तरीके मौजूद हैं । ये तरीके, हालांकि ecDNA की मात्रा का निर्धारण करने में सटीक, यह निर्धारित नहीं करते हैं कि ईसीडीएनए शारीरिक रूप से कहां जारी किया जाता है। ऐसे तरीके हैं जो ईसीडीएनए के विशिष्ट माप जैसे एपोप्टोसिस के लिए ट्यूनल और सेल मलबे की माप13,14का वर्णनकरतेहैं । ऐसा कोई तरीका नहीं है जो एफएफएपी गुर्दे में सेल मृत्यु के सभी रूपों से होने वाली ईसीडीएनए को मापने का वर्णन करता है जहां रोग क्षति होती है। यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि क्या प्रयोगात्मक चिकित्सीय उपचार वास्तविक लक्ष्य अंग में रोग चोट की साइटों से ecDNA समाशोधन कर रहे हैं ।
गुर्दे के नमूनों से कई छवियों का अधिग्रहण डेटा की एक उच्च मात्रा बनाता है जिसका विश्लेषण आमतौर पर एक ही उपयोगकर्ता द्वारा किया जाता है। यह श्रम गहन, समय लेने वाला है और उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह के कारण अन्य उपयोगकर्ताओं द्वारा अविश्वसनीय प्रजनन क्षमता के अधीन हो सकता है। ट्रेनेबल वेका सेगमेंटेशन इमेजजे के लिए एक ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर प्लगइन है जो मशीन लर्निंग एल्गोरिदम15,,16का उपयोग करके पिक्सल को वर्गीकृत करने के लिए अत्याधुनिक बायोइन्फॉर्मेटिक टूल का उपयोग करता है। यह विधि "ट्रेनेबल" है जिससे यह पिक्सल के सेगमेंट के उपयोगकर्ता के वर्गीकरण से सीखता है और नए सीखे गए वर्गीकरण को अन्य छवियों पर लागू करता है। यह विधि ImageJ कार्यक्रम के भीतर सामान्य विश्लेषण उपकरणों पर निर्भर करती है जिसका उपयोग प्रत्येक पिक्सेल को एक विशिष्ट "वर्ग" से संबंधित सेगमेंट में "वर्गीकृत" करने के लिए किया जाता है। एक बार जब कार्यक्रम "क्लासिफायर" सीखता है, तो उनका उपयोग एक ही छवि के भीतर अन्य समान वर्गीकृत खंडों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। इस मॉडल को तब सहेजा जाता है और उसी प्रयोग के भीतर छवियों के अन्य सेटों पर लागू किया जाता है।
गुर्दे के वर्गों में सीटू में ecDNA का निर्धारण करने के लिए वर्तमान बाधाएं फॉर्मेलिन में निर्धारण और छवियों के श्रम-गहन विश्लेषण से अंतर्जात ऑटोफ्लोरेसेंस है। हम यहां वर्णन करते हैं कि इस ऑटोफ्लोरेसेंस को कैसे बुझाया जाए, ecDNA का पता लगाया जाए, और ecDNA के उच्च थ्रूपुट माप के लिए पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग का उपयोग करें। हमने पहले इमेजजे में मैक्रो का उपयोग करके एनईटी और एक्सट्रासेलुलर एमपीओ (ईसीएमपीओ) की माप प्रकाशित की है, अब हम पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग1का उपयोग करके इन तरीकों के अर्ध स्वचालन का प्रदर्शन करते हैं। हम एक ही छवि के भीतर NETs और ecMPO के लिए एक वैकल्पिक दाग वर्गीकृत करने के लिए मशीन लर्निंग उपकरण की अनुकूलनशीलता प्रदर्शित करते हैं। ईसीडीएनए, एनईटी और ईसीएमपीओ का पता लगाने के लिए यहां वर्णित इन धुंधला तरीकों का अनुवाद अन्य ठोस अंगों और रोगों में किया जा सकता है जहां ईसीडीएनए, नेट और ईसीएमपीओ रोग को बनाए रखने में भूमिका निभाते हैं जैसे रूमेटॉयड आर्थराइटिस और ल्यूपस17,,18।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

