Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Vi bekräftar Monash Micro Imaging för användning av Nikon C1 upprätt confocal laserscanning mikroskop och Monash Histology Platform för bearbetning av njurvävnad.

Denna metod möjliggör detektion av pan ecDNA från alla former av celldöd. Samma metod och antikroppar används för human njurbiopsivävnad (från steg 4). Alla djur- och mänskliga ämnen hade etikgodkännande från Monash University, och Monash Health, Clayton, Victoria, Australien.
1. Färgning för ecDNA med DAPI och β-Actin
<ol><li>Inducera en 20 dagars modell av anti-myeloperoxidas glomerulonefrit (anti-MPO-GN) i 8-10 veckor gamla C57/Bl6 möss, medkontroller 9</...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection.">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+the+significance+of+apoptosis.">Cell death: the significance of apoptosis.</a> International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).</li><li>Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+one+way+to+die:+apoptosis,+necrosis+and+reactive+oxygen+damage.">More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage.</a> Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).</li><li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+its+role+in+inflammation.">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

Flera protokoll finns som mäter proinflammatory markörer i serum och urin av både patienter och mus modeller av glomerulonefrit. Detta beskrivna protokoll möjliggör analys av produkter av celldöd (ecDNA, NETs och ecMPO) inom glomerulus direkt. De viktigaste stegen i detta protokoll är vävnadsberedning och avbildning. Den viktigaste begränsa inslag av att använda en fluorescerande färgning metod för analys är vävnad autofluorescens. Formalin fast paraffinvävnad är föremål för autofluorescens som kan sky...

Myeloperoxidas anti neutrofil cytoplasmatisk antikroppssasocierade vaskulit (MPO-AAV) är en autoimmun sjukdom som resulterar i njursvikt från patologisk glomerär skada med betydande celldöd och frisättning av deoxyribonukleinsyra (DNA)1,2. DNA kan aktivera immunsystemet genom att fungera som en varningssignal. Under normala hälsosamma förhållanden erbjuder dna-kärnan skydd mot exponering för immunsystemet. Själv-DNA som frigörs extracellulärt under antingen patogena processer eller autoimmunitet ses av immunsystemet som en potent proinflammatorisk skada associerad molekylärt självprotein (DAMP)3. Extra cellulärt DNA (ecDNA) frigörs från döende celler genom flera olika mekanismer som styrs av olika biokemiska vägar, såsom apoptos, nekrotosis neutrofil extracellulär fällabildning (NETs), nekros eller pyroptos4,,5,,6,,7,8.
Vi beskriver häri metoder för att färga och mäta ecDNA frigörs från döende celler i delar av formalin fast paraffin inbäddade (FFPE) njurar från experimentella anti-MPO GN och njurbiopsier från patienter med MPO-AAV9,10. Det finns flera metoder för påvisande av cirkulation av dubbelsträngat DNA (dsDNA) och DNA-komplex från både serum och urin och från in vitro-analyser11,12. Dessa metoder, även om de är korrekta vid fastställandet av mängden ecDNA, bestämmer inte var ecDNA frigörs anatomiskt. Det finns metoder som beskriver specifik mätning av ecDNA såsom tunel för apoptos och mätning av cellskräp13,14. Det finns ingen metod som beskriver mätning ecDNA kulminerade från alla former av celldöd i FFPE njurar där den patologiska skadan uppstår. Detta är viktigt att avgöra om experimentella terapeutiska behandlingar rensar ecDNA från platserna för patologisk skada i det faktiska målorganet.
Förvärvet av flera bilder från njurprover skapar en stor mängd data som analyseras ofta av en enda användare. Detta är arbetsintensivt, tidskrävande och kan bli föremål för opålitlig reproducerbarhet av andra användare, på grund av användarens partiskhet. Trainable Weka segmentering är en öppen källkod plugin för ImageJ som använder framkant bioinformatiska verktyg för att klassificera pixlar med hjälp av maskininlärning algoritmer15,16. Denna metod är "trainable" där den lär sig från användarens klassificering av segment av pixlar och tillämpar den nya inlärd klassificering till andra bilder. Den här metoden bygger på vanliga analysverktyg i ImageJ-programmet som används för att "klassificera" varje pixel i ett segment som tillhör en viss "klass". När programmet lär sig "klassificerare", kan de användas för att identifiera andra liknande klassificerade segment inom samma bild. Den här modellen sparas och tillämpas sedan på andra uppsättningar bilder i samma experiment.
Aktuella hinder för att bestämma ecDNA in situ i njure sektioner är endogena autofluorescens från fixering i formalin och arbetsintensiv analys av bilderna. Vi beskriver här hur man släcka denna autofluorescens, upptäcka ecDNA och använda övervakad maskininlärning för hög genomströmning mätning av ecDNA. Vi har tidigare publicerat mätning av unga som varken arbetar eller studerar med hjälp av ett makro i ImageJ, vi visar nu semi automatisering av dessa metoder med hjälp av övervakad maskininlärning1. Vi visar att maskininlärningsverktyget är anpassningsbart för att klassificera en alternativ fläck för unga som varken arbetar eller studerar inom samma bild. Dessa färgningsmetoder som beskrivs här för att upptäcka ecDNA, NETs och ecMPO kan översättas till andra fasta organ och sjukdomar där ecDNA, NETS och ecMPO spelar en roll för att vidmakthålla sjukdomar såsom reumatoid artrit och lupus17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

