Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

우리는 니콘 C1 직립 공초점 레이저 스캐닝 현미경과 신장 조직의 처리를위한 모나시 조직학 플랫폼의 사용에 대한 모나시 마이크로 이미징을 인정합니다.

이 방법은 모든 형태의 세포 사멸에서 pan ecDNA를 검출할 수 있게 합니다. 동일한 방법 및 항체는 인간 신장 생검 조직 (4 단계에서)에 사용됩니다. 모든 동물 과목은 모나쉬 대학과 모나시 건강, 클레이튼, 빅토리아, 호주에서 윤리 승인을 받았습니다.
1. DAPI 및 β 액틴으로 ecDNA 염색
<ol><li>8-10주 된 C57/Bl6 마우스에서 항골엽수시다스(anti-MPO-GN)의 20일 모델을 유도하여<sup class="xref...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

구종염의 환자 및 마우스 모델 모두의 혈청 및 소변에서 염증 성 마커를 측정하는 다중 프로토콜이 존재합니다. 이 설명된 프로토콜은 사구체 내세포사(ecDNA, NETs 및 ecMPO)의 제품을 직접 분석할 수 있게 한다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 조직 준비 및 이미징입니다. 분석을 위한 형광 염색 방법을 사용하는 주요 제한 요소는 조직 자가형광입니다. 포르말린 고정 파라핀 조직은 특정 형광 ?...

골수페록시다아제 항호성 세포질항체 관련 혈관염(MPO-AAV)은 상당한 세포 사멸과 탈옥리보핵산(DNA)1,,2의방출로 병리학적 사구체 손상으로부터 신부전을 초래하는 자가면역 질환이다. DNA는 위험 신호로 작용하여 면역 계통을 활성화할 수 있습니다. 정상적인 건강 한 조건에서, DNA의 핵 위치는 면역 체계에 노출에서 보호를 제공. 병원성 과정 또는 자가면역 중에 세포외적으로 방출되는 자가 DNA는 면역 계통에 의해 강력한 염증 손상과 관련된 분자 자가 단백질(DAMP) 3으로 볼 수있다. 엑스트라 세포 DNA(ecDNA)는 세포 사멸, 네크로토시스 호중구 세포 외 트랩 형성 (NETs), 괴사 또는 발열체44, 5,56,6,7,,8과같은 뚜렷한 생화학적 경로에 의해 조절되는 몇 가지 뚜렷한 메커니즘을 통해 죽어가는 세포에서 방출된다.
본 명세서에서는 MPO-AAV9,,10을가진 환자로부터 실험적인 항MPO GN 및 신장 생검으로부터 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 신장의 섹션에서 죽어가는 세포로부터 방출되는 ecDNA를 염색하고 측정하는 방법을 설명한다. 혈청과 소변 모두에서 이중 좌초 DNA(dsDNA) 및 DNA 복합체를 순환하는 검출을 위한 여러 가지 방법이 존재하며, 체외 내검사서(11,,12)에서존재한다. 이러한 방법은 ecDNA의 양을 결정하는 데 정확하지만 ecDNA가 해부학적으로 방출되는 위치를 결정하지 는 않습니다. 세포 사멸을 위한 튜클과 같은 ecDNA의 특정 측정을 기술하고 세포이물질(13,,14)의측정을 설명하는 방법이 있다. 병리학적 손상이 발생하는 FFPE 신장의 모든 형태의 세포 사멸에서 절정에 달하는 ecDNA를 측정하는 방법을 설명하는 방법은 없습니다. 이것은 실험적인 치료 처리가 실제 표적 기관에 있는 병리학적인 상해의 사이트에서 ecDNA를 지우는지 결정하는 것이 중요합니다.
신장 샘플에서 여러 이미지를 수집하면 단일 사용자가 일반적으로 분석하는 대량의 데이터가 생성됩니다. 이는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 사용자 편향으로 인해 다른 사용자가 신뢰할 수 없는 재현성을 받을 수 있습니다. Trainable Weka 세분화는 최첨단 생물정보 도구를 사용하여 기계 학습 알고리즘15,,16을사용하여 픽셀을 분류하는 ImageJ용 오픈 소스 소프트웨어 플러그인입니다. 이 메서드는 픽셀 세그먼트의 사용자 분류에서 학습 하 고 다른 이미지에 새로운 학습 분류를 적용 하는 "교육 가능". 이 메서드는 세그먼트의 각 픽셀을 특정 "클래스"에 속하는 것으로 "분류"하는 데 사용되는 ImageJ 프로그램 내의 일반적인 분석 도구에 의존합니다. 프로그램이 "분류자"를 알게 되면 동일한 이미지 내에서 다른 유사한 분류 세그먼트를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 이 모델을 저장하여 동일한 실험 내의 다른 이미지 집합에 적용됩니다.
신장 단면도에서 ecDNA를 결정하는 현재 장애물은 포르말린의 고정및 심상에 있는 노동 집약적인 분석에서 내인성 자동 형광입니다. 우리는 이 자동 형광을 담금질하고, ecDNA를 검출하고, ecDNA의 높은 처리량 측정을 위해 감독된 기계 학습을 사용하는 방법을 여기에서 설명합니다. 우리는 이전에 ImageJ에서 매크로를 사용하여 NET및 세포 외 MPO (ecMPO)의 측정을 발표했습니다, 우리는 지금 감독 기계 학습1을사용하여 이러한 방법의 반 자동화를 시연한다. 우리는 동일한 이미지 내에서 NET 및 ecMPO에 대한 대체 얼룩을 분류하기 위해 기계 학습 도구의 적응성을 보여줍니다. ecDNA, NET및 ecMPO를 검출하기 위해 여기에 기재된 이러한 염색 방법은 ecDNA, NETS 및 ecMPO가 류마티스 관절염 및 루푸스17,,18과같은 질병을 영속시키는 데 중요한 역할을 하는 다른 고체 장기 및 질병으로 번역될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

