Name: measuring crop motility and food passaging in drosophila
Uploaded: 2020-05-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 31872287), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (NO. BK20181456) og Seks talent toppe projekt i Jiangsu-provinsen (Nr. SWYY-146).

1. Vedligeholdelse og forberedelse af forsøgsfluer
<ol><li>Vedligehold fluer i hætteglas indeholdende 10 ml frisklavet mad (1% agar, 2,4% ølgær, 3% saccharose, 5% majsmel) i en inkubator ved 25 °C med 60% fugtighed. Indstil inkubatorens lyscyklus til 12-h lys:12-h mørk.</li>
	<li>For at sikre, at et stort antal af de ønskede genotypefluer ekskluderer samtidigt, flyver kultur unge (1-3 dage gamle) i standardfødevarer med tørgær på overfladen i 3 dage. Overfør de voksne til en ny fødevare hætteglas med stan...

<ol>
	<li>Kusano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+motility+and+functional+gastrointestinal+diseases.">Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).</li><li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster.">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li><li>Apidianakis, Y., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+human+intestinal+infection+and+pathology.">Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).</li><li>Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digestive+Tract+of+Drosophila+melanogaster.">The Digestive Tract of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Physiology+of+the+Digestive+Tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+gastric+stem+cells+maintain+the+adult+Drosophila+stomach.">Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beadex+affects+gastric+emptying+in+Drosophila.">Beadex affects gastric emptying in Drosophila.</a> Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).</li><li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TORC1+inhibitor+Nprl2+protects+age-related+digestive+function+in+Drosophila.">The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila.</a> Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).</li><li>Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATOR1+Complex+Regulates+Metabolic+Homeostasis+and+the+Response+to+Nutrient+Stress+in+Drosophila+melanogaster.">The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (12), 3859-3867 (2016).</li><li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay.">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).</li><li>Diegelmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CApillary+FEeder+Assay+Measures+Food+Intake+in+Drosophila+melanogaster.">The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).</li><li>Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+feeding+behavior+in+adult+Drosophila+melanogaster+varies+with+feeding+regime+and+nutritional+state.">Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state.</a> Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).</li><li>Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+gut+function+in+drop-dead+mutant+Drosophila.">Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila.</a> Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).</li><li>Chtarbanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+C+virus+systemic+infection+leads+to+intestinal+obstruction.">Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).</li><li>Solari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+effects+of+5-HT/AKH+and+octopamine+on+the+crop+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster:+Evidence+of+a+double+brain-gut+serotonergic+circuitry.">Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry.</a> PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).</li></ol>

I Drosophila indtages mad bevæger sig fra afgrøden til tarmen for fordøjelsen. Under denne proces, er næringsstofferne absorberes, og affaldet er udvist ud af kroppen som afføring. Således, sammenligne mad indtagelse sammen med afføring udslyngning kan bruges til groft at vurdere hastigheden af fødevarer bevægelse i kroppen. Metoden til kapillær feeder (CAFE) er almindeligt anvendt til at måle mad indtagelse10,11. Metoden til afføring nummer ...

