Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Reconocemos a Monash Micro Imaging por el uso del microscopio de escaneo láser confocal vertical Nikon C1 y la plataforma histología Monash para el procesamiento de tejido renal.

Este método permite la detección de ecDNA pan a partir de todas las formas de muerte celular. El mismo método y anticuerpos se utilizan para el tejido de biopsia renal humana (del paso 4). Todos los sujetos animales y humanos tenían la aprobación ética de la Universidad de Monash, y Monash Health, Clayton, Victoria, Australia.
1. Tinción de ECDNA con DAPI y Actin
<ol><li>Inducir un modelo de 20 días de glomerulonefritis anti-mieloperoxidasa (anti-MPO-GN) en ratones C57/Bl6 de 8-10 se...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. 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L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

Existen múltiples protocolos que miden los marcadores proinflamatorios en el suero y la orina tanto de los pacientes como de los modelos de ratón de glomerulonefritis. Este protocolo descrito permite el análisis de los productos de la muerte celular (ECDNA, NETs y ecMPO) directamente dentro del glomerulo. Los pasos más cruciales en este protocolo son la preparación de tejidos y la toma de imágenes. El principal elemento restrictivo del uso de un método de tinción fluorescente para el análisis es la autofluoresce...

La vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos anti neutrófilos de mieloperoxidasa (MPO-AAV) es una enfermedad autoinmune que produce insuficiencia renal por lesión glomerular patológica con considerable muerte celular y liberación de ácido desoxirribonucleico (ADN)1,2. El ADN puede activar el sistema inmunitario actuando como una señal de peligro. En condiciones saludables normales, la ubicación nuclear del ADN ofrece protección contra la exposición al sistema inmunitario. El auto-ADN que se libera extracelularmente durante los procesos patógenos o la autoinmunidad es visto por el sistema inmune como un potente daño proinflamatorio asociado a la autoprotesión molecular asociada (DAMP)3. El ADN celular adicional (ADNC) se libera de las células moribundas a través de varios mecanismos distintos que se rigen por distintas vías bioquímicas, como la apoptosis, la formación de trampas extracelulares de neutrófilos necrópticos (PT), necrosis o piroptosis4,,5,,6,,7,,8.
Aquí describimos métodos para manchar y medir el ECDNA liberado de las células moribundas en secciones de los riñones de parafina fija de formalina (FFPE) de las biopsias experimentales anti-MPO GN y renales de pacientes con MPO-AAV9,10. Existen múltiples métodos para la detección de ADN de doble cadena circulante (dsDNA) y complejos de ADN tanto de suero como de orina y de ensayos in vitro11,12. Estos métodos, aunque precisos para determinar la cantidad de ADC, no determinan dónde se libera anatómicamente el ADC. Existen métodos que describen la medición específica del ECDNA, como la tuneltosis para la apoptosis y la medición de los desechos celulares13,,14. No hay ningún método que describa la medición de ECDNA culminó de todas las formas de muerte celular en los riñones FFPE donde se produce el daño patológico. Esto es importante para determinar si los tratamientos terapéuticos experimentales están limpiando el ADNc de los sitios de lesión patológica en el órgano diana real.
La adquisición de varias imágenes a partir de muestras de riñón crea un alto volumen de datos que es analizado comúnmente por un solo usuario. Esto requiere mucha mano de obra, consume mucho tiempo y puede estar sujeto a reproducibilidad poco fiable por parte de otros usuarios, debido al sesgo del usuario. Trainable Weka segmentation es un plugin de software de código abierto para ImageJ que utiliza herramientas bioinformáticas de vanguardia para clasificar píxeles utilizando algoritmos de aprendizaje automático15,,16. Este método es "entrenable" por lo que aprende de la clasificación del usuario de segmentos de píxeles y aplica la nueva clasificación aprendida a otras imágenes. Este método se basa en herramientas de análisis comunes dentro del programa ImageJ que se utilizan para "clasificar" cada píxel de un segmento como perteneciente a una "clase" específica. Una vez que el programa aprende los "clasificadores", se pueden utilizar para identificar otros segmentos clasificados similares dentro de la misma imagen. A continuación, este modelo se guarda y se aplica a otros conjuntos de imágenes dentro del mismo experimento.
Los obstáculos actuales para determinar el ADC in situ en las secciones renales son la autofluorescencia endógena de la fijación en formalina y el análisis intensivo de mano de obra de las imágenes. Aquí describimos cómo apagar esta autofluorescencia, detectar ecDNA y usar el aprendizaje automático supervisado para la medición de alto rendimiento de ecDNA. Hemos publicado previamente la medición de NETs y MPO extracelular (ecMPO) utilizando una macro en ImageJ, ahora demostramos semi automatización de estos métodos utilizando el aprendizaje automático supervisado1. Demostramos la adaptabilidad de la herramienta de aprendizaje automático, para clasificar una mancha alternativa para NETs y ecMPO dentro de la misma imagen. Estos métodos de tinción descritos aquí para detectar ECDNA, NETs y ecMPO se pueden traducir a otros órganos sólidos y enfermedades donde ecDNA, NETS y ecMPO desempeña un papel en la perpetuación de enfermedades como la artritis reumatoide y el lupus17,,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

