Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Vi anerkjenner Monash Micro Imaging for bruk av Nikon C1 oppreist konfikal laserskanning mikroskop og Monash Histology Platform for behandling av nyrevev.

Denne metoden muliggjør deteksjon av pan ecDNA fra alle former for celledød. Den samme metoden og antistoffer brukes til humant nyrebiopsivev (fra trinn 4). Alle dyre- og menneskefag hadde etikkgodkjenning fra Monash University, og Monash Health, Clayton, Victoria, Australia.
1. Farging for ecDNA med DAPI og β-Actin
<ol><li>Indusere en 20 dagers modell av anti-myeloperoxidase glomerulonefritt (anti-MPO-GN) i 8-10 uker gamle C57/Bl6 mus, med kontroller9.<ol>
<li>Eut...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection.">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+the+significance+of+apoptosis.">Cell death: the significance of apoptosis.</a> International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).</li><li>Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+one+way+to+die:+apoptosis,+necrosis+and+reactive+oxygen+damage.">More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage.</a> Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).</li><li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+its+role+in+inflammation.">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

Det finnes flere protokoller som måler proinflammatoriske markører i serum og urin av både pasienter og musemodeller av glomerulonefritt. Denne beskrevne protokollen tillater analyse av produkter av celledød (ecDNA, NETs og ecMPO) i glomerulus direkte. De viktigste trinnene i denne protokollen er vevspreparatet og bildet. Det viktigste begrensende elementet ved å bruke en fluorescerende fargemetode for analyse er vevet autofluorescens. Formalin fast parafinvev er gjenstand for autofluorescens som kan skjule spesifik...

Myeloperoxidase anti nøytrofilt cytoplasmatisk antistoff assosiert vaskulitt (MPO-AAV) er en autoimmun sykdom som resulterer i nyresvikt fra patologisk glomerulær skade med betydelig celledød og frigjøring av deoksyribonuklesyre (DNA)1,2. DNA kan aktivere immunsystemet ved å fungere som et faresignal. Under normale sunne forhold gir den kjernefysiske plasseringen av DNA beskyttelse mot eksponering for immunsystemet. Selv-DNA som frigjøres ekstracellulært under enten patogene prosesser eller autoimmunitet er sett av immunsystemet som en potent proinflammatorisk skade assosiert molekylært selvprotein (DAMP)3. Ekstra cellulær DNA (ecDNA) frigjøres fra døende celler gjennom flere forskjellige mekanismer som styres av distinkte biokjemiske veier, som apoptose, nekrotose nøytrofil ekstracellulær felledannelse (NETs), nekrose eller pyroptose4,5,6,7,8.
Vi beskriver heri metoder for å flekke og måle ecDNA utgitt fra døende celler i deler av formalin fast parafin innebygd (FFPE) nyrer fra eksperimentelle anti-MPO GN og nyre biopsier fra pasienter med MPO-AAV9,10. Det finnes flere metoder for påvisning av sirkulerende dobbeltstrandet DNA (dsDNA) og DNA-komplekser fra både serum og urin og fra in vitro-analyser11,,12. Disse metodene, selv om de er nøyaktige for å bestemme mengden ecDNA, bestemmer ikke hvor ecDNA frigjøres anatomisk. Det finnes metoder som beskriver spesifikk måling av ecDNA som tunel for apoptose og måling av cellerester13,14. Det finnes ingen metode som beskriver måling av ecDNA som kulminerte fra alle former for celledød i FFPE-nyrer hvor den patologiske skaden oppstår. Dette er viktig for å avgjøre om eksperimentelle terapeutiske behandlinger fjerner ecDNA fra steder av patologisk skade i selve målorganet.
Oppkjøpet av flere bilder fra nyreprøver skaper et høyt volum data som analyseres ofte av en enkelt bruker. Dette er arbeidskrevende, tidkrevende og kan være underlagt upålitelig reproduserbarhet av andre brukere, på grunn av brukerbias. Trainable Weka segmentering er en åpen kildekode programvare plugin for ImageJ som bruker cutting edge bioinformatikk verktøy for å klassifisere piksler ved hjelp av maskinlæringalgoritmer 15,16. Denne metoden er "trainable" der den lærer av brukerens klassifisering av segmenter av piksler og bruker den nye lært klassifisering til andre bilder. Denne metoden er avhengig av vanlige analyseverktøy i ImageJ-programmet som brukes til å "klassifisere" hver piksel i et segment som tilhører en bestemt "klasse". Når programmet lærer "klassifikatorer", kan de brukes til å identifisere andre lignende klassifiserte segmenter i samme bilde. Denne modellen lagres og brukes deretter på andre sett med bilder i samme eksperiment.
Nåværende hindringer for å bestemme ecDNA in situ i nyreseksjoner er endogene autofluorescens fra fiksering i formalin og den arbeidsintensive analysen av bildene. Vi beskriver her hvordan å slukke denne autofluorescensen, oppdage ecDNA, og bruke overvåket maskinlæring for høy gjennomstrømningsmåling av ecDNA. Vi har tidligere publisert måling av NETs og ekstracellulær MPO (ecMPO) ved hjelp av en makro i ImageJ, vi viser nå semi automatisering av disse metodene ved hjelp av overvåket maskinlæring1. Vi demonstrerer tilpasningsevnen til maskinlæringsverktøyet, for å klassifisere en alternativ flekk for NETs og ecMPO i samme bilde. Disse fargemetodene som er beskrevet her for å oppdage ecDNA, NETs og ecMPO kan oversettes til andre faste organer og sykdommer der ecDNA, NETS og ecMPO spiller en rolle i å opprettholde sykdom som revmatoid artritt og lupus17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

