Name: measuring crop motility and food passaging in drosophila
Uploaded: 2020-05-09T14:30:00
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Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (no 31872287), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (NO. BK20181456) et six sommets de talents dans la province du Jiangsu (No. SWYY-146).

1. Entretien et préparation des mouches expérimentales
<ol><li>Maintenir les mouches dans des flacons contenant 10 mL d’aliments fraîchement faits (1% d’agar, 2,4% de levure de bière, 3% de saccharose, 5% de semoule de maïs) dans un incubateur à 25 °C avec 60% d’humidité. Réglez le cycle de lumière de l’incubateur à 12 h de lumière: 12-h sombre.</li>
	<li>Pour s’assurer qu’un grand nombre de génotype désiré vole des ecloses simultanément, les jeunes mouches de culture (1−3 jours) dans les ...

<ol>
	<li>Kusano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+motility+and+functional+gastrointestinal+diseases.">Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).</li><li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster.">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li><li>Apidianakis, Y., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+human+intestinal+infection+and+pathology.">Drosophila melanogaster as a model for human intestinal infection and pathology.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (1), 21-30 (2011).</li><li>Lemaitre, B., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digestive+Tract+of+Drosophila+melanogaster.">The Digestive Tract of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review of Genetics. 47, 377-404 (2013).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+Physiology+of+the+Digestive+Tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and Physiology of the Digestive Tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+gastric+stem+cells+maintain+the+adult+Drosophila+stomach.">Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beadex+affects+gastric+emptying+in+Drosophila.">Beadex affects gastric emptying in Drosophila.</a> Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).</li><li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TORC1+inhibitor+Nprl2+protects+age-related+digestive+function+in+Drosophila.">The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila.</a> Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).</li><li>Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATOR1+Complex+Regulates+Metabolic+Homeostasis+and+the+Response+to+Nutrient+Stress+in+Drosophila+melanogaster.">The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (12), 3859-3867 (2016).</li><li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay.">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).</li><li>Diegelmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CApillary+FEeder+Assay+Measures+Food+Intake+in+Drosophila+melanogaster.">The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).</li><li>Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+feeding+behavior+in+adult+Drosophila+melanogaster+varies+with+feeding+regime+and+nutritional+state.">Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state.</a> Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).</li><li>Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+gut+function+in+drop-dead+mutant+Drosophila.">Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila.</a> Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).</li><li>Chtarbanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+C+virus+systemic+infection+leads+to+intestinal+obstruction.">Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).</li><li>Solari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+effects+of+5-HT/AKH+and+octopamine+on+the+crop+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster:+Evidence+of+a+double+brain-gut+serotonergic+circuitry.">Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry.</a> PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).</li></ol>

Dans Drosophila ingéré les aliments se déplace de la culture à l’intestin pour la digestion. Au cours de ce processus, les nutriments sont absorbés, et les déchets sont expulsés hors du corps comme excréments. Ainsi, la comparaison de l’ingestion de nourriture avec l’éjection des excréments peut être utilisée pour évaluer grossièrement la vitesse du mouvement des aliments dans le corps. La méthode de la mangeoire capillaire (CAFE) est largement utilisée pour mesurer l’ingestion de nourrit...