La muerte celular glomerular es una característica patológica de la vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos con mieloperoxidasa (MPO-AAV). El ácido desoxirribonucleico extracelular (ADNc) se libera durante diferentes formas de muerte celular, incluyendo apoptosis, necrosis, necroptosis, trampas extracelulares de neutrófilos (NELL) y piroptosis. La medición de esta muerte celular consume mucho tiempo con varios biomarcadores diferentes necesarios para identificar las diferentes formas bioquímicas de muerte celular. La medición del ADNc generalmente se lleva a cabo en suero y orina como sustituto del daño renal, no en el órgano diana real donde se produce la lesión patológica. La dificultad actual para investigar el ADC en el riñón es la falta de métodos para el tejido incrustado de parafina fija de formalina (FFPE) tanto experimentalmente como en biopsias renales humanas archivadas. Este protocolo proporciona un resumen de los pasos necesarios para manchar para ecDNA en el tejido FFPE (tanto humano como murino), apagar la autofluorescencia y medir el ECDNA en las imágenes resultantes utilizando una herramienta de aprendizaje automático de la segmentación de Weka de código abierto disponible públicamente. La segmentación entrenable de Weka se aplica a ecDNA dentro de los glomérulos, donde el programa aprende a clasificar el ECDNA. Este clasificador se aplica a las imágenes renales adquiridas posteriores, lo que reduce la necesidad de anotaciones manuales de cada imagen individual. La adaptabilidad de la segmentación entrenable de Weka se demuestra aún más en el tejido renal de la glomerulonefritis experimental murina anti-MPO (GN), para identificar NETs y ecMPO, contribuyentes patológicos comunes a anti-MPO GN. Este método proporciona un análisis objetivo de la ADNc en el tejido renal que demuestra claramente la eficacia en la que el programa de segmentación de Weka entrenable puede distinguir el ADNc entre el tejido renal normal sano y el tejido renal enfermo. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para identificar ECDNA, NETs y ecMPO en otros órganos.

Estas imágenes representan los múltiples pasos necesarios para utilizar con éxito la segmentación de Weka entrenable para minimizar la medición manual intensiva en mano de obra de ecDNA en tejido renal FFPE manchado fluorescentemente de un ratón con GN anti-MPO inducido. Estos pasos se resumen en la Figura 1 y la Figura 2 con imágenes tomadas directamente del programa de segmentación de Weka, delineando cada paso en el pr...

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Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

El ADN extracelular (ADNC) liberado durante la muerte celular es proinflamatorio y contribuye a la inflamación. La medición del ADNc en el lugar de la lesión puede determinar la eficacia del tratamiento terapéutico en el órgano diana. Este protocolo describe el uso de una herramienta de aprendizaje automático para automatizar la medición de ECDNA en el tejido renal.

