Name: measuring crop motility and food passaging in drosophila
Uploaded: 2020-05-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31872287), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (NO. BK20181456) en Six talent peaks project in jiangsu provincie (nr. SWYY-146).

1. Onderhoud en voorbereiding van experimentele vliegen
<ol><li>Houd vliegen in flesjes met 10 mL vers gemaakt voedsel (1% agar, 2,4% biergist, 3% sacharose, 5% maïsmeel) in een couveuse bij 25 °C met 60% vochtigheid. Stel de lichtcyclus van de couveuse in op 12-uur licht:12-h donker.</li>
	<li>Om ervoor te zorgen dat een groot aantal van de gewenste genotype vliegt gelijktijdig afgesloten, cultuur jonge vliegen (1−3 dagen oud) in standaard voedsel met droge gist op het oppervlak voor 3 dagen. Breng de volwassenen ...

<ol>
	<li>Kusano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+motility+and+functional+gastrointestinal+diseases.">Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).</li><li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster.">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li><li>Apidianakis, Y., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+human+intestinal+infection+and+pathology.">Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).</li><li>Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digestive+Tract+of+Drosophila+melanogaster.">The Digestive Tract of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Physiology+of+the+Digestive+Tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+gastric+stem+cells+maintain+the+adult+Drosophila+stomach.">Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beadex+affects+gastric+emptying+in+Drosophila.">Beadex affects gastric emptying in Drosophila.</a> Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).</li><li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TORC1+inhibitor+Nprl2+protects+age-related+digestive+function+in+Drosophila.">The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila.</a> Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).</li><li>Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATOR1+Complex+Regulates+Metabolic+Homeostasis+and+the+Response+to+Nutrient+Stress+in+Drosophila+melanogaster.">The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (12), 3859-3867 (2016).</li><li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay.">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).</li><li>Diegelmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CApillary+FEeder+Assay+Measures+Food+Intake+in+Drosophila+melanogaster.">The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).</li><li>Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+feeding+behavior+in+adult+Drosophila+melanogaster+varies+with+feeding+regime+and+nutritional+state.">Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state.</a> Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).</li><li>Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+gut+function+in+drop-dead+mutant+Drosophila.">Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila.</a> Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).</li><li>Chtarbanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+C+virus+systemic+infection+leads+to+intestinal+obstruction.">Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).</li><li>Solari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+effects+of+5-HT/AKH+and+octopamine+on+the+crop+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster:+Evidence+of+a+double+brain-gut+serotonergic+circuitry.">Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry.</a> PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).</li></ol>

In Drosophila ingenomen voedsel beweegt van het gewas naar de darm voor de spijsvertering. Tijdens dit proces worden de voedingsstoffen geabsorbeerd en wordt het afval als uitwerpselen uit het lichaam verdreven. Zo kan het vergelijken van voedselinname samen met uitwerping van uitwerping van uitwerping van voedsel worden gebruikt om de snelheid van voedselbeweging in het lichaam ruwweg te beoordelen. De methode van capillaire feeder (CAFE) wordt veel gebruikt om voedselopname10,</sup...

