Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Riconosciamo Monash Micro Imaging per l'uso del microscopio a scansione laser confocale confocale Nikon C1 e della piattaforma monash Histologia per la lavorazione del tessuto renale.

Questo metodo consente il rilevamento di pan ecDNA da tutte le forme di morte cellulare. Lo stesso metodo e gli anticorpi sono utilizzati per il tessuto di biopsia renale umana (dal punto 4). Tutti i soggetti animali e umani hanno avuto l'approvazione etica dalla Monash University, e Monash Health, Clayton, Victoria, Australia.
1. Colorazione per l'ecDNA con DAPI e
<ol><li>Indurre un modello di 20 giorni di anti-mieloperoxidase glomerulofritis (anti-MPO-GN) in 8-10 settimana vecchi topi C57/...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection.">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+the+significance+of+apoptosis.">Cell death: the significance of apoptosis.</a> International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).</li><li>Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+one+way+to+die:+apoptosis,+necrosis+and+reactive+oxygen+damage.">More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage.</a> Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).</li><li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+its+role+in+inflammation.">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

Esistono diversi protocolli che misurano marcatori infiammatori nel siero e nelle urine di entrambi i pazienti e modelli murini di glomerulonephritis. Questo protocollo descritto consente l'analisi dei prodotti di morte cellulare (ecDNA, NET ed ecMPO) all'interno del glomerulus direttamente. I passaggi più importanti in questo protocollo sono la preparazione e l'imaging dei tessuti. Il principale elemento restrittivo dell'uso di un metodo di colorazione fluorescente per l'analisi è l'autofluorescenza del tessuto. Il te...

La mieloperossia anti-neutrofila anticorpo associato all'anticorpo (MPO-AAV) è una malattia autoimmune che si traduce in insufficienza renale da lesioni glomeriula patologiche con notevole morte cellulare e rilascio di acido deossiribonucleico (DNA)1,2. Il DNA può attivare il sistema immunitario agendo come un segnale di pericolo. In condizioni di salute normali, la posizione nucleare del DNA offre protezione dall'esposizione al sistema immunitario. L'autoDNA che viene rilasciato extracellulare durante i processi patogeni o l'autoimmunità è visto dal sistema immunitario come un potente danno proinfiammatorio associato all'autoproteina molecolare (DAMP)3. Il DNA extra cellulare (ecDNA) viene rilasciato dalle cellule morenti attraverso diversi meccanismi distinti che sono governati da vie biochimiche distinte, come l'apoptosi, la formazione di trapeextra extracellulari di necroptosi neutrosi(NET), necrosi o piroptosi4,5,6,7.8
In questo articolo vengono descritti i metodi per macchiare e misurare l'ecDNA rilasciato dalle cellule morenti in sezioni di reni formalina fixed paraffina incorporata (FFPE) da biopsie sperimentali anti-MPO GN e renali di pazienti con MPO-AAV9,10. Esistono diversi metodi per la rilevazione di DNA a doppio filamento circolante (dsDNA) e complessi di DNA sia da siero che da urina e da analisi in vitro11,12. Questi metodi, sebbene accurati nel determinare la quantità di ecDNA, non determinano dove l'ecDNA viene rilasciato anatomicamente. Ci sono metodi che descrivono la misurazione specifica dell'ecDNA come il tunel per l'apoptosi e la misurazione dei detriti cellulari13,14. Non esiste un metodo che descriva la misurazione dell'ecDNA culminato da tutte le forme di morte cellulare nei reni FFPE dove si verifica il danno patologico. Questo è importante per determinare se i trattamenti terapeutici sperimentali stanno cancellando l'ecDNA dai siti di lesione patologica nell'organo bersaglio effettivo.
L'acquisizione di più immagini da campioni di rene crea un volume elevato di dati che viene analizzato comunemente da un singolo utente. Questo è laborioso, richiede tempo e può essere soggetto a riproducibilità inaffidabile da parte di altri utenti, a causa di pregiudizi dell'utente. Trainable Weka segmentation è un plugin software open source per ImageJ che utilizza strumenti bioinformatici all'avanguardia per classificare i pixel utilizzando algoritmi di apprendimento automatico15,16. Questo metodo è "trainabile" per cui apprende dalla classificazione dell'utente dei segmenti di pixel e applica la nuova classificazione appresa ad altre immagini. Questo metodo si basa su strumenti di analisi comuni all'interno del programma ImageJ che vengono utilizzati per "classificare" ogni pixel in un segmento come appartenente a una "classe" specifica. Una volta che il programma apprende i "classificatori", possono essere utilizzati per identificare altri segmenti classificati simili all'interno della stessa immagine. Questo modello viene quindi salvato e applicato ad altri set di immagini all'interno dello stesso esperimento.
Gli ostacoli attuali alla determinazione dell'ecDNA in situ nelle sezioni renali sono l'autofluorescenza endogena dalla fissazione nella formalina e l'analisi laboriosa delle immagini. Qui descriviamo come eseguire l'uso di questa autofluorescenza, rilevare l'ecDNA e usare l'apprendimento automatico supervisionato per la misurazione ad alta velocità effettiva dell'ecDNA. Abbiamo precedentemente pubblicato la misurazione di NET e MPO extracellulare (ecMPO) utilizzando una macro in ImageJ, ora dimostriamo la semi-automazione di questi metodi utilizzando l'apprendimento automatico supervisionato1. Dimostriamo l'adattabilità dello strumento di apprendimento automatico, per classificare una macchia alternativa per NET ed ecMPO all'interno della stessa immagine. Questi metodi di colorazione descritti qui per rilevare ecDNA, NET ed ecMPO possono essere tradotti in altri organi solidi e malattie in cui ecDNA, NETS ed ecMPO svolge un ruolo nel perpetuare malattie come l'artrite reumatoide e il lupus17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