Glomerular cell död är en patologisk funktion i myeloperoxidas anti neutrofil cytoplasmatisk antikroppar associerade vaskulit (MPO-AAV). Extracellulär deoxyribonucleic syra (ecDNA) frigörs under olika former av celldöd inklusive apoptos, nekros, nekros, neutrofil extracellulära fällor (NETs) och pyroptos. Mätning av denna celldöd är tidskrävande med flera olika biomarkörer som krävs för att identifiera de olika biokemiska formerna av celldöd. Mätning av ecDNA utförs i allmänhet i serum och urin som ett surrogat för njurskada, inte i det faktiska målorganet där den patologiska skadan uppstår. Den nuvarande svårigheten att undersöka ecDNA i njurarna är bristen på metoder för formalin fast paraffin inbäddade vävnad (FFPE) både experimentellt och i arkiverade mänskliga njure tarmbiopsier. Detta protokoll ger en sammanfattning av de steg som krävs för att färga för ecDNA i FFPE vävnad (både mänskliga och murine), släcka autofluorescens och mäta ecDNA i de resulterande bilderna med hjälp av en verktygsinlärningsverktyg från allmänt tillgängliga öppen källkod ImageJ plugin trainable Weka segmentering. Trainable Weka segmentering tillämpas på ecDNA inom glomeruli där programmet lär sig att klassificera ecDNA. Denna klassificerare tillämpas på efterföljande förvärvade njurbilder, vilket minskar behovet av manuella anteckningar för varje enskild bild. Anpassningsförmågan hos den trainable Weka segmenteringen visas vidare i njurvävnad från experimentella murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), att identifiera NETs och ecMPO, gemensamma patologiska bidragsgivare till anti-MPO GN. Denna metod ger objektiv analys av ecDNA i njurvävnad som tydligt visar den effekt i vilken det trainable Weka segmenteringsprogrammet kan skilja ecDNA mellan friska normala njurvävnad och sjuk njurvävnad. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att identifiera ecDNA, NETs och ecMPO i andra organ.

Dessa bilder representerar flera steg som krävs för att framgångsrikt använda trainable Weka segmentering för att minimera arbetsintensiva manuell mätning av ecDNA i fluorescerande färgade FFPE njurvävnad från en mus med inducerad anti-MPO GN. Dessa steg sammanfattas i figur 1 och figur 2 med bilder tagna direkt från Weka-segmenteringsprogrammet, som beskriver varje steg i analysprocessen. Mätningar från denna analys ...

Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Extracellulärt DNA (ecDNA) som frigörs under celldöd är proinflammatoriskt och bidrar till inflammation. Mätning av ecDNA på skadeplatsen kan bestämma effekten av terapeutisk behandling i målorganet. Detta protokoll beskriver användningen av ett verktyg för maskininlärning för att automatisera mätning av ecDNA i njurvävnad.

