Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Reconhecemos a Monash Micro Imaging pelo uso do microscópio de varredura a laser confocal Nikon C1 e da Plataforma de Histologia Monash para o processamento do tecido renal.

Este método permite a detecção de ecDNA pan de todas as formas de morte celular. O mesmo método e anticorpos são usados para o tecido de biópsia renal humana (a partir do passo 4). Todos os indivíduos animais e humanos tiveram aprovação ética da Monash University, e Monash Health, Clayton, Victoria, Austrália.
1. Coloração para ecDNA com DAPI e β-Actin
<ol><li>Induzir um modelo de 20 dias de glomerulonephritis anti-mieloperoxidase (anti-MPO-GN) em camundongos C57/Bl6 de 8-10 se...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. 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L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

Existem protocolos múltiplos que medem marcadores proinflamatórios no soro e urina de ambos os pacientes e modelos de camundongos de glomerulonephritis. Este protocolo descrito permite a análise dos produtos de morte celular (ecDNA, NETs e ecMPO) dentro do glomerulus diretamente. Os passos mais cruciais neste protocolo são a preparação e a imagem do tecido. O principal elemento restritivo do uso de um método de coloração fluorescente para análise é a autofluorescência tecidual. O tecido de parafina fixa forma...

O anticorpo citoplasmico anti-neutrófilo associado à vasculite anti-neutronômica (MPO-AAV) é uma doença autoimune que resulta em insuficiência renal por lesão glomerular patológica com considerável morte celular e liberação de ácido desoxiribonucleico (DNA)1,,2. O DNA pode ativar o sistema imunológico agindo como um sinal de perigo. Em condições saudáveis normais, a localização nuclear do DNA oferece proteção contra a exposição ao sistema imunológico. O auto-DNA que é liberado extracelularmente durante processos patogênicos ou autoimunidade é visto pelo sistema imunológico como um potente dano proinflamatório associado à auto-proteína molecular (DAMP)3. O DNA celular extra (ecDNA) é liberado de células moribundas através de vários mecanismos distintos que são regidos por distintas vias bioquímicas, como apoptose, necroptose formação de armadilha extracelular (NETs), necrose ou pioptose4,,5,,6,,7,,8.
Descrevemos aqui métodos para colorar e medir o ecDNA liberado de células moribundas em seções de parafina fixa formalina incorporada (FFPE) de biópsias experimentais anti-MPO GN e renais de pacientes com MPO-AAV9,,10. Existem múltiplos métodos para a detecção de complexos de DNA duplo encalhado circulante (dsDNA) e DNA tanto do soro quanto da urina e dos ensaios in vitro11,12. Esses métodos, embora precisos na determinação da quantidade de ecDNA, não determinam onde o ecDNA é liberado anatomicamente. Existem métodos que descrevem a medição específica do ecDNA, como o tunel para apoptose e a medição de detritos celulares13,14. Não há nenhum método que descreva a medição do ECDNA culminado de todas as formas de morte celular nos rins FFPE onde ocorre o dano patológico. Isso é importante para determinar se os tratamentos terapêuticos experimentais estão eliminando o ecDNA dos locais de lesão patológica no órgão alvo real.
A aquisição de múltiplas imagens de amostras de rim cria um alto volume de dados que é analisado comumente por um único usuário. Isso é trabalhoso, demorado e pode estar sujeito a reprodutibilidade não confiável por outros usuários, devido ao viés do usuário. A segmentação de Weka é um plugin de software de código aberto para ImageJ que usa ferramentas bioinformáticas de ponta para classificar pixels usando algoritmos de aprendizado de máquina15,,16. Este método é "treinável" pelo qual aprende com a classificação do usuário segmentos de pixels e aplica a nova classificação aprendida a outras imagens. Este método se baseia em ferramentas de análise comuns dentro do programa ImageJ que são usadas para "classificar" cada pixel em um segmento como pertencente a uma "classe" específica. Uma vez que o programa aprende os "classificadores", eles podem ser usados para identificar outros segmentos classificados semelhantes dentro da mesma imagem. Este modelo é então salvo e aplicado a outros conjuntos de imagens dentro do mesmo experimento.
Os obstáculos atuais para determinar o ecDNA in situ em seções renais é a autofluorescência endógena da fixação na formalina e a análise intensiva do trabalho intensivo das imagens. Descrevemos aqui como saciar essa autofluorescência, detectar ecDNA e usar aprendizado de máquina supervisionado para medição de alto rendimento do ecDNA. Publicamos anteriormente a medição de NETs e MPO extracelular (ecMPO) utilizando uma macro no ImageJ, agora demonstramos semimass automação desses métodos usando aprendizado de máquina supervisionado1. Demonstramos a adaptabilidade da ferramenta de aprendizado de máquina, para classificar uma mancha alternativa para NETs e ecMPO dentro da mesma imagem. Estes métodos de coloração descritos aqui para a detecção de ecDNA, NETs e ecMPO podem ser traduzidos para outros órgãos e doenças sólidas onde ecDNA, NETS e ecMPO desempenha um papel na perpetuação de doenças como artrite reumatoide e lúpus17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

