Name: supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Nikon C1 dik konfokal lazer tarama mikroskobu ve böbrek dokusunun işlenmesi için Monash Histoloji Platformu'nun kullanımı için Monash Mikro Görüntüleme'yi kabul ediyoruz.

Bu yöntem, hücre ölümünün her türlü pan ekDNA'sının saptanmasını sağlar. Aynı yöntem ve antikorlar insan böbrek biyopsi stoyonu için de kullanılmaktadır (4. basamaktan). Tüm hayvan ve insan denekler Monash Üniversitesi'nden etik onayı aldı ve Monash Health, Clayton, Victoria, Avustralya.
1. DAPI ve β-Aktin ile ekDNA boyama
<ol><li>8-10 haftalık C57/Bl6 farelerde anti-miyeloperoksidaz glomerülonefrit (anti-MPO-GN) 20 günlük bir model indükleyinko...

<ol>
	<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis.">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection.">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+the+significance+of+apoptosis.">Cell death: the significance of apoptosis.</a> International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).</li><li>Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+one+way+to+die:+apoptosis,+necrosis+and+reactive+oxygen+damage.">More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage.</a> Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).</li><li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+its+role+in+inflammation.">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice.">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li><li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4++cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis.">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li><li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+in+natural+environments:+features,+relevance+and+applications.">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li><li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract.">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).</li><li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections.">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li><li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis.">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li><li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trainable+Weka+Segmentation:+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification.">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li><li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+a+Trap?+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology &amp; Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation,+endothelial+damage,+and+autoimmune+vasculitis.">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li><li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis.">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li></ol>

Glomerülonefritin hem hastaların serum hem de idrarında proinflamatuar belirteçleri ölçen çoklu protokoller mevcuttur. Bu açıklanan protokol, glomerulus içindeki hücre ölümü ürünlerinin (ecDNA, NETs ve ECMPO) doğrudan analizini sağlar. Bu protokoldeki en önemli adımlar doku hazırlama ve görüntülemedir. Analiz için floresan boyama yöntemi kullanarak önemli kısıtlayıcı unsur doku otofloresanolduğunu. Formalin sabit parafin dokusu belirli floresan boyama gizleyebilir otofloresan tabidir. Slay...

