Name: measuring crop motility and food passaging in drosophila
Uploaded: 2020-05-09T14:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31872287), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (NO. BK20181456) e sei picchi di talenti progetto nella provincia di Jiangsu (n. SWYY-146).

1. Mantenere e preparare mosche sperimentali
<ol><li>Mantenere le mosche nelle fiale contenenti 10 mL di cibo appena fatto (1% agar, 2,4% di lievito di birra, 3% di saccarosio, 5% farina di mais) in un'incubatrice a 25 gradi centigradi con 60% di umidità. Impostare il ciclo di luce dell'incubatrice su 12-h luce:12-h scuro.</li>
	<li>Per garantire che un gran numero di mosche genotipi ospicano desiderate si chiuda simultaneamente, la coltura giovani mosche (1/3 giorni) nel cibo standard con lievito secco sulla superfic...

<ol>
	<li>Kusano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+motility+and+functional+gastrointestinal+diseases.">Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).</li><li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster.">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li><li>Apidianakis, Y., Rahme, L. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+gastric+stem+cells+maintain+the+adult+Drosophila+stomach.">Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beadex+affects+gastric+emptying+in+Drosophila.">Beadex affects gastric emptying in Drosophila.</a> Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).</li><li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TORC1+inhibitor+Nprl2+protects+age-related+digestive+function+in+Drosophila.">The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila.</a> Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).</li><li>Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATOR1+Complex+Regulates+Metabolic+Homeostasis+and+the+Response+to+Nutrient+Stress+in+Drosophila+melanogaster.">The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (12), 3859-3867 (2016).</li><li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay.">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).</li><li>Diegelmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CApillary+FEeder+Assay+Measures+Food+Intake+in+Drosophila+melanogaster.">The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).</li><li>Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+feeding+behavior+in+adult+Drosophila+melanogaster+varies+with+feeding+regime+and+nutritional+state.">Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state.</a> Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).</li><li>Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+gut+function+in+drop-dead+mutant+Drosophila.">Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila.</a> Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).</li><li>Chtarbanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+C+virus+systemic+infection+leads+to+intestinal+obstruction.">Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).</li><li>Solari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+effects+of+5-HT/AKH+and+octopamine+on+the+crop+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster:+Evidence+of+a+double+brain-gut+serotonergic+circuitry.">Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry.</a> PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).</li></ol>

Nella Drosophila il cibo ingerito si sposta dal raccolto all'intestino per la digestione. Durante questo processo, i nutrienti vengono assorbiti e i rifiuti vengono espulsi dal corpo come feci. Così, confrontare l'ingestione di cibo con l'espulsione delle feci può essere utilizzato per valutare approssimativamente la velocità del movimento del cibo nel corpo. Il metodo di alimentazione capillare (CAFE) è ampiamente utilizzato per misurare l'ingestione di cibo10,<sup class="...