Glomerulær celledød er et patologisk trekk ved myeloperoxidase anti nøytrofilt cytoplasmatisk antistoff assosiert vaskulitt (MPO-AAV). Ekstracellulær deoksyribonuklesyre (ecDNA) frigjøres under ulike former for celledød, inkludert apoptose, nekrose, nøytrofil ekstracellulære feller (NETs) og pyroptose. Måling av denne celledøden er tidkrevende med flere forskjellige biomarkører som kreves for å identifisere de forskjellige biokjemiske former for celledød. Måling av ecDNA utføres vanligvis i serum og urin som surrogat for nyreskade, ikke i selve målorganet der den patologiske skaden oppstår. Den nåværende vanskeligheten med å undersøke ecDNA i nyrene er mangelen på metoder for formalin fast parafin innebygd vev (FFPE) både eksperimentelt og i arkiverte menneskelige nyrebiopsier. Denne protokollen gir et sammendrag av trinnene som kreves for å flekke for ecDNA i FFPE-vev (både menneskelig og murine), slukke autofluorescens og måle ecDNA i de resulterende bildene ved hjelp av et maskinlæringsverktøy fra den offentlig tilgjengelige åpen kildekode ImageJ plugin trainable Weka segmentering. Trainable Weka segmentering brukes på ecDNA i glomeruli hvor programmet lærer å klassifisere ecDNA. Denne klassifikatoren brukes på etterfølgende ervervede nyrebilder, noe som reduserer behovet for manuelle merknader av hvert enkelt bilde. Tilpasningsevnen til den togbare Weka-segmenteringen er demonstrert videre i nyrevev fra eksperimentell murine anti-MPO glomerulonefritt (GN), for å identifisere NETs og ecMPO, vanlige patologiske bidragsytere til anti-MPO GN. Denne metoden gir objektiv analyse av ecDNA i nyrevev som viser tydelig effekten der det trainable Weka segmenteringsprogrammet kan skille ecDNA mellom sunt normalt nyrevev og sykt nyrevev. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å identifisere ecDNA, NETs og ecMPO i andre organer.

Disse bildene representerer flere trinn som kreves for å kunne bruke trainable Weka segmentering for å minimere den arbeidsintensive manuelle målingen av ecDNA i fluorescerende farget FFPE nyrevev fra en mus med indusert anti-MPO GN. Disse trinnene er oppsummert i figur 1 og figur 2 med bilder tatt direkte fra Weka segmenteringsprogrammet, som beskriver hvert trinn i analyseprosessen. Målinger fra denne analysen vises derette...

Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Ekstracellulært DNA (ecDNA) utgitt under celledød er proinflammatorisk og bidrar til betennelse. Måling av ecDNA på skadestedet kan bestemme effekten av terapeutisk behandling i målorganet. Denne protokollen beskriver bruken av et maskinlæringsverktøy for å automatisere måling av ecDNA i nyrevev.