Myeloperoksidaz anti nötrofil sitoplazmik antikor ilişkili vaskülit (MPO-AAV) önemli hücre ölümü ve deoksiribonükleik asit salınımı ile patolojik glomerüler yaralanma böbrek yetmezliği ile sonuçlanan bir otoimmün hastalıktır (DNA)1,2. DNA bir tehlike sinyali gibi davranarak bağışıklık sistemini aktive edebilir. Normal sağlıklı koşullar altında, DNA'nın nükleer konumu bağışıklık sistemine maruz kalma koruma sağlar. Patojenik süreçler veya otoimmünite sırasında hücre dışı olarak salınan kendi KENDINE DNA bağışıklık sistemi tarafından moleküler öz protein (DAMP) ile ilişkili güçlü bir proinflamatuar hasar olarak görülür3. Ekstra hücresel DNA (ekDNA) apoptoz, nektoz nötrofil ekstrasellüler tuzak oluşumu (NET), nekroz veya piroptoz4,,5,6,7,8gibi farklı biyokimyasal yollar tarafından yönetilen çeşitli farklı mekanizmalar aracılığıyla ölmekte olan hücrelerden serbest bırakılır.
Burada, deneysel anti-MPO GN ve MPO-AAV9,hastalarından alınan böbrek biyopsilerinden formalin sabit parafin (FFPE) böbrekbölümlerinde ölmekte olan hücrelerden salınan ekDNA'yı boyama ve ölçme yöntemlerini tanımlıyoruz,10. Birden fazla yöntem çift iplikçikli DNA (dsDNA) ve DNA kompleksleri hem serum ve idrar ve in vitro tahliller11,,12dolaşan tespiti için var . Bu yöntemler, ekDNA miktarını belirlemede doğru olmakla birlikte, ekDNA'nın anatomik olarak nerede salınacağını belirlemez. Apoptoz için tunel ve hücre enkazı ölçümü13,14gibi ecDNA özel ölçüm açıklayan yöntemler vardır. Patolojik hasarın meydana geldiği FFPE böbreklerinde hücre ölümünün her türlüsden kaynaklanan ekDNA ölçümü ile sonuçlanan bir yöntem yoktur. Bu deneysel terapötik tedaviler gerçek hedef organpatolojik yaralanma sitelerinden ekDNA temizleyerek olup olmadığını belirlemek için önemlidir.
Böbrek örneklerinden birden fazla görüntü elde edilmesi, tek bir kullanıcı tarafından yaygın olarak analiz edilen yüksek hacimli veri oluşturur. Bu emek yoğun, zaman alıcı ve diğer kullanıcılar tarafından güvenilmez tekrarlanabilirlik tabi olabilir, kullanıcı önyargı nedeniyle. Trainable Weka segmentasyon machine learning algoritmaları15,16kullanarak piksel sınıflandırmak için kesme kenarı biyoinformatik araçları kullanan ImageJ için bir açık kaynak yazılım eklentisi . Bu yöntem, kullanıcının piksel segmentlerini sınıflandırmasından ders aldığı ve yeni öğrenilen sınıflandırmayı diğer görüntülere uyguladığı "eğitilebilir"dir. Bu yöntem, ImageJ programında, bir segmentteki her pikseli belirli bir "sınıfa" ait olarak "sınıflandırmak" için kullanılan ortak çözümleme araçlarına dayanır. Program "sınıflandırıcıları" öğrendikten sonra, aynı görüntü deki diğer benzer sınıflandırılmış bölümleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu model daha sonra kaydedilir ve aynı denemedeki diğer görüntü kümelerine uygulanır.
Böbrek kesitlerinde yerinde ekDNA'nın belirlenmesinin önündeki mevcut engeller formalinde fiksasyondan kaynaklanan endojen otofloresans ve görüntülerin emek yoğun analizidir. Burada bu otofloresansı nasıl bastırabileceğimizi, ekDNA'yı nasıl tespit edebileceğimizi ve ekDNA'nın yüksek iş elde ölçümü için denetimli makine öğrenimini nasıl kullanacağımızı burada açıklıyoruz. Biz daha önce ImageJ bir makro kullanarak NETs ve ekstrasellüler MPO (ecMPO) ölçümü yayınladık, şimdi denetlenen makine öğrenme1kullanarak bu yöntemlerin yarı otomasyon göstermek. Biz aynı görüntü içinde NETs ve ecMPO için alternatif bir leke sınıflandırmak için, makine öğrenme aracının adaptasyon yeteneğini göstermektedir. EcDNA, NET'lerin ve ecMPO'nun saptanması için burada açıklanan bu boyama yöntemleri, ekDNA, NETS ve ecMPO'nun romatoid artrit ve lupus gibi hastalıkların devamında rol oynadığı diğer katı organlara ve hastalıklara,18çevrilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2153</td>
			<td>5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-121468</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21441</td>
			<td>Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken sera</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5405</td>
			<td>Made up in 1%BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x60 mm</td>
			<td>Azerscientific</td>
			<td>ES0107222</td>
			<td>#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 30%, 70% and 100%</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>UN1170</td>
			<td>Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>NBF-500</td>
			<td>Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>J3800AM4</td>
			<td>Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti human/mouse MPO antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF3667</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosol</td>
			<td>Clini Pure</td>
			<td>CPL HISTOSOL 08</td>
			<td>Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>VECTOR Labs</td>
			<td>H-400</td>
			<td>Use to draw circle around kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab128086</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P38135</td>
			<td>0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>GSA-P2530738</td>
			<td>Purchased at local homeware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36962</td>
			<td>Apply drops directly to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab8227</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab5103</td>
			<td>Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining rack 24 slides</td>
			<td>ProScitech</td>
			<td>H4465</td>
			<td>Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>199664</td>
			<td>0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 10mM</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4661</td>
			<td>Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>XL005/20</td>
			<td>Must be use used in a fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

supervised machine learning for semi-quantification of extracellular dna in glomerulonephritis