Aprendizaje automático supervisado para la semi-cuantificación del ADN extracelular en glomerulonefritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

La glomerulonefritis causa lesiones glomerulares patológicas con muerte celular considerable y liberación de ADN extracelular. Este protocolo permite la visualización del ADN extracelular en el lugar de liberación durante la lesión patológica. La ventaja de esta técnica es que mide el ADN extracelular a partir de la muerte celular en el riñón.A diferencia del suero o la orina, la medición del ADN extracelular es un marcador suplente para el daño patológico. La importancia de este método es que tanto la tinción de ADN extracelular como el análisis de imágenes son fácilmente transferibles a otras enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide y el lupus. Este método requiere un conocimiento básico de la histología renal.Para permitir la detección precisa del ADN extracelular glomerular, el investigador debe ser capaz de identificar correctamente los glomérulos. Para la tinción de ADN extracelular, primero caliente las muestras de interés en un portaobjetos en 60 grados Celsius durante 60 minutos antes de sumergir las diapositivas en dos cambios de disolvente de 40 minutos en una campana de humo. Después de la segunda inmersión, rehidratar las muestras dos veces en 100%etanol y una vez en 70%etanol durante cinco minutos por tratamiento.Después del último tratamiento, utilice pinzas para colocar los portaobjetos en la solución de recuperación de antígenos hirviendo en una olla a presión en alto durante 10 minutos. Después de desenmascarar los epitopos del antígeno, transfiera la olla a presión del calor a un fregadero y pase inmediatamente agua fría del grifo sobre la tapa. Deje que las diapositivas se equilibren durante 20 minutos en la solución de recuperación de antígenos antes de lavar las muestras dos veces en 0,01 MOLar PBS en un agitador orbital durante cinco minutos por lavado.Después del segundo lavado, utilice una pluma hidrófoba para dibujar círculos alrededor de las muestras de tejido renal y bloquear cualquier tinción inespecífico con 60 microlitros de 10% de suero de pollo en 5% albúmina sérica bovina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, reemplace cuidadosamente la solución de bloqueo con 60 microlitros del anticuerpo primario de interés en una cámara de humedad durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos en un agitador orbital en PBS durante dos minutos por lavado antes de añadir 60 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado a cada diapositiva para una incubación de 40 minutos a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave los portaobjetos en PBS como se ha demostrado, seguido por el tratamiento en 0,3% de negro sudanés en 70%etanol para apagar cualquier autofluorescencia potencial inducida por formalina. Después de 30 minutos, lave los portaobjetos en agua del grifo para eliminar cualquier precipitado y sumerja los portaobjetos en PBS durante 10 minutos para evitar cualquier mayor formación de precipitados negros de Sudán. Al final de la incubación, monte los portaobjetos en los cubreobjetos de vidrio confocal con tres gotas de 60 microlitros de solución de montaje complementadas con DAPI y selle los cubreobjetos con esmalte de uñas.Deje que los portaobjetos se curen durante 24 horas a temperatura ambiente. Guárdelos a cuatro grados Cent protegidos de la luz hasta que se hagan imágenes mediante microscopía de escaneo láser confocal de acuerdo con los protocolos estándar. Asegúrese de sellar los cubreobjetos con esmalte de uñas para evitar cualquier movimiento durante la toma de imágenes y limpiar los cubreobjetos de etanol para mejorar la resolución de la imagen.Después de tomar imágenes de 20 glomérulos por diapositiva, abra el plugin de segmentación Weka entrenable en ImageJ y suelte la primera imagen en la barra de herramientas de ImageJ. Haga clic en canales de imagen, color y división. Aparecerá una imagen que muestra la tinción primaria de anticuerpos.Para crear un archivo combinado de las imágenes individuales, haga clic en color y combine canales. Aparecerá un cuadro emergente pidiendo que se asigne un color a cada canal. Marque las casillas crear imágenes compuestas y mantener las imágenes de origen y haga clic en Aceptar. Aparecerá una imagen compuesta combinada.Usando la tinción primaria de anticuerpos como guía, dibuje una región de interés alrededor del mechón glomerular. Para realizar un desenfoque gaussiano en la imagen DAPI azul única, haga clic en proceso, filtros y desenfoque gaussiano. Ajuste el desenfoque en uno a dos.La imagen se volverá un poco borrosa, pero los núcleos