Name: measuring crop motility and food passaging in drosophila
Uploaded: 2020-05-09T14:30:00
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Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (nº 31872287), Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (NO). BK20181456) e Seis talentos picos projeto na província de Jiangsu (No. SWYY-146).

1. Manutenção e preparação de moscas experimentais
<ol><li>Mantenha moscas em frascos contendo 10 mL de alimentos recém-feitos (1% de ágar, 2,4% de levedura cervejeira, 3% de sacarose, 5% de farinha de milho) em uma incubadora a 25 °C com 60% de umidade. Coloque o ciclo de luz da incubadora para 12 h de luz:12 h escuro.</li>
	<li>Para garantir que um grande número do genótipo desejado voe simultaneamente, a cultura de moscas jovens (1-3 dias de idade) em alimentos padrão com levedura seca na superfície por 3...

<ol>
	<li>Kusano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+motility+and+functional+gastrointestinal+diseases.">Gastrointestinal motility and functional gastrointestinal diseases.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (16), 2775-2782 (2014).</li><li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster.">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li><li>Apidianakis, Y., Rahme, L. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+gastric+stem+cells+maintain+the+adult+Drosophila+stomach.">Quiescent gastric stem cells maintain the adult Drosophila stomach.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17696-17701 (2011).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beadex+affects+gastric+emptying+in+Drosophila.">Beadex affects gastric emptying in Drosophila.</a> Cell Research. 24 (5), 636-639 (2014).</li><li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TORC1+inhibitor+Nprl2+protects+age-related+digestive+function+in+Drosophila.">The TORC1 inhibitor Nprl2 protects age-related digestive function in Drosophila.</a> Aging. 11 (21), 9811-9828 (2019).</li><li>Wei, Y., Reveal, B., Cai, W., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATOR1+Complex+Regulates+Metabolic+Homeostasis+and+the+Response+to+Nutrient+Stress+in+Drosophila+melanogaster.">The GATOR1 Complex Regulates Metabolic Homeostasis and the Response to Nutrient Stress in Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (12), 3859-3867 (2016).</li><li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay.">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).</li><li>Diegelmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CApillary+FEeder+Assay+Measures+Food+Intake+in+Drosophila+melanogaster.">The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55024 (2017).</li><li>Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+feeding+behavior+in+adult+Drosophila+melanogaster+varies+with+feeding+regime+and+nutritional+state.">Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state.</a> Journal of Experimental Biology. 197, 215-235 (1994).</li><li>Peller, C. R., Bacon, E. M., Bucheger, J. A., Blumenthal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+gut+function+in+drop-dead+mutant+Drosophila.">Defective gut function in drop-dead mutant Drosophila.</a> Journal of Insect Physiology. 55 (9), 834-839 (2009).</li><li>Chtarbanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+C+virus+systemic+infection+leads+to+intestinal+obstruction.">Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14057-14069 (2014).</li><li>Solari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+effects+of+5-HT/AKH+and+octopamine+on+the+crop+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster:+Evidence+of+a+double+brain-gut+serotonergic+circuitry.">Opposite effects of 5-HT/AKH and octopamine on the crop contractions in adult Drosophila melanogaster: Evidence of a double brain-gut serotonergic circuitry.</a> PLoS One. 12 (3), 0174172 (2017).</li></ol>

Em Drosophila ingerido alimentos se move da cultura para o intestino para digestão. Durante esse processo, os nutrientes são absorvidos, e os resíduos são expelidos para fora do corpo como fezes. Assim, comparar a ingestão de alimentos com a ejeção das fezes pode ser usado para avaliar aproximadamente a velocidade do movimento alimentar no corpo. O método de alimentador capilar (CAFE) é amplamente utilizado para medir a ingestão de alimentos10,11</su...

A maioria dos animais tem um tubo digestivo chamado trato gastrointestinal (GI) para absorver energia e nutrientes do ambiente. O trato gi humano é composto de quatro partes: esôfago, estômago, intestino delgado e intestino grosso (cólon). A passagem de alimentos do estômago para o intestino é essencial para a absorção de nutrientes. Alguns efeitos, como envelhecimento, drogas tóxicas e infecção, causam motilidade do trato GI desordenado e esvaziamento gástrico, que está relacionado a algumas doenças e seus sintomas como dispepsia, doença do refluxo gastroesofágico e constipação1.
A mosca-das-frutas (Drosophila melanogaster) é um animal modelo amplamente utilizado em pesquisas biomédicas devido à sua fácil manipulação genética. É importante ressaltar que cerca de 77% dos genes associados à doença humana têm um homólogo em Drosophila2. Pesquisas usando Drosophila fizeram enormes avanços em nossa compreensão de muitos mecanismos de doença. Como um poderoso organismo de modelo genético, o Drosophila é amplamente utilizado na pesquisa do trato GI3. A drosophila possui um trato digestivo mais simples, que é dividido em três domínios discretos: foregut, midgut e hindgut4. A cultura, uma parte do foregut, é uma estrutura semelhante a uma bolsa que serve como um local para armazenamento de alimentos ingeridos. O midgut é um tubo longo e funciona como local para digestão alimentar e absorção de nutrientes através da camada epitelial, que consiste em enterócitos absortivos (CEs) e células enteroendócrinas secretas (EE)5. Curiosamente, a função estomacal em Drosophila é dividida em duas partes: a cultura funciona como armazenamento de alimentos e a região da célula de cobre (CCR) é uma região altamente ácida com pH < 36. Em Drosophila,o alimento ingerido é inicialmente movido para a cultura e posteriormente bombeado para o midgut7. Assim, a cultura desempenha um papel fundamental na passagem de alimentos. Envolta por músculos viscerais e consistindo de uma complexa variedade de válvulas e esfíncteres, a cultura continua contraindo e movendo alimentos para o meio para uma digestão adicional.
Este protocolo permite a detecção do movimento alimentar da cultura até o midgut em Drosophila. A contração da cultura é avaliada pela contagem da frequência de contração da cultura. Além disso, o efeito da cultura na passagem de alimentos é investigado pela detecção da distribuição de alimentos entre a cultura e o intestino. Além disso, a distribuição de alimentos pode ser usada para refletir o movimento alimentar imediato ou o status alimentar básico usando diferentes períodos de alimentação. Em conjunto, este protocolo fornece métodos para avaliar rapidamente a motilidade da cultura e a passagem de alimentos em Drosophila.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>269620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brillant Blue FCF</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>E8500</td>
			<td>also called FD&#38;C Blue No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>Heraeus Pico 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Spectra Max</td>
			<td>cMax plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring crop motility and food passaging in drosophila