Glomerüler hücre ölümü miyeloperoksidaz anti nötrofil sitoplazmik antikor ilişkili vaskülitin patolojik bir özelliğidir (MPO-AAV). Ekstrasellüler deoksiribonükleik asit (ekDNA) apoptoz, nekroz, nekroz, nötrofil ekstrasellüler tuzaklar (Nets) ve piroptoz gibi hücre ölümü farklı formları sırasında serbest bırakılır. Bu hücre ölümünün ölçümü, hücre ölümünün farklı biyokimyasal formlarını belirlemek için gerekli olan birkaç farklı biyobelirteçle zaman alıcıdır. EkDNA ölçümü genellikle serum ve idrarda böbrek hasarı için taşıyıcı anne olarak yapılır, patolojik yaralanmanın meydana geldiği gerçek hedef organda değil. Böbrekte ekDNA'nın araştırılmasındaki mevcut zorluk, hem deneysel hem de arşivlenmiş insan böbrek biyopsilerinde formalin sabit parafin gömülü doku (FFPE) yöntemlerinin olmamasıdır. Bu protokol FFPE dokusunda ekDNA için leke için gerekli adımların bir özetini sağlar (hem insan hem de murine), otofloresan sökmek ve kamuya açık kaynak ImageJ plugin eğitilebilir Weka segmentasyonu bir makine öğrenme aracı kullanarak ortaya çıkan görüntülerde ekDNA ölçmek. Eğitilebilir Weka segmentasyonu, programın ekDNA sınıflandırmayı öğrendiği glomerüli içinde ekDNA'ya uygulanır. Bu sınıflandırıcı sonraki elde edilen böbrek görüntüleri uygulanır, her bir görüntümanuel ek açıklamalar için ihtiyacı azaltarak. Eğitilebilir Weka segmentasyonunun uyarlanabilirliği, deneysel murine anti-MPO glomerülonefrit (GN) böbrek dokusunda, anti-MPO GN'ye ortak patolojik katkıda bulunan NET'leri ve ecMPO'yu tanımlamak için daha fazla gösterilmiştir. Bu yöntem, eğitilebilir Weka segmentasyon programının sağlıklı normal böbrek dokusu ile hastalıklı böbrek dokusu arasında ekDNA'yı ayırt edebilmesinin etkinliğini açıkça gösteren böbrek dokusundaki ekDNA'nın objektif analizini sağlar. Bu protokol diğer organlardaki ecDNA, NET ve ECMPO'ları tanımlamak için kolayca uyarlanabilir.

Bu görüntüler, floresan lekeli FFPE böbrek dokusunda ekDNA'nın emek yoğun manuel ölçümlerini en aza indirmek için eğitilebilir Weka segmentasyonunu başarıyla kullanmak için gereken birden fazla adımı temsil eder. Bu adımlar, analiz sürecindeki her adımı özetleyen, doğrudan Weka segmentasyon programından alınan görüntülerle Şekil 1 ve Şekil 2'de özetlenmiştir. Bu analizden elde edilen ölçümler, pr...

Watch this Scientific Journal Video about Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis at JoVE.com

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Hücre ölümü sırasında salınan ekstrasellüler DNA (ekDNA) proinflamatuar ve inflamasyona katkıda bulunur. Yaralanma yerinde ekDNA ölçümü hedef organda terapötik tedavinin etkinliğini belirleyebilir. Bu protokol böbrek dokusunda ekDNA ölçümü otomatikleştirmek için bir makine öğrenme aracı nın kullanımını açıklar.

Glomerülonefritte Hücre Dışı DNA'nın Yarı Nicelikselleştirilmesi için Denetimli Makine Öğrenimi