aparecerán suaves, el fondo se suavizará. A continuación, haga clic en plugins, segmentación y segmentación de Weka entrenable, y utilice la herramienta de mano libre para rastrear los núcleos intactos. Cuando se hayan agregado todos los núcleos de interés, el cuadro agregar clase uno, utilice la herramienta de línea para delinear las áreas de fondo al cuadro de clase dos.Haga clic en Crear nueva clase y utilice la herramienta de línea para delinear el ADN extranuclear manchado de DAPI. Haga clic en clasificador de tren y obtenga probabilidad. Alternar el ratón para obtener una imagen en blanco y negro de todos los componentes con el objeto de selección resaltado en blanco.Para duplicar esta imagen, haga clic en imagen y duplique. En imagen, ajuste y umbral. Utilice el botón del ratón para ajustar el umbral hasta que sólo se observe el ADN extracelular.Después de la umbral, haga clic en procesar, binario y hacer binario, y copie la región glomerular generada anteriormente de interés. Pulse Control Shift E para seleccionar editar, seleccionar y restaurar para restaurar la selección. Para medir solo las partículas de ADN extracelulares dentro del glomérulo, haga clic en analizar partículas y ACEPTAR. Se generará una hoja de resultados que muestra el número de partículas, el área, los píxeles medios y el porcentaje de glomérulos que contienen ADN extracelular.Para guardar el clasificador como clasificador de ADN extracelular, haga clic en guardar clasificador y guarde los datos. Para volver a aplicar el modelo a imágenes posteriores, repita el procesamiento de imagen inicial como se ha demostrado antes de seleccionar el clasificador de carga y el archivo clasificador guardado. El menú de registro aparecerá y ejecutará el modelo.Una vez ejecutado el modelo, haga clic en cargar datos y seleccione el archivo extracellularDNA.arff. A continuación, haga clic en crear resultado. Si la imagen resultante no ha podido recoger todos los núcleos, el fondo o el ADN extracelular, haga clic en volver a entrenar clasificador y agregue más clasificadores según sea necesario.Aquí, se muestran imágenes de un solo canal que muestran la tinción representativa de ADN y beta actina. La fusión de las dos imágenes permite dibujar una región de interés alrededor del área glomerular para la medición del ADN extracelular dentro de los glomérulos renales del ratón utilizando la segmentación entrenable de Weka como se ha demostrado. Este modelo se puede adoptar para identificar el ADN extracelular en muestras de biopsia renal de un paciente de control o la comparación con la de una biopsia renal de un paciente con vasculitis asociada a la mieloperoxidasa ANCA.Además, este programa se puede traducir a otras manchas dentro de muestras de tejido renal, por ejemplo, para manchar para las trampas extracelulares de neutrófilos y la deposición de mieloperoxidasa extracelular en vasculitis asociada a ANCA. Es importante destacar que no se observan diferencias significativas cuando varios usuarios analizan los mismos datos. El paso más crítico del análisis es proporcionar suficientes ejemplos de antecedentes, núcleos y ADN extracelular con glomérulos como clasificadores para el programa de segmentación de Weka para aprender de.Este método es fácilmente transferible. Por ejemplo, se puede investigar un análisis adicional de los diferentes tipos de muerte celular a través de la tinción de anticuerpos específicos contra marcadores de apoptosis o necrosis. Nuestra técnica se puede utilizar con otros procesos inflamatorios como la evaluación de la expresión TLR en la enfermedad renal autoinmune o la expresión mieloperoxidasa extracelular en biopsias renales humanas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Investigación

Inmunología e Infección

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

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Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Alto Rendimiento de medición de ADN extracelular de salida y la formación neta cuantitativa en neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Imaging radiométrica de pH extracelular en los biofilms dentales

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Métodos para el estudio de lípidos Las alteraciones en neutrófilos y la posterior formación de los neutrófilos extracelular Trampas

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

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Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

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Detección de copia baja número DNA Viral integradora formada por In Vitro la infección Hepatitis B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...