Veiledet maskinlæring for semikvantifisering av ekstracellulært DNA i Glomerulonefrit

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Glomerulonefritt forårsaker patologisk glomerulær skade med betydelig celledød og ekstracellulær DNA-frigjøring. Denne protokollen muliggjør visualisering av ekstracellulært DNA på frigjøringsstedet under patologisk skade. Fordelen med denne teknikken er at den måler ekstracellulært DNA fra celledød i nyrene.I motsetning til serum eller urin er ekstracellulær DNA-måling en surrogatmarkør for patologisk skade. Betydningen av denne metoden er at både den ekstracellulære DNA-fargingen og bildeanalysen lett kan overføres til andre autoimmune sykdommer som revmatoid artritt og lupus. Denne metoden krever grunnleggende kunnskap om nyre histologi.For å muliggjøre nøyaktig påvisning av glomerulært ekstracellulært DNA, må forskeren kunne identifisere glomeruli på riktig måte. For ekstracellulær DNA-farging, varm først prøvene av interesse i et lysbildestativ i 60 grader Celsius i 60 minutter før du senker lysbildene i to 40-minutters endringer av løsningsmiddel i en røykhette. Etter den andre nedsenkingen, rehydrere prøvene to ganger i 100% etanol og en gang i 70% etanol i fem minutter per behandling.Etter siste behandling, bruk tang for å plassere lysbildene i kokende antigenhentingsløsning i en trykkoker på høyt i 10 minutter. Etter å ha avslørt antigenepiltopene, overfør trykkokeren fra varme til en vask og kjør umiddelbart kaldt vann fra springen over lokket. La lysbildene likevekte i 20 minutter i antigenhentingsløsningen før du vasker prøvene to ganger i 0,01 molar PBS på en orbital shaker i fem minutter per vask.Etter den andre vasken, bruk en hydrofob penn til å tegne sirkler rundt nyrevevsprøvene og blokkere eventuelle uspesifikke flekker med 60 mikroliter av 10% kyllingserum i 5% storfe serumalbumin i 30 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, forsiktig erstatte blokkeringsløsningen med 60 mikroliter av det primære antistoffet av interesse i et fuktighetskammer over natten ved fire grader Celsius. Neste morgen, vask lysbildene på en orbital shaker i PBS i to minutter per vask før du legger til 60 mikroliter av et passende fluorofor konjugert sekundært antistoff til hvert lysbilde for en 40-minutters inkubasjon ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen vasker du lysbildene i PBS som demonstrert, etterfulgt av behandling i 0,3% Sudan svart i 70% etanol for å slukke eventuelle formalin-indusert autofluorescence. Etter 30 minutter vasker du skliene i vann fra springen for å fjerne utfelling og dyppe lysbildene i PBS i 10 minutter for å forhindre ytterligere Sudan svart utfelling dannelse. På slutten av inkubasjonen monterer du lysbildene på deksleglassdekslene i konfokalt med tre 60 mikroliter dråper monteringsløsning supplert med DAPI og forsegler dekkslippene med neglelakk.La lysbildene kurere i 24 timer ved romtemperatur. Oppbevar dem på fire grader Celsius beskyttet mot lys til avbildning ved konfokal laserskanning mikroskopi i henhold til standardprotokoller. Pass på å forsegle dekkslips med neglelakk for å hindre bevegelse under avbildning og for å rengjøre dekslene av etanol for å forbedre bildeoppløsningen.Etter bildebehandling 20 glomeruli per lysbilde, åpne trainable Weka Segmentation plugin i ImageJ og slipp det første bildet på ImageJ verktøylinjen. Klikk på bilde-, farge- og delte kanaler. Et bilde som viser den primære antistofffargingen vises.Hvis du vil opprette en sammenslått fil med enkeltbilder, klikker du farge- og flettekanaler. En popup-boks vises og ber om en farge som skal tilordnes hver kanal. Merk av for opprett kompositt og behold kildebilder, og klikk OK. Et sammenslått sammensatt bilde vises.Ved hjelp av primær antistofffarging som en guide, tegn en interesseregion rundt den glomerulære tuften. Hvis du vil utføre en gaussisk uskarphet på det blå DAPI-bildet, klikker du prosess, filtre og gaussisk uskarphet. Sett uskarpheten på en til to.Bildet vil bli litt uklart, men kjernene vil virke