De fleste dyr har et fordøjelsesrør kaldet mave (GI) tarmkanalen til at absorbere energi og næringsstoffer fra miljøet. Den menneskelige mave-tarmkanalen er sammensat af fire dele: spiserøret, mave, tyndtarmen, og tyktarmen (tyktarmen). Mad passage fra maven til tarmen er afgørende for optagelse af næringsstoffer. Nogle effektorer, såsom aldring, giftige stoffer, og infektion, forårsage uordnede mave-tarmkanalen motilitet og gastrisk tømning, som er relateret til nogle sygdomme og deres symptomer såsom dyspepsi, gastroøsofageal refluks sygdom, og forstoppelse1.
Frugtfluen(Drosophila melanogaster)er et udbredt modeldyr i biomedicinsk forskning på grund af sin nemme genetiske manipulation. Vigtigere, omkring 77% af gener forbundet med sygdomme hos mennesker har en homolog i Drosophila2. Forskning ved hjælp af Drosophila har gjort enorme fremskridt i vores forståelse af mange sygdomsmekanismer. Som en kraftfuld genetisk model organisme, Drosophila er meget udbredt i mave-tarmkanalen forskning3. Drosophila har en enklere fordøjelseskanalen, som er opdelt i tre diskrete domæner: foregut, midgut, og hindgut4. Afgrøden, en del af foregut, er en pose-lignende struktur, der tjener som et sted for indtages opbevaring af fødevarer. Midgut er et langt rør og fungerer som stedet for fordøjelse af fødevarer og næringsstof absorption gennem epitellaget, som består af absorptive enterocytter (ECs) og sekretoriske enteroendokrine (EE) celler5. Interessant, maven funktion i Drosophila er opdelt i to dele: afgrøden fungerer som opbevaring af fødevarer og kobbercelle region (CCR) er en meget sur region med en pH < 36. I Drosophilaflyttes den indtagede mad i første omgang til afgrøden og pumpes derefter ind i midgut7. Således afgrøden spiller en afgørende rolle i fødevarer passaging. Indhyllet af viscerale muskler og bestående af en kompleks vifte af ventiler og lukkemuskel, afgrøden holder ordregivende og flytte mad ind i midgut for yderligere fordøjelse.
Denne protokol giver mulighed for påvisning af fødevarer bevægelse fra afgrøden til midgut i Drosophila. Beskæring evalueres ved at tælle afgrødesammentrækningsfrekvensen. Desuden undersøges afgrødens indvirkning på overpasning af fødevarer ved påvisning af fødevarefordelingen mellem afgrøde og tarm. Desuden kan fødevaredistributionen bruges til at afspejle øjeblikkelig fødevarebevægelse eller grundlæggende fødevarestatus ved hjælp af forskellige fodringsperioder. Tilsammen giver denne protokol metoder til hurtigt at evaluere afgrøde motilitet og mad passaging i Drosophila.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillant Blue FCF</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>E8500</td>
			<td>also called FD&#38;C Blue No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>Heraeus Pico 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Spectra Max</td>
			<td>cMax plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring crop motility and food passaging in drosophila

De fleste dyr bruger mave (GI) tarmkanalen til at fordøje mad. Bevægelsen af den indtagede mad i mave-tarmkanalen er afgørende for optagelse af næringsstoffer. Uorganiseret GI motilitet og gastrisk tømning forårsage flere sygdomme og symptomer. Som en kraftfuld genetisk model organisme, Drosophila kan bruges i GI motilitet forskning. Drosophila afgrøde er et organ, der kontrakter og flytter mad ind i midgut for yderligere fordøjelse, funktionelt ligner et pattedyr mave. Præsenteret er en protokol til at studere Drosophila afgrøde motilitet ved hjælp af simple måleværktøjer. En metode til optælling af afgrødesammentrækninger til vurdering af afgrødemotilitet og en metode til påvisning af fordelingen af fødevarer farvet blå mellem afgrøden og tarmen ved hjælp af et spektrofotometer til at undersøge afgrødens indvirkning på madpasning er beskrevet. Metoden blev anvendt til at påvise forskellen i afgrødemotilitet mellem kontrol- og nprl2-mutantfluer. Denne protokol er både omkostningseffektiv og meget følsom over for afgrøde motilitet.

Disse metoder til at tælle afgrøde sammentrækning sats og opdage farvet fødevarer distribution kan bruges til at evaluere afgrøde funktion på fødevarer motilitet. Afgrøden sammentrækning afspejler hyppigheden af at skubbe fødevarer i tarmen. Fordelingen af farvestof i fluen efter en kort fodringsperiode indikerer øjeblikkelig madpassaging fra afgrøde til midgut.
Mål for rapamycin kompleks 1 (TORC1) er en mester regulator, der formidler næringsstoffer og cellemetabolisme. TORC1 h?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila at JoVE.com

Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila

Målet med denne protokol er at måle afgrøde sammentrækning og kvantificere fødevaredistribution i Drosophila gut.

Måling af afgrødemotilitet og madpasaging i Drosophila

Most animals use the gastrointestinal (GI) tract to digest food. The movement of the ingested food in the GI tract is essential for nutrient absorption. ...