La maggior parte degli animali hanno un tubo digestivo chiamato tratto gastrointestinale (GI) per assorbire energia e sostanze nutritive dall'ambiente. Il tratto di GI umano è composto da quattro parti: l'esofago, lo stomaco, l'intestino tenue e l'intestino crasso (colon). Il passaggio alimentare dallo stomaco all'intestino è essenziale per l'assorbimento dei nutrienti. Alcuni effetti, come l'invecchiamento, farmaci tossici, e l'infezione, causano la motilità del tratto GI disordinato e lo svuotamento gastrico, che è legato ad alcune malattie e ai loro sintomi come la dispepsia, la malattia del reflusso gastroesofageo, e costipazione1.
La mosca della frutta (Drosophila melanogaster) è un animale modello ampiamente usato nella ricerca biomedica grazie alla sua facile manipolazione genetica. È importante sottolineare che circa il 77% dei geni associati alla malattia umana ha un omologa nella Drosophila2. La ricerca con la Drosophila ha fatto enormi progressi nella nostra comprensione di molti meccanismi di malattia. Come potente organismo modello genetico, la Drosophila è ampiamente utilizzata nella ricerca sul tratto GI3. La Drosophila ha un tratto digestivo più semplice, che è diviso in tre domini discreti: budello, midgut e hindgut4. Il raccolto, una parte del foregut, è una struttura simile a un sacchetto che funge da sito per lo stoccaggio di cibo ingerito. Il midgut è un tubo lungo e funziona come il sito per la digestione alimentare e l'assorbimento dei nutrienti attraverso lo strato epiteliale, che consiste di enterociti addominali (EC) e cellule di enteroendocrina secretory (EE)5. È interessante notare che la funzione dello stomaco in Drosophila è divisa in due parti: le funzioni delle colture come conservazione degli alimenti e la regione delle cellule di rame (CCR) è una regione altamente acida con un pH < 36. In Drosophila, il cibo ingerito viene inizialmente spostato al raccolto e successivamente pompato nel mezzo budello7. Così, la coltura svolge un ruolo fondamentale nel passaggio del cibo. Avvolto da muscoli viscerali e costituito da una complessa gamma di valvole e sfinteri, il raccolto continua a contrarre e spostare il cibo nel midgut per un'ulteriore digestione.
Questo protocollo consente di rilevare il movimento alimentare dalla coltura al midgut in Drosophila. La contrazione delle colture viene valutata contando la frequenza di contrazione del raccolto. Inoltre, l'effetto della coltura sul passaggio degli alimenti viene studiato rilevando la distribuzione degli alimenti tra colture e intestini. Inoltre, la distribuzione degli alimenti può essere utilizzata per riflettere il movimento alimentare immediato o lo stato degli alimenti di base utilizzando diversi periodi di alimentazione. Nel loro insieme, questo protocollo fornisce metodi per valutare rapidamente la motilità delle colture e il passaggio di cibo nella Drosophila.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillant Blue FCF</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>E8500</td>
			<td>also called FD&#38;C Blue No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>Heraeus Pico 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Spectra Max</td>
			<td>cMax plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring crop motility and food passaging in drosophila

La maggior parte degli animali usa il tratto gastrointestinale (GI) per digerire il cibo. Il movimento del cibo ingerito nel tratto GI è essenziale per l'assorbimento dei nutrienti. La motilità e lo svuotamento gastrico disordinato causano molteplici malattie e sintomi. Come potente organismo modello genetico, la Drosophila può essere utilizzata nella ricerca sulla motilità delle GI. Lacoltura di rosophila Dè un organo che contrae e sposta il cibo nel midgut per un'ulteriore digestione, funzionalmente simile allo stomaco di un mammifero. Presentato è un protocollo per studiare la motilità delle colture della Drosophila utilizzando semplici strumenti di misurazione. Viene descritto un metodo per contare le contrazioni delle colture per valutare la motilità delle colture e un metodo per rilevare la distribuzione degli alimenti tinto di blu tra il raccolto e l'intestino utilizzando uno spettrofotometro per studiare l'effetto della coltura sul passaggio degli alimenti. Il metodo è stato utilizzato per rilevare la differenza di motilità delle colture tra il controllo e le mosche mutanti nprl2. Questo protocollo è sia conveniente che altamente sensibile alla motilità delle colture.

Questi metodi per contare la velocità di contrazione delle colture e rilevare la distribuzione degli alimenti tinto possono essere utilizzati per valutare la funzione delle colture sulla motilità degli alimenti. La contrazione del raccolto riflette la frequenza di spingere il cibo nell'intestino. La distribuzione del colorante nella mosca dopo un breve periodo di alimentazione indica il passaggio immediato del cibo dal raccolto al midgut.
Obiettivo di rapamicicina complesso 1 (TORC1) è un r...

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Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila

L'obiettivo di questo protocollo è misurare la contrazione delle colture e quantificare la distribuzione degli alimenti nell'intestino della Drosophila.

Misurare la motilità delle colture e il passaggio di cibo in Drosophila

Most animals use the gastrointestinal (GI) tract to digest food. The movement of the ingested food in the GI tract is essential for nutrient absorption. ...