La morte delle cellule glomeriari è una caratteristica patologica della mieloperossia anti-neutrofia anticorpo associato all'anticorpo (MPO-AAV). L'acido deossiribonucleico extracellulare (ecDNA) viene rilasciato durante diverse forme di morte cellulare, tra cui apoptosi, necrosi, necrotosi, trappole extracellulari neutrofiche (NET) e piroptosi. La misurazione di questa morte cellulare richiede molto tempo con diversi biomarcatori necessari per identificare le diverse forme biochimiche di morte cellulare. La misurazione dell'ecDNA è generalmente condotta nel siero e nelle urine come surrogato per danni renali, non nell'organo bersaglio effettivo in cui si verifica la lesione patologica. L'attuale difficoltà nello studio dell'ecDNA nel rene è la mancanza di metodi per formalina tessuto incorporato di paraffina fissa (FFPE) sia sperimentalmente che in biopsie renali umane archiviate. Questo protocollo fornisce un riepilogo dei passaggi necessari per macchiare l'ecDNA nel tessuto FFPE (sia umano che murino), dissetare l'autofluorescenza e misurare l'ecDNA nelle immagini risultanti utilizzando uno strumento di apprendimento automatico dal plugin Weka addestrabile a livello di immagine pubblicamente disponibile. La segmentazione Weka addestrabile viene applicata all'ecDNA all'interno del glomeruli dove il programma impara a classificare l'ecDNA. Questo classificatore viene applicato alle successive immagini renali acquisite, riducendo la necessità di annotazioni manuali di ogni singola immagine. L'adattabilità della segmentazione trainabile di Weka è ulteriormente dimostrata nel tessuto renale da glomerulofoftite sperimentale (GN), per identificare NET ed ecMPO, contributori patologici comuni all'anti-MPO GN. Questo metodo fornisce un'analisi oggettiva dell'ecDNA nel tessuto renale che dimostra chiaramente l'efficacia in cui il programma di segmentazione Weka trainingable può distinguere l'ecDNA tra tessuto renale normale sano e tessuto renale malato. Questo protocollo può essere facilmente adattato per identificare ecDNA, NET ed ecMPO in altri organi.

Queste immagini rappresentano i molteplici passaggi necessari per utilizzare con successo la segmentazione Weka addestrabile per ridurre al minimo la misurazione manuale ad alta intensità di lavoro dell'ecDNA nel tessuto renale FFPE color acquaescente da un topo con anti-MPO GN indotta. Questi passaggi sono riepilogati in Figura 1 e Figura 2 con le immagini prese direttamente dal programma di segmentazione Weka, delineando ogni ...