ग्लोमेरुलर सेल डेथ माइलोलॉक्सिडेज एंटी न्यूट्रोफिल साइटोप्लाज्मिक एंटीबॉडी एसोसिएटेड वैक्यूलाइटिस (एमपीओ-एएवी) की एक पैथोलॉजिकल विशेषता है। एक्सपेरिमेंटल डिऑक्सीरिबोक्यूक्लिक एसिड (एक्डना) सेल डेथ के विभिन्न रूपों के दौरान जारी किया जाता है जिसमें एपोप्टोसिस, नेक्रोसिस, नेक्रोटोसिस, न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (नेट्स) और पायरोप्टोसिस शामिल हैं। इस सेल मृत्यु का मापन सेल मृत्यु के विभिन्न जैव रासायनिक रूपों की पहचान करने के लिए आवश्यक कई अलग-अलग बायोमार्कर के साथ समय लगता है। EcDNA का माप आम तौर पर गुर्दे की क्षति के लिए एक किराए के रूप में सीरम और मूत्र में आयोजित किया जाता है, वास्तविक लक्ष्य अंग में नहीं जहां रोग चोट होती है । गुर्दे में ecDNA की जांच में वर्तमान कठिनाई दोनों प्रयोगात्मक और संग्रहीत मानव गुर्दे बायोप्सी में फॉर्मेलिन फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड ऊतक (एफएफपीई) के लिए तरीकों की कमी है। यह प्रोटोकॉल एफएफपीई ऊतक (मानव और मुरीन दोनों) में ecDNA के लिए दाग करने के लिए आवश्यक चरणों का सारांश प्रदान करता है, ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाता है और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध ओपन सोर्स इमेजजे प्लगइन ट्रेनेबल वेका सेगमेंटेशन से मशीन लर्निंग टूल का उपयोग करके परिणामस्वरूप छवियों में ecDNA को मापता है। ट्रेनेबल वेका सेगमेंटेशन को ग्लोमेरुली के भीतर ecDNA पर लागू किया जाता है जहां कार्यक्रम ecDNA को वर्गीकृत करना सीखता है। यह क्लासिफायर बाद में अधिग्रहीत गुर्दे की छवियों पर लागू होता है, जिससे प्रत्येक व्यक्ति की छवि के मैनुअल एनोटेशन की आवश्यकता कम हो जाती है। प्रशिक्षित वेका विभाजन की अनुकूलनशीलता को प्रायोगिक मुरीन एंटी-एमपीओ ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस (जीएन) से गुर्दे के ऊतकों में आगे प्रदर्शित किया जाता है, ताकि एनईटीएस और ईसीएमओ की पहचान की जा सके, जो एमपीओ जीएन के लिए सामान्य रोग योगदानकर्ता हैं। यह विधि गुर्दे के ऊतकों में ecDNA का उद्देश्य विश्लेषण प्रदान करती है जो स्पष्ट रूप से प्रभावकारिता को दर्शाती है जिसमें प्रशिक्षित वेका विभाजन कार्यक्रम स्वस्थ सामान्य गुर्दे के ऊतकों और रोगग्रस्त गुर्दे के ऊतकों के बीच ecDNA को अलग कर सकता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य अंगों में ECDNA, NETs और ecMPO की पहचान करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

ये छवियां प्रेरित एंटी-एमपीओ जीएन के साथ माउस से फ्लोरोसेंटली दाग एफएफपीई किडनी ऊतक में ecDNA के श्रम-गहन मैनुअल माप को कम करने के लिए प्रशिक्षित वेका सेगमेंटेशन का सफलतापूर्वक उपयोग करने के ...