Övervakad maskininlärning för semikvantifiering av extracellulärt DNA i Glomerulonefrit

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Glomerulonefrit orsakar patologiska glomerular skada med avsevärd celldöd och extracellulära DNA release. Detta protokoll möjliggör visualisering av extracellulär DNA på platsen för frisättning under patologisk skada. Fördelen med denna teknik är att den mäter extracellulärt DNA från celldöd i njuren.I motsats till serum eller urin, extracellulär DNA-mätning är en surrogatmarkör för patologiska skador. Betydelsen av denna metod är att både den extracellulära DNA-färgningen och bildanalysen lätt kan överföras till andra autoimmuna sjukdomar som reumatoid artrit och lupus. Denna metod kräver en grundläggande kunskap om njurar histologi.För att möjliggöra en korrekt upptäckt av glomerulärt extracellulärt DNA måste forskaren kunna identifiera glomeruli på ett korrekt sätt. För extracellulär DNA-färgning, värm först proverna av intresse i ett glidställ i 60 grader Celsius i 60 minuter innan du puttrar objektglasen i två 40-minuters ändringar av lösningsmedel i en draghuv. Efter den andra nedsänkningen, rehydrera proverna två gånger i 100%etanol och en gång i 70%etanol i fem minuter per behandling.Efter den sista behandlingen, använd tång för att placera bilderna i kokande antigen hämtningslösning i en tryckkokare på hög i 10 minuter. Efter att ha avslöjat antigenepetoper, överför tryckkokaren från värme till en diskho och kör omedelbart kallt kranvatten över locket. Låt objektglasen ekvilliga under 20 minuter i antigenhämtningslösningen innan man tvättar proverna två gånger i 0,01 molar PBS på en orbitalskakare i fem minuter per tvätt.Efter den andra tvätten, använd en hydrofoba penna för att rita cirklar runt njure vävnadsprover och blockera alla ospecifika färgning med 60 mikroliter av 10%kyckling serum i 5%bovint serum albumin i 30 minuter vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, byt försiktigt ut blockeringslösningen med 60 mikroliter av den primära antikroppen av intresse i en fuktighetskammare över natten vid fyra grader Celsius. Nästa morgon, tvätta diabilderna på en orbital shaker i PBS i två minuter per tvätt innan du lägger till 60 mikroliter av en lämplig fluorophore konjugerad sekundär antikropp till varje objektglas för en 40-minuters inkubation vid rumstemperatur.I slutet av inkubationen, tvätta objektglasen i PBS som visats, följt av behandling i 0,3%Sudan svart i 70%etanol för att släcka eventuella potentiella formalin-inducerad autofluorescens. Efter 30 minuter, tvätta diabilderna i kranvatten för att ta bort eventuella fällning och doppa diabilderna i PBS i 10 minuter för att förhindra ytterligare Sudan svart fällning bildning. I slutet av inkubationen monterar du objektglasen på konfokala glasskyddsslips med tre 60 mikroliterdroppar av monteringslösning kompletterad med DAPI och täta täcklinerna med nagellack.Låt objektglasen bota i 24 timmar i rumstemperatur. Förvara dem i fyra grader Celsius skyddas från ljus tills bildframställning genom confocal laserscanning mikroskopi enligt standardprotokoll. Var noga med att täta täcken med nagellack för att förhindra rörelse under bildbehandling och för att rengöra täcken av etanol för att förbättra bildåtergivningsupplösningen.Efter bildbehandling 20 glomeruli per bild, öppna trainable Weka Segmentation plugin i ImageJ och släpp den första bilden på ImageJ verktygsfältet. Klicka på bild, färg och delningskanaler. En bild som visar den primära antikroppsfärgningen kommer att visas.Om du vill skapa en sammanslagen fil av de enstaka bilderna klickar du på färg och sammanfoga kanaler. En popup-ruta kommer att visas ber om en färg som skall tilldelas varje kanal. Markera rutorna skapa sammansatta och behåll källbilder och klicka på OK. En sammanslagen sammansatt bild kommer att visas.Använda den primära antikropp färgning som en guide, rita en region av intresse runt glomerular tuft. Om du vill utföra en Gaussisk oskärpa på den enda blå DAPI-bilden klickar du på process, filter och Gaussisk oskärpa. Ställ in oskärpan på ett till två.Bilden kommer att bli lite suddig, men kärnorna kommer att visas slät, bakgrunden kommer att mjukas upp. Därefter klickar du på plugins, segmentering och trainable Weka Segmentation, och använd gratis handverktyget för att spåra de intakta kärnorna. När