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Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Il DNA extracellulare (ecDNA) rilasciato durante la morte cellulare è infiammatorio e contribuisce all'infiammazione. La misurazione dell'ecDNA nel sito della lesione può determinare l'efficacia del trattamento terapeutico nell'organo bersaglio. Questo protocollo descrive l'uso di uno strumento di apprendimento automatico per automatizzare la misurazione dell'ecDNA nel tessuto renale.

Apprendimento automatico supervisionato per la semi-quantificazione del DNA extracellulare in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

La glomerulonefrite provoca lesioni glomerulari patologiche con una notevole morte cellulare e rilascio di DNA extracellulare. Questo protocollo consente la visualizzazione del DNA extracellulare nel sito di rilascio durante la lesione patologica. Il vantaggio di questa tecnica è che misura il DNA extracellulare dalla morte cellulare nel rene.Al contrario del siero o dell'urina, la misurazione extracellulare del DNA è un marcatore surrogato per danni patologici. Il significato di questo metodo è che sia la colorazione extracellulare del DNA che l'analisi delle immagini sono facilmente trasferibili ad altre malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide e il lupus. Questo metodo richiede una conoscenza di base dell'istologia renale.Per consentire il rilevamento accurato del DNA extracellulare glomerulare, il ricercatore deve essere in grado di identificare correttamente i glomeruli. Per la colorazione extracellulare del DNA, riscaldare prima i campioni di interesse in una griglia a 60 gradi Celsius per 60 minuti prima di immergere le diapositive in due cambi di solvente di 40 minuti in una cappa aspirante. Dopo la seconda immersione, reidratare i campioni due volte in etanolo al 100% e una volta al 70% di etanolo per cinque minuti per trattamento.Dopo l'ultimo trattamento, utilizzare le pinng per posizionare le diapositive in una soluzione di recupero dell'antigene bollente in una pentola a pressione alta per 10 minuti. Dopo aver smascherato gli epitopi dell'antigene, trasferire la pentola a pressione dal fuoco in un lavandino e eseguire immediatamente acqua fredda del rubinetto sul coperchio. Lasciare equilibrare le diapositive per 20 minuti nella soluzione di recupero dell'antigene prima di lavare i campioni due volte in PBS molare 0,01 su uno shaker orbitale per cinque minuti per lavaggio.Dopo il secondo lavaggio, utilizzare una penna idrofobica per disegnare cerchi attorno ai campioni di tessuto renale e bloccare qualsiasi colorazione aspecifica con 60 microlitri di siero di pollo al 10% nell'albumina del siero bovino al 5% per 30 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, sostituire con cura la soluzione di blocco con 60 microlitri dell'anticorpo primario di interesse in una camera di umidità durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, lavare le diapositive su uno shaker orbitale in PBS per due minuti per lavaggio prima di aggiungere 60 microlitri di un anticorpo secondario coniugato al fluoroforo appropriato ad ogni diapositiva per un'incubazione di 40 minuti a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, lavare le diapositive in PBS come dimostrato, seguito da un trattamento in nero 0,3% Sudan nel 70%etanolo per spegnere qualsiasi potenziale autofluorescenza indotta da formalina. Dopo 30 minuti, lavare gli scivoli in acqua del rubinetto per rimuovere qualsiasi precipitato e immergere gli scivoli in PBS per 10 minuti per evitare ulteriori formazioni di precipitato nero del Sudan. Al termine dell'incubazione, montare i vetrini su coverlips in vetro confocale con tre gocce da 60 microliter di soluzione di montaggio integrate con DAPI e sigillare i copripacchi con smalto per unghie.Lasciare che le diapositive si curino per 24 ore a temperatura ambiente. Conservarli a quattro gradi Celsius protetti dalla luce fino all'imaging mediante microscopia a scansione laser confocale secondo protocolli standard. Assicurarsi di sigillare i copricapo con smalto per evitare qualsiasi movimento durante l'imaging e di pulire i copricapo di etanolo per migliorare la risoluzione di imaging.Dopo aver imaging di 20 glomeruli per diapositiva, apri il plug-in Segmentazione Weka addestrabile in ImageJ e rilascia la prima immagine sulla barra degli strumenti ImageJ. Fare clic su immagine, colore e canali divisi. Apparirà un'immagine che