De meeste dieren hebben een spijsverteringsbuis genaamd het maag-darmkanaal (GI) om energie en voedingsstoffen uit de omgeving te absorberen. Het menselijke DARMKANAAL bestaat uit vier delen: de slokdarm, maag, dunne darm en dikke darm (dikke darm). Voedselpassage van de maag naar de darm is essentieel voor de opname van voedingsstoffen. Sommige effectoren, zoals veroudering, toxische drugs, en infectie, veroorzaken wanordelijke GI tract motility en maaglediging, die gerelateerd is aan sommige ziekten en hun symptomen zoals dyspepsie, gastro-oesofageale reflux ziekte, en constipatie1.
De fruitvlieg(Drosophila melanogaster)is een veel gebruikt modeldier in biomedisch onderzoek vanwege zijn eenvoudige genetische manipulatie. Belangrijk is dat ongeveer 77% van de genen geassocieerd met menselijke ziekte een homolog heeft in Drosophila2. Onderzoek met drosophila heeft enorme vooruitgang geboekt in ons begrip van vele ziektemechanismen. Als een krachtig genetisch model organisme, Drosophila wordt veel gebruikt in GI tract onderzoek3. Drosophila heeft een eenvoudiger spijsverteringskanaal, dat is verdeeld in drie afzonderlijke domeinen: voorgedeïntegreert, midgut, en hindgut4. Het gewas, een deel van de voorbegroe, is een zak-achtige structuur die dient als een site voor ingenomen voedselopslag. De midgut is een lange buis en functioneert als de site voor voedselvertering en opname van voedingsstoffen door de epitheellaag, die bestaat uit absorptieve enterocyten (ECs) en secretory enteroendocrine (EE) cellen5. Interessant is dat de maagfunctie in Drosophila is verdeeld in twee delen: het gewas functioneert als voedselopslag en het kopercelgebied (CCR) is een zeer zure regio met een pH < 36. In Drosophilawordt het ingenomen voedsel in eerste instantie naar het gewas verplaatst en vervolgens in de midgut7 gepompt. Zo speelt het gewas een cruciale rol in voedsel passaging. Gehuld door viscerale spieren en bestaande uit een complexe reeks kleppen en sluitspieren, het gewas houdt aanbestedende en bewegende voedsel in de midgut voor verdere spijsvertering.
Dit protocol maakt het mogelijk om voedselbewegingen te detecteren van het gewas naar de midgut in Drosophila. De krimp van gewassen wordt geëvalueerd door de frequentie van de gewascontractie te tellen. Daarnaast wordt het effect van het gewas op voedselpassaging onderzocht door de voedselverdeling tussen gewas en darmen op te sporen. Bovendien kan de voedseldistributie worden gebruikt om onmiddellijke voedselbeweging of basisvoedselstatus met behulp van verschillende voedingsperioden weer te geven. Samen, dit protocol biedt methoden om snel te evalueren gewas beweeglijkheid en voedsel passaging in Drosophila.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillant Blue FCF</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>E8500</td>
			<td>also called FD&#38;C Blue No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>Heraeus Pico 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Spectra Max</td>
			<td>cMax plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring crop motility and food passaging in drosophila

De meeste dieren gebruiken het maag-darmkanaal (GI) om voedsel te verteren. De beweging van het ingenomen voedsel in het DARM-darmkanaal is essentieel voor de opname van voedingsstoffen. Wanordelijke GI beweeglijkheid en maaglediging veroorzaken meerdere ziekten en symptomen. Als een krachtig genetisch model organisme, Drosophila kan worden gebruikt in GI beweeglijkheid onderzoek. De Drosophila gewas is een orgaan dat contracten en beweegt voedsel in de midgut voor verdere spijsvertering, functioneel vergelijkbaar met een zoogdier maag. Gepresenteerd is een protocol om Drosophila gewas beweeglijkheid te bestuderen met behulp van eenvoudige meetinstrumenten. Een methode voor het tellen van gewascontracties om de beweeglijkheid van gewassen te evalueren en een methode voor het detecteren van de verdeling van voedsel dat blauw geverfd wordt tussen het gewas en de darm met behulp van een spectrofotometer om het effect van het gewas op voedselpassages te onderzoeken, wordt beschreven. De methode werd gebruikt om het verschil in gewasmotiliteit tussen controle en nprl2 mutant vliegen te detecteren. Dit protocol is zowel kostenefficiënt als zeer gevoelig voor begroeiing.

Deze methoden om gewas contractie tarief tellen en detecteren geverfd voedsel distributie kan worden gebruikt om gewas functie op voedsel beweeglijkheid te evalueren. De gewascontractie weerspiegelt de frequentie van het duwen van voedsel in de darm. De verdeling van kleurstof in de vlieg na een korte voedingsperiode geeft aan dat er onmiddellijk voedsel wordt doorgegeven van gewas tot midgut.
Doelwit van rapamycine complex 1 (TORC1) is een meester regulator die voedingsstoffen en celstofwisse...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila at JoVE.com

Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila

Het doel van dit protocol is om gewascontractie te meten en de voedseldistributie in de Drosophila darm te kwantificeren.

Het meten van bemotiliteit en voedselpassaging in Drosophila

Most animals use the gastrointestinal (GI) tract to digest food. The movement of the ingested food in the GI tract is essential for nutrient absorption. ...