La plupart des animaux ont un tube digestif appelé le tractus gastro-intestinal (GI) pour absorber l’énergie et les nutriments de l’environnement. Le tractus gastro-intestinal humain est composé de quatre parties : l’œsophage, l’estomac, l’intestin grêle et le gros intestin (côlon). Le passage des aliments de l’estomac à l’intestin est essentiel pour l’absorption des nutriments. Certains effecteurs, tels que le vieillissement, les médicaments toxiques, et l’infection, causent la motilité désordonnée de tractus gastro-intestinal et la vidange gastrique, qui est liée à certaines maladies et leurs symptômes tels que la dyspepsie, la maladie de reflux gastro-esophagien, et la constipation1.
La mouche des fruits (Drosophila melanogaster) est un animal modèle largement utilisé dans la recherche biomédicale en raison de sa manipulation génétique facile. Fait important, environ 77% des gènes associés à la maladie humaine ont un homologue dans Drosophila2. La recherche utilisant Drosophila a fait d’énormes progrès dans notre compréhension de nombreux mécanismes de la maladie. En tant qu’organisme modèle génétique puissant, Drosophila est largement utilisé dans la recherche sur les voiesgastro-intestinales 3. Drosophila a un tube digestif plus simple, qui est divisé en trois domaines distincts: foregut, midgut, et hindgut4. La culture, une partie de l’avant-goût, est une structure en forme de sac qui sert de site pour le stockage des aliments ingérés. Le midgut est un long tube et fonctionne comme le site pour la digestion des aliments et l’absorption des nutriments à travers la couche épithéliale, qui se compose d’entérocytes absorptives (EC) et des cellules entéroendocrines sécrétoires (EE)5. Fait intéressant, la fonction de l’estomac dans Drosophila est divisé en deux parties: la culture fonctionne comme stockage des aliments et la région des cellules de cuivre (CCR) est une région très acide avec un pH < 36. Dans Drosophila, les aliments ingérés sont d’abord déplacés à la culture et par la suite pompé dans le midgut7. Ainsi, la culture joue un rôle essentiel dans le passage des aliments. Enveloppée par des muscles viscéraux et composée d’un ensemble complexe de valves et de sphincters, la culture continue de se contracter et de déplacer les aliments dans le midgut pour une digestion ultérieure.
Ce protocole permet de détecter le mouvement des aliments de la culture au midgut dans Drosophila. La contraction des cultures est évaluée en comptant la fréquence de contraction des cultures. En outre, l’effet de la culture sur le passage des aliments est étudié en détectant la distribution des aliments entre les cultures et l’intestin. En outre, la distribution de nourriture peut être utilisée pour refléter le mouvement alimentaire immédiat ou l’état alimentaire de base en utilisant différentes périodes d’alimentation. Pris ensemble, ce protocole fournit des méthodes pour évaluer rapidement la motilité des cultures et le passage des aliments dans Drosophila.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillant Blue FCF</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>E8500</td>
			<td>also called FD&#38;C Blue No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>Heraeus Pico 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Spectra Max</td>
			<td>cMax plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring crop motility and food passaging in drosophila

La plupart des animaux utilisent le tractus gastro-intestinal (IG) pour digérer les aliments. Le mouvement des aliments ingérés dans le tractus gastro-intestinal est essentiel pour l’absorption des nutriments. La motilité gastro-intestinale désordonnée et la vidange gastrique causent de multiples maladies et symptômes. En tant qu’organisme modèle génétique puissant, Drosophila peut être utilisé dans la recherche sur la motilité GI. La culture de Drosophila est un organe qui contracte et déplace la nourriture dans le midgut pour une digestion plus poussée, fonctionnellement semblable à un estomac de mammifères. Présenté est un protocole pour étudier la motilité des cultures Drosophila à l’aide d’outils de mesure simples. Une méthode de comptage des contractions des cultures pour évaluer la motilité des cultures et une méthode de détection de la distribution de la nourriture teint en bleu entre la culture et l’intestin à l’aide d’un spectrophotomètre pour étudier l’effet de la culture sur le passage des aliments est décrite. La méthode a été utilisée pour détecter la différence de motilité des cultures entre le contrôle et les mouches mutantes nprl2. Ce protocole est à la fois rentable et très sensible à la motilité des cultures.

Ces méthodes pour compter le taux de contraction des cultures et détecter la distribution d’aliments teints peuvent être utilisées pour évaluer la fonction des cultures sur la motilité alimentaire. La contraction des cultures reflète la fréquence de pousser les aliments dans l’intestin. La distribution de colorant à la mouche après une courte période d’alimentation indique un passage immédiat des aliments de la culture au midgut.
Target of rapamycin complex 1 (TORC1) est un r...

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Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila

L’objectif de ce protocole est de mesurer la contraction des cultures et de quantifier la distribution alimentaire dans l’intestin de Drosophila.

Mesure de la motilité des cultures et de la passation de nourriture à Drosophila

Most animals use the gastrointestinal (GI) tract to digest food. The movement of the ingested food in the GI tract is essential for nutrient absorption. ...