alla kärnor av intresse har lagts till, rutan Lägg till klass ett, använd linjeverktyget för att avgränsa områdena bakgrund till rutan klass två.Klicka på Skapa ny klass och använd linjeverktyget för att beskriva det DAPI-färgade extranukleära DNA: t. Klicka på Träna klassificerare och få sannolikhet. Växla musen för att få en svartvit bild av alla komponenter med markeringsobjektet markerat i vitt.Om du vill duplicera den här bilden klickar du på bild och duplicerar. Justera och tröskelvärde under bild. Använd musknappen för att justera tröskeln tills endast det extracellulära DNA observerats.Efter tröskelvärden klickar du på process, binär och gör binärt, och kopierar den tidigare genererade glomerular regionen av intresse. Tryck på Kontrollskift E för att markera redigera, markeringar och återställa för att återställa markeringen. För att bara mäta de extracellulära DNA-partiklarna i glomerulus, klicka analysera partiklar och OK. Ett resultatblad som visar antalet partiklar, område, genomsnittliga pixlar och procent av glomeruli som innehåller extracellulärt DNA kommer att genereras.Om du vill spara klassificeraren som extracellulär DNA-klassificerare klickar du på save classifier och sparar data. Om du vill använda modellen på nytt på efterföljande bilder upprepar du den inledande bildbehandlingen som visas innan du väljer load classifier och den sparade klassificerarfilen. Loggmenyn kommer att dyka upp och köra modellen.När modellen har körts, klicka på ladda data och välj extracellularDNA.arff. Klicka sedan på skapa resultat. Om den resulterande bilden har misslyckats med att plocka upp alla kärnor, bakgrund eller extracellulära DNA, klicka på retrain klassificerare och lägga till fler klassificerare som behövs.Här visas enkanalsbilder som visar representativt DNA och beta aktinfärgning. Sammanslagning av de två bilderna gör att en region av intresse kan dras runt glomerular området för mätning av extracellulära DNA i musen njure glomeruli med hjälp av trainable Weka Segmentering som visas. Denna modell kan antas för att identifiera extracellulära DNA i njure biopsi exemplar från en kontroll patient eller jämförelse med en njure biopsi från en patient med myeloperoxidas ANCA-associerade vaskulit.Dessutom kan detta program översättas till andra fläckar inom njure vävnadsprover, till exempel för att fläcka för neutrofil extracellulära fällor och avsättningen av extracellulära myeloperoxidas i ANCA-associerade vaskulit. Viktigt, inga signifikanta skillnader observeras när samma data analyseras av flera användare. Det mest kritiska steget i analysen är att ge tillräckligt med exempel på bakgrund, kärnor och extracellulärt DNA med glomeruli som klassificerare för Weka Segmentering programmet att lära av.Denna metod är lätt överförbar. Till exempel kan ytterligare analys av de olika typerna av celldöd undersökas genom färgning för specifika antikroppar mot markörer för apoptos eller nekros. Vår teknik kan användas med andra inflammatoriska processer som att bedöma TLR uttryck i autoimmun njursjukdom eller extracellulära myeloperoxidas uttryck i mänskliga njurbiopsier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofila Extracellulär Fällor: Hur att generera och visualisera dem

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Utveckling av celltyp specifika anti-HIV gp120 aptamers för siRNA leverans

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Inrättande av en<em&gt; In vitro</em&gt; System för att studera intracellulära Beteende<em&gt; Candida glabrata</em&gt; I Human THP-1 makrofager

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Hög genomströmning Mätning av extracellulärt DNA utsläpp och Kvantitativ NET bildning i humana neutrofiler<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Propportionell Imaging av extracellulära pH i Tand Biofilmer

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder för att studera Lipidförändringarna i neutrofiler och efterföljande bildning av neutrofila Extracellulär Fällor

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

En enkel fluorescensanalys för kvantifiering av Canine neutrofila Extracellulär Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Identifiering av låg exemplar nummer integrerat virus-DNA bildas av In Vitro hepatit B-infektion

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...