구체 세포 사멸은 골수퍼록시다제 항 호중구 세포질 항체 관련 혈관염(MPO-AAV)의 병리학적 특징이다. 세포외 탈옥리보핵산(ecDNA)은 세포사멸, 괴사, 네크로토시스, 호중구 세포외 함정(NETs) 및 파이롭토시스를 포함한 다양한 형태의 세포 사멸 중에 방출된다. 이 세포 죽음의 측정은 세포 사멸의 다른 생화확적인 양식을 확인하는 데 필요한 몇몇 다른 biomarkers와 함께 시간이 많이 걸립니다. ecDNA의 측정은 일반적으로 병리학적 상해가 발생하는 실제 표적 기관이 아닌 신장 손상에 대한 대리로서 혈청 및 소변에서 수행됩니다. 신장에서 ecDNA를 조사하는 현재 어려움은 실험적으로 그리고 보관된 인간 신장 생검에서 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직 (FFPE)을 위한 방법의 부족입니다. 이 프로토콜은 FFPE 조직(인간과 뮤린 모두)에서 ecDNA에 대한 염색에 필요한 단계를 요약하여, 자동 불피를 해소하고 공개적으로 이용 가능한 오픈 소스 ImageJ 플러그인 Trainable Weka 세분화에서 기계 학습 도구를 사용하여 결과 이미지에서 ecDNA를 측정합니다. 훈련 가능한 Weka 세분화는 프로그램이 ecDNA를 분류하는 법을 배우는 글로메룰리 내의 ecDNA에 적용됩니다. 이 분류기는 후속 획득 신장 이미지에 적용되어 각 개별 이미지의 수동 주석이 필요하지 않습니다. 훈련 가능한 Weka 세분화의 적응성은 항MPO GN에 대한 일반적인 병리학 적 기여자 인 NETs 및 ecMPO를 식별하기 위해 실험적인 뮤린 항 MPO 구종염 (GN)에서 신장 조직에서 더 입증됩니다. 이 방법은 훈련 가능한 Weka 세분화 프로그램이 건강한 정상 신장 조직과 병들인 신장 조직 사이 ecDNA를 구별할 수 있는 효험을 명확하게 보여주는 신장 조직에서 ecDNA의 객관적인 분석을 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 장기에서 ecDNA, NET 및 ecMPO를 식별하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.

이러한 이미지는 유도된 항MPO GN을 가진 마우스에서 형광 염색 된 FFPE 신장 조직에서 ecDNA의 노동 집약적 인 수동 측정을 최소화하기 위해 성공적으로 훈련 가능한 Weka 세분화를 사용하는 데 필요한 여러 단계를 나타냅니다. 이러한 단계는 그림 1 및 그림 2로 요약되어 있으며 Weka 세분화 프로그램에서 직접 촬영한 이미지가 분석 ...

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Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

세포 사멸 중에 방출되는 세포외 DNA(ecDNA)는 염증성 염증에 기여합니다. 상해 부위에서 ecDNA의 측정은 표적 기관에서 치료 치료의 효능을 결정할 수 있다. 이 프로토콜은 신장 조직에서 ecDNA의 측정을 자동화하기 위해 기계 학습 도구의 사용을 설명합니다.