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Glomerülonefrit önemli hücre ölümü ve ekstrasellüler DNA salınımı ile patolojik glomerüler yaralanmaya neden olur. Bu protokol, patolojik yaralanma sırasında serbest bırakıldığı yerde hücre dışı DNA'nın görüntülenmesine olanak sağlar. Bu tekniğin avantajı böbrekhücre ölümü ekstrahücre DNA ölçer olmasıdır.Serum veya idrarın aksine, hücre dışı DNA ölçümü patolojik hasar için bir taşıyıcı belirteçtir. Bu yöntemin önemi hem ekstrasellüler DNA boyama ve görüntü analizi kolayca romatoid artrit ve lupus gibi diğer otoimmün hastalıklara aktarılabilir olmasıdır. Bu yöntem böbrek histolojisi temel bir bilgi gerektirir.Glomerüler ekstrasellüler DNA'nın doğru saptanmasını sağlamak için, araştırmacı glomeruli doğru tanımlamak gerekir. Hücre dışı DNA boyama için, ilk ısı 60 santigrat derece bir slayt raf ilgi örnekleri 60 dakika boyunca bir duman kaputuna çözücü iki 40 dakikalık değişiklikler slaytlar daldırma önce. İkinci daldırma sonra, tedavi başına beş dakika için% 100 etanol iki kez ve% 70 etanol bir kez rehydrate.Son tedaviden sonra, 10 dakika yüksek bir düdüklü tencerede kaynayan antijen alma çözeltisi içine slaytlar yerleştirmek için maşa kullanın. Antijen epitopsların maskesini attıktan sonra düdüklü tencereyi sıcaktan lavaboya aktarın ve hemen kapağın üzerinde soğuk musluk suyu çalıştırın. Slaytların, numuneleri 0,01 molar PBS'de iki kez yıkama başına beş dakika boyunca orbital shaker'da iki kez yıkamadan önce antijen alma çözeltisinde 20 dakika boyunca dengelemesine izin verin.İkinci yıkamadan sonra, böbrek dokusu örnekleri etrafında daire çizmek ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 sığır serum albumin% 10 tavuk serum 60 mikrolitre ile nonspesifik boyama engellemek için bir hidrofobik kalem kullanın. Kuluçka sonunda, bir gecede nem haznesinde 4 santigrat derecede birincil antikor 60 mikrolitre ile engelleme çözeltisi değiştirin. Ertesi sabah, oda sıcaklığında 40 dakikalık kuluçka için her slaytiçin uygun bir florofor konjuge ikincil antikor 60 mikrolitre eklemeden önce yıkama başına iki dakika PBS bir orbital shaker slaytlar yıkayın.Kuluçka sonunda, pbs slaytlar gösterildiği gibi yıkayın, herhangi bir potansiyel formalin indüklenen otofloresan söndürmek için% 70 etanol% 0.3 Sudan siyah tedavi izledi. 30 dakika sonra, herhangi bir çökelti kaldırmak için musluk suyunda slaytlar yıkayın ve daha fazla Sudan siyah çökelti oluşumunu önlemek için 10 dakika PBS slaytlar batırın. Kuluçka sonunda, dapi ile takviye montaj çözeltisi üç 60 mikrolitre damla ile konfokal cam kapakları üzerine slaytlar monte ve oje ile kapakları mühür.Slaytların oda sıcaklığında 24 saat boyunca tedavi etmesine izin verin. Standart protokollere göre konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüye kadar ışıktan korunan dört santigrat derecede saklayın. Görüntüleme sırasında herhangi bir hareketi önlemek ve görüntüleme çözünürlüğünü artırmak için etanol kapakları temizlemek için oje ile kapakları mühür emin olun.Slayt başına 20 glomeruli görüntüledikten sonra ImageJ'deki eğitilebilir Weka Segmentasyon eklentisini açın ve ilk görüntüyü ImageJ araç çubuğuna bırakın. Görüntü, renk ve bölünmüş kanalları tıklatın. Birincil antikor boyama gösteren bir görüntü görünür.Tek görüntülerin birleştirilmiş dosyasını oluşturmak için renk ve birleştirme kanallarını tıklatın. Bir açılır pencere kutusu, her kanala atanacak bir renk isteyen görünür. Bileşik oluştur'u işaretleyin ve kaynak resim kutularını tutun ve Tamam'ı tıklatın. Birleştirilmiş bileşik görüntü görüntülenir.Bir kılavuz olarak birincil antikor boyama kullanarak, glomerüler tuft etrafında ilgi bir bölge çizin. Tek mavi DAPI görüntüsünde Gaussian bulanıklığı gerçekleştirmek için işlem, filtreler