Deze methode wordt gebruikt om de bemotilheid van het gewas te evalueren door het tellen van gewascontractie en het opsporen van de voedseldistributie in enkel de spijsvertering. Het voordeel van deze techniek is dat het voortdurend evalueert gewas beweeglijkheid. Het is goedkoop en gemakkelijk uit te voeren.Deze methode maakt het mogelijk om alleen filler te gebruiken als een model om de spijsvertering te bestuderen op de voedselpassages in het maag-darmkanaal. Helpen om het proces te demonstreren zal Junmeng Xi, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Onderhoud vliegen in flesjes met 10 milliliter vers gemaakt voedsel in een 25 graden Celsius incubator met 60% vochtigheid en een 12 uur licht, 12 uur donkere cyclus.Zorg ervoor dat een groot aantal van de wens fenotype vliegt gelijktijdig afsluiten door het kweken van jonge vliegen met standaard voedsel met droge gist dan de overdracht van de volwassen vliegen naar een flesje met natte gist en laat twee dagen voor het leggen van eieren. Laat de eieren in de couveuse om volwassen vliegen te ontwikkelen en over te brengen naar een nieuw flesje om meer eieren te verzamelen. Verzamel de eclosed mannelijke of vrouwelijke vliegen elke dag en cultuur ze in nieuwe flesjes met standaard voedsel aan de gewenste leeftijd.Verdoven de vliegen met kooldioxide en breng één vlieg in een ontledende plaat goed met 200 microliters van PBS over. Grijp de vlieg op zijn thorax met een pincet en open de thorax met een ander pincet en trek de uiteinden in tegengestelde richting om de buik te openen. Haal voorzichtig het gewas en de darm uit het lichaam en wacht tot de vlieg wakker wordt.Wanneer de vlieg wakker is, telt u het aantal keren dat het gewas in één minuut samentrekt. Herhaal de samentrekking tellen vijf keer, wachten 30 seconden tussen elke telling. Weeg de blauwe kleurstof af en los deze op in PBS bij een concentratie van 20%.Roer het vervolgens in het gekookte vloeibare onderhoudsvoedsel tot een uiteindelijke concentratie van 5%tijdens het voedselkoelingsproces. Na het houden van vliegen in flesjes met honger voedsel voor vier uur, breng ze in nieuwe flesjes met de geverfde voedsel en cultuur hen voor de gewenste tijd, rekening houdend met het feit dat bij onderhoud voorwaarden het voedsel passeert de vlieg in ongeveer twee uur. Breng een verdoofde vlieg in een ontleden plaat goed met 200 microliters van PBS.Gebruik een pincet om de vlieg te grijpen op de thorax en verwijder het hoofd met een ander paar pincet, dan breng het lichaam naar een nieuwe put met PBS en was het met zachte schudden om de kleurstof aan het lichaam te verwijderen. Open de buik met twee pincet en zorgvuldig scheiden van de hele darm van het lichaam. Haal het gewas van de hele darm en doe het in een buis met 100 microliter PBS.Doe de rest van de darm in een andere buis met 100 microliters van PBS gebruik dan pipet tips om het gewas en de darm te malen en de kleurstof op te lossen in PBS. Herhaal de dissectie totdat er voldoende gewassen en ingewanden worden verzameld. Na het verzamelen van de monsters, centrifugeren de buizen op de hoogste snelheid voor een minuut en breng 90 microliter van supernatant goed van een 96 put plaat.Maak een reeks van standaard blauwe kleurstof verdunningen bij concentraties van een keer 10 tot de 7 tot 10 tot de 4e gram per milliliter en voeg ze toe aan de putten. Meet de absorptie op 630 nanometer van de putten en gebruik de standaardmetingen om een lijngrafiek van absorptie vs kleurstofconcentratie in kaart te brengen. Gebruik vervolgens de curve om de kleurstofconcentratie van de monsters te berekenen.De gewasmotiliteitstest werd gebruikt om gewascontracties te tellen op drie dagen oude NPRL mutantvliegen en genetische achtergrondcontroles. De mutatie bleek de snelheid van gewascontractie aanzienlijk te verminderen. Om de functie van NPRL2 op het gewas verder te bevestigen, werd voedselbeweging gedetecteerd door geverfd voedsel aan de vliegen te voeren.Alle vliegen hadden vergelijkbare hoeveelheden kleurstof in het gewas, maar de NPRL2 vliegen had minder kleurstof in de darm die kan worden geassocieerd met de verminderde gewas contractie tarief. Bij het typen van dit protocol, zorg ervoor dat het gewas blijft contact met het lichaam en de vlieg is levend en wakker. Anders verliest het gewas de mogelijkheid om te contracteren.Tijdens het ontledingsproces moeten het gewas en de darm in contact zijn. Als kleurstof lekt in het dissectiemedium, kan het monster niet meer worden gebruikt. Laten we gewoon vullen onze eetlust en het uitwerpen van voedsel binnen een korte tijd kan ook worden geëvalueerd door het opsporen van de kleurstof hoeveelheid in de hele darm.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

Passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Passaging Human Neural Stem Cells

Passage menselijke neurale stamcellen

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Isolatie van Protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Catheterization of Intestinal Loops in Ruminants

Catheterisatie van de intestinale Loops bij herkauwers

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Gastro-intestinale motiliteit Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Meten-Glutathion geïnduceerde Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...