Denne metode bruges til at evaluere afgrøden motilitet ved at tælle afgrødesammentrækning og afsløre fødevarefordelingen i netop fordøjelsessystemet. Fordelen ved denne teknik er, at det hele tiden evaluerer afgrøde motilitet. Det er lave omkostninger og let at udføre.Denne metode gør det muligt at bruge bare fyldstof som model til at studere fordøjelsessystemet funktion på mad passager i mave-tarmkanalen. Hjælp til at demonstrere processen vil være Junmeng Xi, en kandidat studerende fra mit laboratorium. Der opretholdes fluer i hætteglas med 10 milliliter frisklavet mad i en 25 grader celsius inkubator med 60 % fugtighed og en 12 timers lys, 12 timers mørk cyklus.Sørg for, at et stort antal af ønsket fænotype flyver eclose samtidigt ved dyrkning unge fluer med standard mad med tør gær derefter overføre den voksne fluer til et hætteglas med våd gær og give to dage til æglægning. Lad æggene i rugemaskinen for at udvikle og overføre voksne fluer til et nyt hætteglas for at indsamle flere æg. Saml de e-lukkede han- eller hunfluer hver dag og kulturer dem i nye hætteglas med standardmad til den ønskede alder.Bedøve fluerne med kuldioxid og overføre en flue i en dissekere plade godt med 200 mikroliter af PBS. Tag fat i fluen ved brystkassen med en pincet og åbn brystkassen med et andet par pincet, og træk derefter enderne i modsatte retninger for at åbne maven. Tag forsigtigt afgrøden og tarmen ud af kroppen og vent på, at fluen vågner.Når fluen er vågen, skal du tælle antallet af gange afgrødekontrakterne på et minut. Gentag sammentrækningsoptællingen fem gange og venter 30 sekunder mellem hver optælling. Den blå farve og opløsning i PBS afvejes ved en koncentration på 20 %.Rør det derefter ind i den kogte flydende vedligeholdelsesfoder til en endelig koncentration på 5% under fødevarekølingsprocessen. Efter at have holdt fluer i hætteglas med sult mad i fire timer, overføre dem til nye hætteglas med farvet mad og kultur dem for den ønskede tid, under hensyntagen til, at under vedligeholdelse betingelser maden passerer gennem fluen i omkring to timer. Overfør en bedøvet flue i en dissekerende plade brønd indeholdende 200 mikroliter PBS.Brug pincet til at gribe fluen ved brystkassen og fjern hovedet med et andet par pincet, derefter overføre kroppen til en ny brønd med PBS og vaske det med blid rysten for at fjerne farvestoffet fastgjort til kroppen. Åbn maven med to pincet og forsigtigt adskille hele tarmen fra kroppen. Tag afgrøden ud af hele tarmen og læg den i et rør med 100 mikroliter PBS.Læg resten af tarmen i et andet rør med 100 mikroliter PBS, og brug derefter pipettespidserne til at slibe afgrøden og tarmen og opløse farvestoffet i PBS. Gentag dissektionen, indtil der indsamles nok afgrøder og indvolde. Efter indsamling af prøverne centrifuger rørene ved den højeste hastighed i et minut og overføres 90 mikroliter supernatant til brønd af en 96 brøndplade.Lav en række standard blå farvestof fortyndinger i koncentrationer fra en gange 10 til 7 til 10 til 4th gram pr milliliter og tilføje dem til brøndene. Absorbansen måles ved 630 nanometer i brøndene, og brug standardmålingerne til at afbilde en kurvegraf af absorbans vs. farvestofkoncentration. Brug derefter kurven til at beregne farvestoffet koncentrationen af prøverne.Den afgrøde motilitet assay blev brugt til at tælle afgrøde sammentrækninger på tre dage gamle NPRL mutant fluer og genetiske baggrund kontrol. Mutationen viste sig at reducere hastigheden af afgrødesammentrækningen betydeligt. For yderligere at bekræfte NPRL2's funktion på afgrøden blev fødevarebevægelsen påvist ved at fodre farvede fødevarer til fluerne.Alle fluer havde lignende mængder farvestof i afgrøden, men NPRL2 fluerne havde mindre farvestof i tarmen, som kan være forbundet med den reducerede afgrødesammentrækning. Når du skriver denne protokol, skal du sørge for, at afgrøden forbliver kontakt til kroppen, og fluen er i live og vågen. Ellers vil afgrøden miste evnen til at indgå kontrakt.Under dissektionsprocessen skal afgrøden og tarmen være i kontakt. Hvis farvestoffet siver ind i dissektionsmediet, kan prøven ikke længere anvendes. Lad os bare fylde vores appetit og mad udslyngning inden for kort tid kan også evalueres ved at opdage farvestof beløb i hele tarmen.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

Passage af Hues humane embryonale stamceller-linjer med Trypsin

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Catheterization of Intestinal Loops in Ruminants

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Levende Imaging af Apoptotisk Cell Clearance under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Måling Glutathion-induceret Fodring respons i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualisering og sporing endogene mRNAs i levende Drosophila melanogaster ægge kamre

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...