글로메룰로네프염의 세포외 DNA의 반정화를 위한 감독된 기계 학습

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

구종염은 상당한 세포 죽음과 세포 외 DNA 방출을 가진 병리학적인 구체 상해를 일으키는 원인이 됩니다. 이 프로토콜은 병리학적 상해 도중 방출의 사이트에 세포외 DNA의 시각화를 가능하게 합니다. 이 기술의 장점은 신장에 있는 세포 죽음에서 세포 외 DNA를 측정한다는 것입니다.혈청이나 소변과는 달리 세포외 DNA 측정은 병리학적 손상을 위한 대리 마커입니다. 이 방법의 중요성은 세포외 DNA 염색 및 이미지 분석 모두 류마티스 관절염 및 루푸스와 같은 다른 자가 면역 질환으로 쉽게 전달될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 신장 조직학에 대한 기본적인 지식이 필요합니다.사구세포 DNA의 정확한 검출을 가능하게 하기 위하여는, 연구원은 정확하게 사구체를 식별할 수 있어야 합니다. 세포 외 DNA 염색의 경우, 먼저 60섭씨 60도의 슬라이드 랙에 관심있는 샘플을 가열한 후 연기 후드에 용매의 두 가지 40 분 변경에 슬라이드를 침지하십시오. 두 번째 침수 후, 시료를 100%에탄올로 2회, 70%에 탄올로 1회 재수화하여 치료당 5분간 재수화한다.마지막 치료 후 집게를 사용하여 슬라이드를 끓는 항원 검색 용액에 10 분 동안 높은 압력 밥솥에 넣습니다. 항원 전형의 마스킹을 해제한 후 압력 솥을 열에서 싱크대로 옮기고 뚜껑 위로 차가운 수돗물을 즉시 실행합니다. 슬라이드가 항원 검색 용액에서 20분 동안 평형화한 후 시료를 0.01 대구시 PBS에서 0.01 의 어금니 PBS로 2회 세척한 후 세척당 5분간 평형화할 수 있도록 한다.두 번째 세척 후, 소수성 펜을 사용하여 신장 조직 샘플 주위에 원을 그리고 실온에서 30 분 동안 5 %의 소 세럼 알부민에 10 %의 닭 세럼60 마이크로 리터로 비특이적 염색을 차단하십시오. 인큐베이션이 끝나면 블로킹 용액을 섭씨 4도에서 밤새 습도 챔버에 대한 관심있는 1 차 항체의 60 마이크로 리터로 조심스럽게 교체하십시오. 다음 날 아침, PBS의 궤도 셰이커에서 슬라이드를 세척당 2분 동안 세척한 후 각 슬라이드에 40분 간 배양할 수 있는 적절한 플루오로포어 의 마이크로리터 60마이크로리터를 추가합니다.인큐베이션의 끝에서, 입증된 바와 같이 PBS에서 슬라이드를 세척하고, 70%에탄올에서 0.3%의 수단 블랙으로 처리하여 잠재적인 포르말린 유도 자동 불광을 담금질한다. 30분 후, 슬라이드를 수돗물로 씻어 침전물을 제거하고 10분 동안 PBS에 슬라이드를 담그어 수단 의 검은 침전물을 더 이상 방지합니다. 인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 공초점 유리 커버립에 장착하여 DAPI로 보완된 장착 용액 30방울을 장착하고 매니큐어로 커버립을 밀봉합니다.슬라이드가 실온에서 24시간 동안 치료하도록 허용합니다. 표준 프로토콜에 따라 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법에 의해 이미징될 때까지 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 보관하십시오. 이미징 중 의 움직임을 방지하고 이미징 해상도를 향상시키기 위해 에탄올의 커버립을 청소하기 위해 매니큐어로 커버립을 밀봉해야합니다.슬라이드 당 20 glomeruli 이미징 후 ImageJ에서 기차 가 가능한 Weka 세분화 플러그인을 열고 첫 번째 이미지를 ImageJ 도구 모음에 놓습니다. 이미지, 색상 및 분할 채널을 클릭합니다. 1차 항체 염색을 보여주는 이미지가 나타납니다.단일 이미지의 병합된 파일을 만들려면 색상을 클릭하고 채널을 병합합니다. 각 채널에 할당할 색상을 요청하는 팝업 상자가 나타납니다. 합성 만들기를 확인하고 소스 이미지 상자를 유지하고 확인을 클릭합니다. 