Cette méthode est utilisée pour évaluer la motilité des cultures en comptant la contraction des cultures et en détectant la distribution des aliments dans le digestif. L’avantage de cette technique est qu’elle évalue continuellement la motilité des cultures. C’est peu coûteux et facile à exécuter.Cette méthode permet d’utiliser juste remplissage comme un modèle pour étudier la fonction digestive sur les passages alimentaires dans le tractus gastro-intestinal. Junmeng Xi, un étudiant diplômé de mon laboratoire, aidera à démontrer le processus. Maintenir les mouches dans des flacons contenant 10 millilitres d’aliments fraîchement faits dans un incubateur de 25 degrés Celsius avec 60% d’humidité et une lumière de 12 heures, 12 heures de cycle sombre.Assurez-vous qu’un grand nombre de mouches phénotype désir eclos simultanément en culturant les jeunes mouches avec des aliments standard avec de la levure sèche, puis transférer les mouches adultes à un flacon avec de la levure humide et laisser deux jours pour la ponte. Laissez les œufs dans l’incubateur pour développer et transférer les mouches adultes dans un nouveau flacon pour recueillir plus d’œufs. Recueillir les mouches mâles ou femelles eclosed chaque jour et les culture dans de nouveaux flacons avec des aliments standard à l’âge désiré.Anesthésier les mouches avec du dioxyde de carbone et transférer une mouche dans une plaque de dissectation bien avec 200 microlitres de PBS. Saisissez la mouche à son thorax avec une paire de pinces à épiler et ouvrez le thorax avec une autre paire de pinces puis tirez les extrémités dans des directions opposées pour ouvrir l’abdomen. Prenez soigneusement la récolte et l’intestin hors du corps et attendez que la mouche se réveille.Lorsque la mouche est éveillée, comptez le nombre de fois que les contrats de culture sont conclus en une minute. Répétez la contraction en comptant cinq fois, en attendant 30 secondes entre chaque décompte. Peser le colorant bleu et le dissoudre dans PBS à une concentration de 20%.Puis remuer dans les aliments bouillis d’entretien liquide à une concentration finale de 5% pendant le processus de refroidissement des aliments. Après avoir gardé les mouches dans des flacons avec de la nourriture affamée pendant quatre heures, transférez-les dans de nouveaux flacons avec la nourriture et la culture des aliments et de la culture pour le temps désiré, en gardant à l’esprit que dans des conditions d’entretien de la nourriture passe par la mouche en environ deux heures. Transférer une mouche anesthésiée dans un puits de plaque disséquant contenant 200 microlitres de PBS.Utilisez des pinces à épiler pour saisir la mouche au thorax et enlever la tête avec une autre paire de pinces à épiler, puis transférer le corps à un nouveau puits avec PBS et le laver avec des secousses douces pour enlever le colorant attaché au corps. Ouvrez l’abdomen avec deux pinces à épiler et séparez soigneusement tout l’intestin du corps. Enlever la récolte de tout l’intestin et la mettre dans un tube avec 100 microlitres de PBS.Mettez le reste de l’intestin dans un autre tube avec 100 microlitres de PBS, puis utilisez des pointes de pipette pour moudre la culture et l’intestin et dissoudre le colorant dans PBS. Répétez la dissection jusqu’à ce que suffisamment de cultures et d’intestins soient recueillis. Après avoir prélevé les échantillons, centrifugez les tubes à la vitesse la plus élevée pendant une minute et transférez 90 microlitres de supernatant au puits d’une plaque de puits de 96 puits.Faire une série de dilutions de colorant bleu standard à des concentrations d’une fois 10 à 7 à 10 au 4e grammes par millilitre et les ajouter aux puits. Mesurez l’absorption à 630 nanomètres des puits et utilisez les mesures standard pour tracer un graphique linéaire de l’absorption par rapport à la concentration de colorants. Ensuite, utilisez la courbe pour calculer la concentration de colorant des échantillons.L’analyse de motilité des cultures a été utilisée pour compter les contractions des cultures sur les mouches mutantes NPRL vieilles de trois jours et les contrôles génétiques de fond. La mutation s’est trouvée pour diminuer de manière significative le taux de contraction de récolte. Afin de confirmer davantage la fonction de NPRL2 sur la culture, le mouvement des aliments a été détecté en alimentant les mouches en les alimentant.Toutes les mouches avaient des quantités similaires de colorant dans la culture, mais les mouches NPRL2 avaient moins de colorant dans l’intestin, ce qui peut être associé à la diminution du taux de contraction des cultures. Lorsque vous tapez ce protocole, assurez-vous que la culture reste en contact avec le corps et que la mouche est vivante et éveillée. Dans le cas contraire, la récolte perdra la capacité de se contracter.Pendant le processus de dissection, la culture et l’intestin doivent être en contact. Si le colorant s’écoule dans le milieu de dissection, l’échantillon ne peut plus être utilisé. Remplissons simplement notre appétit et l’éjection alimentaire dans un court laps de temps peut également être évaluée en détectant la quantité de colorant dans l’intestin entier.

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