A morte celular glomerular é uma característica patológica do anticorpo citoplasmica anti-neutrófilo mielóperidase associado à vasculite (MPO-AAV). O ácido desoxiribonucleico extracelular (ecDNA) é liberado durante diferentes formas de morte celular, incluindo apoptose, necroptose, armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e pioptosis. A medição desta morte celular é demorada com vários biomarcadores diferentes necessários para identificar as diferentes formas bioquímicas de morte celular. A medição do ecDNA é geralmente conduzida em soro e urina como substituto para danos renais, não no órgão alvo real onde ocorre a lesão patológica. A dificuldade atual em investigar o ecDNA no rim é a falta de métodos para o tecido incorporado de parafina fixa formalina (FFPE) tanto experimentalmente quanto em biópsias renais humanas arquivadas. Este protocolo fornece um resumo das etapas necessárias para colorir para ecDNA no tecido FFPE (humano e murine), saciar a autofluorescência e medir o ecDNA nas imagens resultantes usando uma ferramenta de aprendizado de máquina da segmentação weka de código aberto disponível publicamente. A segmentação de Weka trainável é aplicada ao ecDNA dentro do glomeruli onde o programa aprende a classificar o ecDNA. Este classificador é aplicado a imagens renais adquiridas subsequentes, reduzindo a necessidade de anotações manuais de cada imagem individual. A adaptabilidade da segmentação de Weka trainável é demonstrada ainda mais no tecido renal a partir da glomerulonephrite murina experimental (GN), para identificar NETs e ecMPO, contribuintes patológicos comuns para o ANTI-MPO GN. Este método fornece uma análise objetiva da ecDNA no tecido renal que demonstra claramente a eficácia na qual o programa de segmentação de Weka pode distinguir o ECDNA entre tecido renal normal saudável e tecido renal doente. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para identificar ecDNA, NETs e ecMPO em outros órgãos.

Essas imagens representam as múltiplas etapas necessárias para usar com sucesso a segmentação de Weka treinar para minimizar a medição manual intensiva de ecDNA em tecido renal FFPE manchado fluorescentemente de um rato com GN anti-MPO induzido. Essas etapas são resumidas na Figura 1 e Figura 2 com imagens tiradas diretamente do programa de segmentação Weka, delineando cada etapa do processo de análise. As medições de...

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Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

O DNA extracelular (ecDNA) liberado durante a morte celular é proinflamatório e contribui para inflamação. A medição do ecDNA no local da lesão pode determinar a eficácia do tratamento terapêutico no órgão-alvo. Este protocolo descreve o uso de uma ferramenta de aprendizado de máquina para automatizar a medição do ecDNA no tecido renal.