병합된 복합 이미지가 나타납니다.1 차적인 항체 염색을 가이드로 사용하여, 사구체 tuft 의 주위에 관심의 영역을 그립니다. 단일 파란색 DAPI 이미지에서 가우시안 블러를 수행하려면 프로세스, 필터 및 가우시안 흐림 효과를 클릭합니다. 흐림 효과를 1~2로 설정합니다.이미지는 약간 흐릿해지지만 핵이 매끄럽게 나타나고 배경이 부드러워집니다. 다음으로 플러그인, 세분화 및 훈련 가능한 Weka 세분화를 클릭하고 무료 핸드 도구를 사용하여 그대로 핵을 추적합니다. 관심있는 모든 핵이 추가되면 클래스 한 상자를 추가하여 라인 도구를 사용하여 배경 영역을 클래스 2 상자에 묘사합니다.새 클래스를 만들고 라인 도구를 사용하여 DAPI 염색 된 외핵 DNA를 간략하게 설명하십시오. 기차 분류기를 클릭하고 확률을 얻을. 마우스를 전환하여 선택 객체가 흰색으로 강조 표시된 모든 구성 요소의 흑백 이미지를 얻습니다.이 이미지를 복제하려면 이미지를 클릭하고 복제합니다. 이미지 에서 조정 및 임계값을 조정합니다. 마우스 버튼을 사용하여 세포외 DNA만 관찰될 때까지 임계값을 조정합니다.임계값을 설정한 후 프로세스, 이진 을 클릭하고 이진을 만들고 이전에 생성된 가상 영역을 복사합니다. 제어 Shift E를 눌러 선택 선택을 복원하고 복원합니다. 사구체 내의 세포외 DNA 입자만 측정하려면 입자 분석 및 확인을 클릭합니다. 세포외 DNA를 함유한 입자, 면적, 평균 픽셀 및 소구체의 수를 보여주는 결과 시트가 생성될 것이다.분류기를 세포외 DNA 분류자로 저장하려면 분류기를 저장하고 데이터를 저장합니다. 모델을 후속 이미지에 다시 적용하려면 로드 분류기 및 저장된 분류기 파일을 선택하기 전에 설명된 대로 초기 이미지 처리를 반복합니다. 로그 메뉴가 나타나 모델을 실행합니다.모델이 실행되면 로드 데이터를 클릭하고 셀룰러DNA.arff를 선택합니다. 그런 다음 결과 만들기를 클릭합니다. 결과 이미지가 모든 핵, 배경 또는 세포 외 DNA를 선택하지 못한 경우 분류자를 다시 학습하고 필요에 따라 더 많은 분류기를 추가하십시오.여기서, 대표적인 DNA와 베타 액틴 염색을 보여주는 단일 채널 이미지가 표시됩니다. 두 개의 이미지를 병합하면 입증된 대로 훈련 가능한 Weka 세분화를 사용하여 마우스 신장 사구체 내의 세포외 DNA를 측정하기 위해 사구 체영역 주위에 관심 영역을 그릴 수 있습니다. 이 모형은 대조군 환자에게서 신장 생검 견본에 있는 세포외 DNA를 확인하기 위하여 채택될 수 있고 또는 myeloperoxidase ANCA 관련 혈관염을 가진 환자에게서 신장 생검의 비교.또한, 이 프로그램은 신장 조직 샘플 내의 다른 얼룩으로 번역될 수 있으며, 예를 들어, 중성구 세포 외 트랩및 ANCA 관련 혈관염에서 세포외 밀로페록시다제의 증착을 위해 얼룩으로 변환될 수 있다. 중요한 것은 여러 사용자가 동일한 데이터를 분석할 때 중요한 차이점은 관찰되지 않는다는 것입니다. 분석의 가장 중요한 단계는 Weka 세분화 프로그램에 대한 분류자로 구체와 배경, 핵 및 세포 외 DNA의 충분한 예를 제공하는 것입니다.이 방법은 쉽게 양도 할 수 있습니다. 예를 들어, 세포 사멸의 상이한 모형의 추가 분석은 세포사멸 또는 괴사에 대한 마커에 대하여 특정 항체를 위한 염색을 통해 조사될 수 있다. 우리의 기술은 인간 신장 생검에 있는 자가면역 신장 병 또는 세포외 myeloperoxidase 발현에 있는 TLR 발현을 평가하는 것과 같은 그밖 선동적인 프로세스와 함께 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

치과 바이오 필름에 세포 외 pH를 비례 영상

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

낮은 복사의 번호 통합된 바이러스 성 DNA 생체 외에서 B 형 간염 감염에 의해 형성 된

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...