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Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

सेल डेथ के दौरान जारी एक्स्ट्रासेलुलर डीएनए (ecDNA) प्रोमिनेमेटरी है और सूजन में योगदान देता है। चोट की साइट पर ecDNA की माप लक्ष्य अंग में चिकित्सीय उपचार की प्रभावकारिता निर्धारित कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल गुर्दे के ऊतकों में ecDNA के माप को स्वचालित करने के लिए एक मशीन लर्निंग टूल के उपयोग का वर्णन करता है।

ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस में एक्स्ट्रासेलुलर डीएनए के अर्ध-क्वांटिफिकेशन के लिए पर्यवेक्षित मशीन लर्निंग

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस काफी सेल डेथ और एक्सपेरिमेंटल डीएनए रिलीज के साथ पैथोलॉजिकल ग्लोमेरुलर चोट का कारण बनता है। यह प्रोटोकॉल रोग चोट के दौरान रिलीज की साइट पर बाहुलीय डीएनए के दृश्य को सक्षम बनाता है। इस तकनीक का फायदा यह है कि यह किडनी में सेल डेथ से एक्स्ट्रासेलुलर डीएनए को मापता है।सीरम या मूत्र के विपरीत, बाहेल डीएनए माप रोग क्षति के लिए एक सरोगेट मार्कर है। इस विधि का महत्व यह है कि दोनों बाह्य डीएनए धुंधला और छवि विश्लेषण आसानी से गठिया और ल्यूपस जैसे अन्य ऑटोइम्यून रोगों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं । इस विधि के लिए किडनी हिसलोलॉजी की बुनियादी जानकारी की जरूरत होती है।ग्लोमरुलर एक्सेरसेलर डीएनए का सही पता लगाने में सक्षम बनाने के लिए, शोधकर्ता को ग्लोमेरुली की सही पहचान करने में सक्षम होना चाहिए। एक्स्ट्रासेलुलर डीएनए धुंधला के लिए, पहले एक धुएं हुड में सॉल्वेंट के २ ४० मिनट के परिवर्तन में स्लाइड विसर्जित करने से पहले ६० मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस में एक स्लाइड रैक में ब्याज के नमूनों को गर्म करें । दूसरे विसर्जन के बाद नमूनों को 100 प्रतिशत इथेनॉल में दो बार और एक बार 70 प्रतिशत इथेनॉल में पांच मिनट प्रति उपचार के लिए रीहाइड्रेट करें।अंतिम उपचार के बाद, स्लाइड को उबलते एंटीजन रिट्रीवल में 10 मिनट के लिए उच्च पर प्रेशर कुकर में रखने के लिए चिमटे का उपयोग करें। एंटीजन एपिटोप्स को अनमास्क करने के बाद, गर्मी से प्रेशर कुकर को सिंक में स्थानांतरित करें और तुरंत ढक्कन के ऊपर ठंडा नल का पानी चलाएं। स्लाइड्स प्रति वॉश पांच मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर ०.०१ मोलर PBS में दो बार नमूनों को धोने से पहले एंटीजन रिट्रीवल समाधान में 20 मिनट के लिए संतुलन की अनुमति दें ।दूसरे धोने के बाद, गुर्दे के ऊतकों के नमूनों के चारों ओर हलकों को आकर्षित करने के लिए हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन में 10% चिकन सीरम के 60 माइक्रोलीटर के साथ किसी भी गैर-विशिष्ट धुंधला को अवरुद्ध करें। इनक्यूबेशन के अंत में, ध्यान से चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक आर्द्रता कक्ष में ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के ६० माइक्रोलीटर के साथ अवरुद्ध समाधान की जगह । अगली सुबह, पीबीएस में एक कक्षीय शेखर पर स्लाइड धोने के लिए प्रति धोने के लिए एक उपयुक्त फ्लोरोफोर के ६० माइक्रोलीटर जोड़ने से पहले कमरे के तापमान पर एक ४० मिनट की इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक स्लाइड के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी ।इनक्यूबेशन के अंत में, PBS में स्लाइड धोने के रूप में प्रदर्शन किया, 70% इथेनॉल में 0.3% सूडान काले में उपचार के बाद किसी भी संभावित फॉर्मेलिन प्रेरित ऑटोफ्लोरेसेंस बुझाने के लिए। 30 मिनट के बाद, किसी भी तेज़ को दूर करने के लिए नल के पानी में स्लाइड धोएं और किसी भी आगे सूडान काले तेज़ गठन को रोकने के लिए 10 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड विसर्जित करें। इनक्यूबेशन के अंत में, स्लाइड को कॉन्फोकल ग्लास कवरलिप पर माउंट करें जिसमें दापी के साथ पूरक बढ़ते समाधान की तीन 60 माइक्रोलीटर बूंदें हैं और नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करें।स्लाइड्स में कमरे के तापमान पर 24 घंटे इलाज की अनुमति दें। मानक प्रोटोकॉल के अनुसार कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग तक प्रकाश से संरक्षित चार डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर करें। इमेजिंग के दौरान किसी भी आंदोलन को रोकने के लिए नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करना सुनिश्चित करें और इमेजिंग संकल्प को बढ़ाने के लिए इथेनॉल के कवरस्लिप को साफ करें।इमेजिंग के बाद 20 glomeruli प्रति स्लाइड, ImageJ में प्रशिक्षित Weka खंडीकरण प्लगइन खोलें और ImageJ टूलबार पर पहली छवि छोड़ दें। इमेज, कलर और स्प्लिट चैनल्स पर क्लिक करें। प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला दिखाने वाली छवि दिखाई देगी।एकल छवियों की एक विलय फ़ाइल बनाने के लिए, रंग पर क्लिक करें और चैनलों को मर्ज करें। एक पॉपअप बॉक्स प्रत्येक चैनल को सौंपे जाने वाले रंग की मांग करता दिखाई देगा। समग्र बनाएं और स्रोत छवियों बक्से रखने के लिए और ठीक क्लिक करें। एक विलय समग्र छवि दिखाई देगी।एक गाइड के रूप में प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग करना, चमकदार गुच्छा के आसपास ब्याज का एक क्षेत्र आकर्षित । एकल नीले DAPI छवि, क्लिक प्रक्रिया, फिल्टर, और गॉसियन धुंधला पर एक गॉसियन धुंधला प्रदर्शन करने के लिए। एक से दो पर धुंधला सेट करें।छवि थोड़ी धुंधली हो जाएगी, लेकिन नाभिक चिकनी दिखाई देगा, पृष्ठभूमि नरम हो जाएगी। इसके बाद, प्लगइन्स, सेगमेंटेशन और ट्रेनेबल वेका सेगमेंटेशन पर क्लिक करें, और बरकरार नाभिक का पता लगाने के लिए फ्री हैंड टूल का उपयोग करें। जब ब्याज के नाभिक के सभी जोड़ा गया है, वर्ग एक बॉक्स जोड़ें, लाइन उपकरण का उपयोग करने के लिए कक्षा दो बॉक्स के लिए पृष्ठभूमि के क्षेत्रों चित्रित ।क्लिक करें नई कक्षा बनाने के लिए और DAPI दाग एक्स्ट्रान्यूक्लियर डीएनए की रूपरेखा के लिए लाइन उपकरण का उपयोग करें । क्लिक करें ट्रेन क्लासिफायर और संभावना मिलता है। सफेद में हाइलाइट किए गए चयन की वस्तु के साथ सभी घटकों की एक काली और सफेद छवि प्राप्त करने के लिए माउस को टॉगल करें।इस इमेज को डुप्लिकेट करने के लिए इमेज और डुप्लीकेट पर क्लिक करें। छवि के तहत, समायोजित करें और सीमा से। सीमा को समायोजित करने के लिए माउस बटन का उपयोग करें जब तक कि केवल बाहुलर डीएनए मनाया न जाए।