mostra la colorazione degli anticorpi primari.Per creare un file unito delle singole immagini, fare clic su colora e unisci canali. Apparirà una casella popup che richiede l'assegnazione di un colore a ciascun canale. Selezionare le caselle crea composito e mantieni immagini di origine e fare clic su OK. Verrà visualizzata un'immagine composita unita.Usando la colorazione dell'anticorpo primario come guida, disegna una regione di interesse intorno al ciuffo glomerulare. Per eseguire una sfocatura gaussiana sulla singola immagine DAPI blu, fate clic su processo, filtri e sfocatura gaussiana. Impostare la sfocatura su uno a due.L'immagine diventerà un po 'sfocata, ma i nuclei appariranno lisci, lo sfondo sarà ammorbidito. Quindi, fai clic su plugin, segmentazione e segmentazione Weka addestrabile e usa lo strumento mano libera per tracciare i nuclei intatti. Una volta aggiunti tutti i nuclei di interesse, la casella aggiungi classe uno, usa lo strumento linea per delineare le aree di sfondo nella casella della classe due.Fate clic su crea nuova classe (Create New Class) e utilizzate lo strumento linea per delineare il DNA extranucleare macchiato di DAPI. Fare clic su addestra classificatore e ottenere probabilità. Attivare o disattivare il mouse per ottenere un'immagine in bianco e nero di tutti i componenti con l'oggetto di selezione evidenziato in bianco.Per duplicare l'immagine, fare clic su immagine e duplicare. Sotto l'immagine, regola e soglia. Utilizzare il pulsante del mouse per regolare la soglia fino a quando non viene osservato solo il DNA extracellulare.Dopo la soglia, fare clic su processo, binario e rendere binario e copiare l'area di interesse glomerulare generata in precedenza. Premere CTRL E per selezionare modifica, selezioni e ripristino per ripristinare la selezione. Per misurare solo le particelle di DNA extracellulari all'interno del glomerulus, fare clic su analizza particelle e OK. Verrà generato un foglio dei risultati che mostra il numero di particelle, l'area, i pixel medi e la percentuale di glomeruli contenenti DNA extracellulare.Per salvare il classificatore come classificatore di DNA extracellulare, fare clic su salva classificatore e salvare i dati. Per riapplicare il modello alle immagini successive, ripetere l'elaborazione iniziale dell'immagine come illustrato prima di selezionare il classificatore di carico e il file classificatore salvato. Verrà visualizzato il menu di registro che eseguirà il modello.Una volta eseguito il modello, fare clic su carica dati e selezionare extracellularDNA.arff. Quindi fare clic su Crea risultato. Se l'immagine risultante non è riuscita a raccogliere tutti i nuclei, lo sfondo o il DNA extracellulare, fare clic su Riqualifica classificatore e aggiungere altri classificatori, se necessario.Qui vengono mostrate immagini a canale singolo che mostrano dna rappresentativo e colorazione beta actin. La fusione delle due immagini consente di disegnare una regione di interesse attorno all'area glomerulare per la misurazione del DNA extracellulare all'interno dei glomeruli renali del topo usando la segmentazione Weka addestrabile come dimostrato. Questo modello può essere adottato per identificare il DNA extracellulare nei campioni di biopsia renale da un paziente di controllo o rispetto a quello di una biopsia renale da un paziente con vasculite associata all'ANCA mieloperossidasi.Inoltre, questo programma può essere tradotto in altre macchie all'interno di campioni di tessuto renale, ad esempio, per macchiare per trappole extracellulari neutrofile e la deposizione di mieloperossidasi extracellulare nella vasculite associata all'ANCA. È importante sottolineare che non si osservano differenze significative quando gli stessi dati vengono analizzati da più utenti. Il passo più critico dell'analisi è fornire abbastanza esempi di background, nuclei e DNA extracellulare con glomeruli come classificatori da cui il programma di segmentazione Weka può imparare.Questo metodo è facilmente trasferibile. Ad esempio, un'ulteriore analisi dei diversi tipi di morte cellulare può essere studiata attraverso la colorazione di anticorpi specifici contro marcatori per apoptosi o necrosi. La nostra tecnica può essere utilizzata con altri processi infiammatori come la valutazione dell'espressione della TLR nella malattia renale autoimmune o l'espressione mieloperossidasi extracellulare nelle biopsie renali umane.

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