Questo metodo viene utilizzato per valutare la motilità delle colture attraverso il conteggio della contrazione delle colture e il rilevamento della distribuzione alimentare solo nell'digestivo. Il vantaggio di questa tecnica è che valuta continuamente la motilità delle colture. È a basso costo e facile da eseguire.Questo metodo consente di utilizzare solo filler come modello per studiare la funzione digestiva sui passaggi alimentari nel tratto gastrointestinale. Ad aiutare a dimostrare il processo sarà Junmeng Xi, uno studente laureato del mio laboratorio. Mantenere le mosche in fiale contenenti 10 millilitri di cibo appena fatto in un incubatore di 25 gradi Celsius con umidità del 60% e un ciclo di luce di 12 ore e 12 ore di buio.Assicurarsi che un gran numero del fenotipo desiderio vola chiudere contemporaneamente coltivando giovani mosche con cibo standard con lievito secco, quindi trasferire le mosche adulte in una fiala con lievito umido e consentire due giorni per la deposizione delle uova. Lascia le uova nell'incubatrice per sviluppare e trasferire le mosche adulte in una nuova fiala per raccogliere più uova. Raccogli le mosche maschili o femminili echiuse ogni giorno e colti in nuove fiale con cibo standard all'età desiderata.Anestetizzare le mosche con anidride carbonica e trasferire una mosca in una piastra di sezionazione bene con 200 microlitri di PBS. Afferrare la mosca al suo torace con un paio di pinzette e aprire il torace con un altro paio di pinzette, quindi tirare le estremità in direzioni opposte per aprire l'addome. Prendi con cura il raccolto e l'intestino dal corpo e aspetta che la mosca si svegli.Quando la mosca è sveglia, conta il numero di volte in cui il raccolto si contrae in un minuto. Ripeti il conteggio della contrazione cinque volte, aspettando 30 secondi tra ogni conteggio. Pesare il colorante blu e scioglierlo in PBS a una concentrazione del 20%.Quindi mescolarlo nel cibo bollito per la manutenzione del liquido a una concentrazione finale del 5% durante il processo di raffreddamento degli alimenti. Dopo aver tenuto le mosche in fiale con cibo da fame per quattro ore, trasferirle in nuove fiale con il cibo tinto e culturarle per il tempo desiderato, tenendo presente che in condizioni di manutenzione il cibo passa attraverso la mosca in circa due ore. Trasferire una mosca anestetizzata in una piastra di sezionatura contenente ben 200 microlitri di PBS.Utilizzare una pinzetta per afferrare la mosca al torace e rimuovere la testa con un altro paio di pinzette, quindi trasferire il corpo in un nuovo pozzo con PBS e lavarlo con delicati scuotimenti per rimuovere il colorante attaccato al corpo. Aprire l'addome con due paia di pinzette e separare accuratamente l'intero intestino dal corpo. Togliere il raccolto da tutto l'intestino e metterlo in un tubo con 100 microlitri di PBS.Mettere il resto dell'intestino in un altro tubo con 100 microlitri di PBS, quindi utilizzare punte di pipetta per macinare il raccolto e l'intestino e sciogliere il colorante in PBS. Ripetere la dissezione fino a quando non vengono raccolte abbastanza colture e budella. Dopo aver raccolto i campioni, centrifugare i tubi alla massima velocità per un minuto e trasferire 90 microlitri di supernatante in pozzo di una piastra da 96 potte.Fai una serie di diluizioni di coloranti blu standard a concentrazioni da uno per 10 a 7 a 10 al 4 ° grammi per millilitro e aggiungili ai pozzi. Misurare l'assorbanza a 630 nanometri dei pozzi e utilizzare le misure standard per tracciare un grafico di linea di assorbanza rispetto alla concentrazione di colorante. Quindi utilizzare la curva per calcolare la concentrazione di colorante dei campioni.Il test di motilità delle colture è stato usato per contare le contrazioni delle colture su mosche mutanti NPRL vecchie di tre giorni e controlli genetici dello sfondo. La mutazione è stata trovata per diminuire significativamente il tasso di contrazione delle colture. Per confermare ulteriormente la funzione di NPRL2 sul raccolto, il movimento del cibo è stato rilevato alimentando il cibo tinto alle mosche.Tutte le mosche avevano quantità simili di colorante nel raccolto, ma le mosche NPRL2 avevano meno colorante nell'intestino che può essere associato alla diminuzione del tasso di contrazione delle colture. Quando digiti questo protocollo, assicurati che il raccolto rimanga a contatto con il corpo e che la mosca sia viva e sveglia. In caso contrario, il raccolto perderà la capacità di contrarsi.Durante il processo di dissezione, il raccolto e l'intestino devono essere in contatto. Se la tintura perde nel mezzo di dissezione, il campione non può più essere utilizzato. Riempiamo il nostro appetito e l'espulsione del cibo in breve tempo può anche essere valutata rilevando la quantità di colorante in tutto l'intestino.

Research

JoVE Journal

Biology

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