थ्रेसहोल्ड करने के बाद, प्रक्रिया पर क्लिक करें, बाइनरी करें, और बाइनरी बनाएं, और ब्याज के पहले से उत्पन्न ग्लोमेरुलर क्षेत्र को कॉपी करें। चयन को बहाल करने के लिए संपादित, चयन और बहाल करने के लिए प्रेस नियंत्रण शिफ्ट ई। ग्लोमेरुलस के भीतर केवल बाह्य डीएनए कणों को मापने के लिए, कणों का विश्लेषण करने और ठीक क्लिक करें। एक परिणाम शीट जिसमें कणों की संख्या, क्षेत्र, औसत पिक्सल और एक्सट्रासेलुलर डीएनए युक्त ग्लोमेरुली का प्रतिशत दिखाई देगा।क्लासिफायर को एक्स्ट्रासेलुलर डीएनए क्लासिफायर के रूप में बचाने के लिए, क्लासिफायर को सेव करने और डेटा को सहेजने पर क्लिक करें। बाद की छवियों के लिए मॉडल को फिर से लागू करने के लिए, लोड क्लासिफायर और सहेजे गए क्लासिफायर फ़ाइल का चयन करने से पहले प्रदर्शन के अनुसार प्रारंभिक छवि प्रसंस्करण को दोहराएं। लॉग मेनू पॉप अप और मॉडल चलेंगे।एक बार मॉडल चलने के बाद, लोड डेटा पर क्लिक करें और extracellularDNA.arff का चयन करें। इसके बाद रिजल्ट बनाने पर क्लिक करें। यदि परिणामस्वरूप छवि सभी नाभिक, पृष्ठभूमि, या बाहेल डीएनए लेने में विफल रही है, तो क्लासिफायर को फिर से प्रशिक्षित करने और आवश्यक के रूप में अधिक क्लासिफायर जोड़ने पर क्लिक करें।यहां, प्रतिनिधि डीएनए और बीटा ऐक्टिन धुंधला दिखा एकल चैनल छवियों को दिखाया गया है । दो छवियों को विलय करने से माउस किडनी ग्लोमेरुली के भीतर बाह्य डीएनए के माप के लिए ग्लोमेरुलर क्षेत्र के चारों ओर रुचि के क्षेत्र को तैयार करने की अनुमति देता है। इस मॉडल को एक नियंत्रण रोगी से गुर्दे की बायोप्सी नमूनों में बाह्य कोशिकीय डीएनए की पहचान करने या myeloperoxidase ANCA से जुड़े वाक्यूलाइटिस के साथ एक मरीज से गुर्दे की बायोप्सी की तुलना करने के लिए अपनाया जा सकता है ।इसके अलावा, इस कार्यक्रम को गुर्दे के ऊतकों के नमूनों के भीतर अन्य दागों में अनुवाद किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर जाल के लिए दाग और एएनसीए से जुड़े वास्कुलाइटिस में एक्सट्रासेलुलर माइलोप्रोक्सिडेस का जमाव। महत्वपूर्ण बात यह है कि जब एक ही डेटा का विश्लेषण कई उपयोगकर्ताओं द्वारा किया जाता है तो कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा जाता है। विश्लेषण का सबसे महत्वपूर्ण कदम वेका सेगमेंटेशन कार्यक्रम से सीखने के लिए क्लासिफायर के रूप में ग्लोमेरुली के साथ पृष्ठभूमि, नाभिक और बाहेल डीएनए के पर्याप्त उदाहरण प्रदान कर रहा है।यह विधि आसानी से हस्तांतरणीय है। उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रकार की सेल मृत्यु के आगे विश्लेषण की जांच एपोप्टोसिस या नेक्रोसिस के लिए मार्कर के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए धुंधला के माध्यम से की जा सकती है। हमारी तकनीक का उपयोग अन्य भड़काऊ प्रक्रियाओं जैसे ऑटोइम्यून किडनी रोग में टीएलआर अभिव्यक्ति का आकलन करना या मानव गुर्दे की बायोप्सी में एक्सट्रासेलुलर माइलोप्रोक्सिडास अभिव्यक्ति के साथ किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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