Aprendizado de Máquina Supervisionado para Semi-Quantificação de DNA Extracelular em Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Glomerulonephritis causa lesão glomerular patológica com considerável morte celular e liberação extracelular de DNA. Este protocolo permite a visualização de DNA extracelular no local da liberação durante a lesão patológica. A vantagem dessa técnica é que ela mede DNA extracelular da morte celular no rim.Ao contrário do soro ou urina, a medição extracelular do DNA é um marcador substituto para danos patológicos. O significado deste método é que tanto a coloração extracelular do DNA quanto a análise de imagem são facilmente transferíveis para outras doenças autoimunes, como artrite reumatoide e lúpus. Este método requer um conhecimento básico da histologia renal.Para permitir a detecção precisa do DNA extracelular glomerular, o pesquisador deve ser capaz de identificar corretamente glomeruli. Para coloração extracelular de DNA, primeiro aqueça as amostras de interesse em um rack de slides em 60 graus Celsius por 60 minutos antes de imergir os slides em duas mudanças de 40 minutos de solvente em um capô de fumaça. Após a segunda imersão, reidratar as amostras duas vezes em 100% etanol e uma vez em 70% de etanol por cinco minutos por tratamento.Após o último tratamento, use pinças para colocar os slides em solução de recuperação de antígeno fervente em uma panela de pressão em alta por 10 minutos. Depois de desmascarar os epítopos de antígeno, transfira a panela de pressão do calor para uma pia e corra imediatamente água fria da torneira sobre a tampa. Deixe os slides equilibrarem por 20 minutos na solução de recuperação de antígenos antes de lavar as amostras duas vezes em PBS molar de 0,01 em um agitador orbital por cinco minutos por lavagem.Após a segunda lavagem, use uma caneta hidrofóbica para desenhar círculos ao redor das amostras de tecido renal e bloquear qualquer coloração inespecífica com 60 microliters de 10% soro de frango em 5% de albumina de soro bovino por 30 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, substitua cuidadosamente a solução de bloqueio por 60 microliters do anticorpo primário de interesse em uma câmara de umidade durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, lave os slides em um agitador orbital em PBS por dois minutos por lavagem antes de adicionar 60 microliters de um anticorpo secundário conjugado fluoróvo apropriado a cada slide para uma incubação de 40 minutos à temperatura ambiente.Ao final da incubação, lave os slides na PBS como demonstrado, seguido de tratamento em 0,3% sudão negro em 70% etanol para saciar qualquer autofluorescência potencialmente induzida por formalina. Após 30 minutos, lave os slides na água da torneira para remover qualquer precipitado e mergulhe os slides na PBS por 10 minutos para evitar qualquer formação de precipitação negra do Sudão. No final da incubação, monte os slides em tampas de vidro confocal com três gotas de 60 microliteres de solução de montagem complementadas com DAPI e sele as tampas com esmalte.Deixe os slides curarem por 24 horas em temperatura ambiente. Armazene-os a quatro graus Celsius protegidos da luz até a imagem por microscopia de varredura a laser confocal de acordo com os protocolos padrão. Certifique-se de selar as tampas com esmalte para evitar qualquer movimento durante a imagem e limpar as tampas do etanol para melhorar a resolução da imagem.Depois de fotografar 20 glomeruli por slide, abra o plugin de segmentação Weka capacitável no ImageJ e solte a primeira imagem na barra de ferramentas ImageJ. Clique em imagem, cor e canais divididos. Uma imagem mostrando a mancha primária de anticorpos aparecerá.Para criar um arquivo mesclado das imagens únicas, clique em canais de cor e mesclagem. Uma caixa pop-up aparecerá pedindo que uma cor seja atribuída a cada canal. Verifique o composto de criação e mantenha as caixas de imagens de origem e clique em OK. Uma imagem composta mesclada aparecerá.Usando a mancha de anticorpos primário como guia, desenhe uma região de interesse em torno do tufo glomerular. Para executar um desfoque gaussiano na imagem daPI azul única, clique no processo, filtros e desfoque gaussiano. Coloque o borrão em um a dois.A imagem ficará um pouco embaçada, mas os núcleos parecerão suaves, o fundo será suavizado. Em seguida, clique em plugins, segmentação e segmentação weka treinavel, e use a ferramenta manual livre para rastrear os núcleos intactos. Quando todos os núcleos de interesse tiverem sido adicionados, a caixa adicionar classe um, use a ferramenta de linha para delinear as áreas de fundo para a caixa classe dois.Clique em criar uma nova classe e use a ferramenta de linha para delinear o DNA extranuclear manchado pelo DAPI. Clique no classificador do trem e obtenha probabilidade. Alterne o mouse para obter uma imagem em preto e branco de todos os componentes com o objeto de seleção destacado em branco.Para duplicar esta imagem, clique na imagem e duplicar. Sob imagem, ajuste e limiar. Use o botão do mouse para ajustar o limiar até que apenas o DNA extracelular seja observado.Após o limiar, clique no processo, binário e torne binário e copie a região glomerular gerada anteriormente. Pressione o Shift E de controle de comando para selecionar edição, seleções e restaurar para restaurar a seleção. Para medir apenas as partículas de DNA extracelular dentro do glomerulus, clique em analisar partículas e OK. Uma folha de resultado mostrando o número de partículas, área, pixels médios e porcentagem de glomeruli contendo DNA extracelular será gerada.Para salvar o classificador como classificador de DNA extracelular, clique em salvar o classificador e salvar os dados. Para reaplicar o modelo às imagens subsequentes, repita o processamento inicial da imagem como demonstrado antes de selecionar o classificador de carga e o arquivo classificador de classificador salvo. O menu de registro aparecerá e executará o modelo.Uma vez executado o modelo, clique em dados de carga e selecione extracellularDNA.arff. Em seguida, clique em criar resultado. Se a imagem resultante não conseguiu captar todos os núcleos, fundo ou DNA extracelular, clique em classificarr o classificador e adicionar mais classificadores conforme necessário.Aqui, imagens de um único canal mostrando DNA representativo e coloração de beta actin são mostradas. A fusão das duas imagens permite que uma região de interesse seja desenhada ao redor da área glomerular para medição do DNA extracelular dentro do glomeruli renal do rato usando segmentação weka trainável como demonstrado. Este modelo pode ser adotado para identificar DNA extracelular em amostras de biópsia renal de um paciente de controle ou comparação com a de uma biópsia renal de um paciente com vasculite associada à ANCA.Além disso, este programa pode ser traduzido para outras manchas dentro de amostras de tecido renal, por exemplo, para colorir para armadilhas extracelulares de neutrófilos e a deposição de mieloxidase extracelular em vasculite associada à ANCA. É importante ressaltar que não são observadas diferenças significativas quando os mesmos dados são analisados por vários usuários. O passo mais crítico da análise é fornecer exemplos suficientes de fundo, núcleos e DNA extracelular com glomeruli como classificadores para o programa de Segmentação Weka aprender.Este método é facilmente transferível. Por exemplo, uma análise mais aprofundada dos diferentes tipos de morte celular pode ser investigada através da coloração de anticorpos específicos contra marcadores para apoptose ou necrose. Nossa técnica pode ser usada com outros processos inflamatórios, como avaliar a expressão TLR em doença renal autoimune ou expressão de mieloperoxidase extracelular em biópsias renais humanas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Imunologia e Infecção

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Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

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Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

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High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

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High Throughput medição de Extracelular DNA lançamento e Formação NET quantitativa em neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

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