glatte, bakgrunnen vil bli myknet. Klikk deretter på programtillegg, segmentering og brukbar Weka-segmentering, og bruk det frie håndverktøyet til å spore de intakte kjernene. Når alle kjernene av interesse er lagt til, legg til klasse én-boksen, bruker du linjeverktøyet til å avgrense bakgrunnsområdene til klasse to-boksen.Klikk opprett ny klasse, og bruk linjeverktøyet til å skissere det DAPI-fargede ekstranukleære DNA-et. Klikk på togklasseifikator og få sannsynlighet. Veksle musen for å få et svart-hvitt bilde av alle komponentene med objektet av valg uthevet i hvitt.Hvis du vil duplisere dette bildet, klikker du på bilde og dupliserer. Juster og terskel under bilde. Bruk museknappen til å justere terskelen til bare det ekstracellulære DNA-et observeres.Etter tersklering klikker du prosess, binær og gjør binær, og kopierer det tidligere genererte glomerulære interesseområdet. Trykk på Ctrl Skift E for å velge redigering, valg og gjenoppretting for å gjenopprette valget. For å måle bare de ekstracellulære DNA-partiklene i glomerulus, klikk analyser partikler og OK. Et resultatark som viser antall partikler, areal, gjennomsnittlige piksler og prosentandel av glomeruli som inneholder ekstracellulært DNA, genereres.Hvis du vil lagre klassifikatoren som en ekstracellulær DNA-klassifikator, klikker du lagre klassifikator og lagrer dataene. Hvis du vil bruke modellen på etterfølgende bilder på nytt, gjentar du den første bildebehandlingen som vist før du velger lastklasseifier og den lagrede klassifikatorfilen. Loggmenyen vil dukke opp og kjøre modellen.Når modellen er kjørt, klikker du last inn data og velger den ekstracellulæreDNA.arff. Klikk deretter på Opprett resultat. Hvis det resulterende bildet ikke har plukket opp alle kjerner, bakgrunn eller ekstracellulært DNA, klikker du omskoleringsklasseifikator og legger til flere klassifikatorer etter behov.Her vises enkeltkanalbilder som viser representativt DNA og beta-aktinfarging. Sammenslåing av de to bildene gjør at en interesseregion kan trekkes rundt det glomerulære området for måling av det ekstracellulære DNA-et i musen nyreglomeruli ved hjelp av trainable Weka Segmentation som demonstrert. Denne modellen kan vedtas for å identifisere ekstracellulært DNA i nyrebiopsiprøver fra en kontrollpasient eller i forhold til en nyrebiopsi fra en pasient med myeloperoxidase ANCA-assosiert vaskulitt.I tillegg kan dette programmet oversettes til andre flekker i nyrevevsprøver, for eksempel å flekke etter nøytrofile ekstracellulære feller og avsetning av ekstracellulær myeloperoxidase i ANCA-assosiert vaskulitt. Viktigere, ingen signifikante forskjeller observeres når de samme dataene analyseres av flere brukere. Det mest kritiske trinnet i analysen er å gi nok eksempler på bakgrunn, kjerner og ekstracellulært DNA med glomeruli som klassifikatorer for Weka Segmentation-programmet å lære av.Denne metoden kan enkelt overføres. For eksempel kan videre analyse av de ulike typer celledød undersøkes gjennom farging for spesifikke antistoffer mot markører for apoptose eller nekrose. Vår teknikk kan brukes sammen med andre inflammatoriske prosesser som å vurdere TLR-uttrykk i autoimmun nyresykdom eller ekstracellulært myeloperoxidaseuttrykk i menneskelige nyrebiopsier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Høy gjennomstrømning Måling av ekstracellulært DNA Slipp og kvantitative NET-formasjonen i Human Neutrophils<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Proporsjonal Imaging av ekstracellulær pH ​​i Dental Biofilm

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder for å studere Lipidendringer av nøytrofile granulocytter og etterfølgende dannelse av Neutrofil Ekstracellulær feller

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

En enkel Fluorescens analyse for Kvantifisering av Canine nøytrofile ekstracellulær felle utløsning

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Oppdagelse av lavt kopi nummer integrert virus-DNA dannet av In Vitro hepatitt B-smitte

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...