ve Gaussian bulanıklığı tıklatın. Bulanıklığı 1'e iki olarak ayarlayın.Görüntü biraz bulanık olacak, ama çekirdekleri pürüzsüz görünecektir, arka plan yumuşamış olacak. Ardından, eklentileri, segmentasyonu ve eğitilebilir Weka Segmentasyon'u tıklatın ve bozulmamış çekirdekleri izlemek için serbest el aracını kullanın. İlgi çeken tüm çekirdekler eklendiğinde, birinci sınıf ekle kutusu, arka plan alanlarını sınıf iki kutusuna göre sınıflandırmak için satır aracını kullanın.Yeni sınıf oluştur'u tıklatın ve DAPI lekeli nükleer olmayan DNA'yı anahatlamak için satır aracını kullanın. Tren sınıflandırıcısı'nı tıklatın ve olasılık elde edin. Beyaz olarak vurgulanan seçim nesnesi ile tüm bileşenlerin siyah beyaz bir görüntü elde etmek için fareyi geçiş.Bu resmi çoğaltmak için resmi tıklatın ve çoğaltın. Görüntü altında, ayarlayın ve eşik. Yalnızca hücre dışı DNA gözlemlenene kadar eşiği ayarlamak için fare düğmesini kullanın.Eşik ten sonra, işlem, ikili tıklatın ve ikili yapmak ve ilgi daha önce oluşturulan glomerüler bölge kopyalayın. Düzenleme, seçim ve seçimi geri yüklemek için seçmek için Kontrol Kaydırma E tuşuna basın. Glomerulus içinde sadece hücre dışı DNA parçacıklarını ölçmek için, parçacıkları analiz ve Tamam'ı tıklatın. Parçacık sayısını, alanını, ortalama pikselleri ve hücre dışı DNA içeren glomerülin yüzdesini gösteren bir sonuç sayfası oluşturulacaktır.Sınıflandırıcıyı hücre dışı DNA sınıflandırıcısı olarak kaydetmek için sınıflandırıcıyı kaydet'i tıklatın ve verileri kaydedin. Modeli sonraki görüntülere yeniden uygulamak için, yük sınıflandırıcısı ve kaydedilen sınıflandırıcı dosyasını seçmeden önce gösterildiği gibi ilk görüntü işlemini tekrarlayın. Günlük menüsü açılır ve modeli çalıştırın.Model çalıştırdıktan sonra, yük verilerini tıklatın ve extracellularDNA.arff'ı seçin. Ardından sonuç oluştur'u tıklatın. Ortaya çıkan görüntü tüm çekirdekleri, arka planı veya hücre dışı DNA'yı almayı başaramadıysa, sınıflandırıcıyı yeniden eğit'i tıklatın ve gerektiğinde daha fazla sınıflandırıcı ekleyin.Burada temsili DNA ve beta aktin boyama gösteren tek kanallı görüntüler gösterilmiştir. İki görüntünün birleştirilmesi, gösterildiği gibi eğitilebilir Weka Segmentasyonu kullanılarak fare böbrek glomerüli içindeki hücre dışı DNA'nın ölçülmesi için glomerüler alanın etrafına ilgi çekici bir bölge çizilmesine olanak sağlar. Bu model, kontrol eden bir hastadan alınan böbrek biyopsisi örneklerindeki hücre dışı DNA'yı belirlemek veya miyeloperoksidaz ANCA ilişkili vaskülitli bir hastanın böbrek biyopsisi ile karşılaştırıldığında kabul edilebilir.Buna ek olarak, bu program böbrek dokusu örnekleri içinde diğer lekeler tercüme edilebilir, örneğin, nötrofil ekstrasellüler tuzaklar ve ANCA ilişkili vaskülit hücre dışı miyeloperoksidaz birikimi için leke. Daha da önemlisi, aynı veriler birden çok kullanıcı tarafından analiz edildiğinde önemli bir fark gözlenmez. Analizin en kritik adımı, Weka Segmentasyon programı için dersleştirici olarak glomeruli ile arka plan, çekirdekve hücre dışı DNA yeterli örnekler sunmaktır.Bu yöntem kolayca aktarılabilir. Örneğin, hücre ölümü farklı türleri daha fazla analiz apoptoz veya nekroz için belirteçleri karşı belirli antikorlar için boyama yoluyla araştırılabilir. Tekniğimiz otoimmün böbrek hastalığında TLR ekspresyonunun değerlendirilmesi veya insan böbrek biyopsilerinde hücre dışı miyeloperoksidaz ekspresyonu gibi diğer inflamatuar süreçlerde kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Diş Biyofilmler ekstraselüler pH rasyometrik Görüntüleme

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Algılama düşük kopya sayısı Vitro hepatit B enfeksiyonu tarafından kurulan entegre Viral DNA

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...