A maioria dos animais usa o trato gastrointestinal (GI) para digerir alimentos. O movimento dos alimentos ingeridos no trato GI é essencial para a absorção de nutrientes. Motilidade desordenada e esvaziamento gástrico causam múltiplas doenças e sintomas. Como um poderoso organismo de modelo genético, o Drosophila pode ser usado em pesquisas de motilidade gi. A cultura Drosophila é um órgão que contrai e move alimentos para o meio para uma digestão mais aprofundada, funcionalmente semelhante a um estômago mamífero. Apresentado é um protocolo para estudar a motilidade da cultura Drosophila utilizando ferramentas de medição simples. Descreve-se um método de contagem de contrações agrícolas para avaliar a motilidade da cultura e um método para detectar a distribuição de alimentos tingidos de azul entre a cultura e o intestino usando um espectrofotômetro para investigar o efeito da cultura na passagem de alimentos. O método foi usado para detectar a diferença na motilidade da cultura entre o controle e as moscas mutantes nprl2. Este protocolo é ao mesmo tempo econômico e altamente sensível à motilidade das culturas.

Esses métodos para contar a taxa de contração da cultura e detectar a distribuição de alimentos tingidos podem ser usados para avaliar a função da cultura na motilidade alimentar. A contração da cultura reflete a frequência de empurrar alimentos para o intestino. A distribuição de corante na mosca após um curto período de alimentação indica passagem imediata de alimentos da cultura para o midgut.
Alvo do complexo de rapamicina 1 (TORC1) é um regulador mestre que media o metabo...

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Measuring Crop Motility and Food Passaging in Drosophila

O objetivo deste protocolo é medir a contração da cultura e quantificar a distribuição de alimentos no intestino de Drosophila.

Medindo motilidade de cultura e passagem de alimentos em Drosophila

Most animals use the gastrointestinal (GI) tract to digest food. The movement of the ingested food in the GI tract is essential for nutrient absorption. ...

Este método é utilizado para avaliar a motilidade da cultura através da contagem da contração da cultura e da detecção da distribuição dos alimentos apenas no digestivo. A vantagem dessa técnica é que ela avalia continuamente a motilidade da cultura. É de baixo custo e fácil de executar.Este método permite usar apenas o preenchimento como modelo para estudar a função digestiva nas passagens alimentares no trato gastrointestinal. Ajudando a demonstrar o processo será Junmeng Xi, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Mantenha moscas em frascos contendo 10 mililitros de alimentos recém-fabricados em uma incubadora de 25 graus celsius com 60% de umidade e uma luz de 12 horas, ciclo escuro de 12 horas.Certifique-se de que um grande número do desejo fenótipo voa eclose simultaneamente, culminando moscas jovens com alimentos padrão com levedura seca, em seguida, transfira as moscas adultas para um frasco com levedura molhada e deixe dois dias para a colocação de ovos. Deixe os ovos na incubadora para desenvolver e transferir moscas adultas para um novo frasco para coletar mais ovos. Recolher as moscas machos ou fêmeas fechadas todos os dias e cultuá-las em novos frascos com alimentos padrão para a idade desejada.Anestesiar as moscas com dióxido de carbono e transferir uma mosca para uma placa de dissecação bem com 200 microliters de PBS. Segure a mosca em seu tórax com um par de pinças e abra o tórax com outro par de pinças e puxe as extremidades em direções opostas para abrir o abdômen. Leve cuidadosamente a colheita e o intestino para fora do corpo e espere a mosca acordar.Quando a mosca estiver acordada, conte o número de vezes que a colheita contrai em um minuto. Repita a contração contando cinco vezes, esperando 30 segundos entre cada contagem. Pesar o corante azul e dissolvê-lo em PBS a uma concentração de 20%.Em seguida, misture-o no alimento de manutenção líquida fervida para uma concentração final de 5% durante o processo de resfriamento dos alimentos. Depois de manter moscas em frascos com alimentos de fome por quatro horas, transfira-os para novos frascos com a comida tingida e cultuá-los pelo tempo desejado, tendo em mente que em condições de manutenção o alimento passa pela mosca em cerca de duas horas. Transfira uma mosca anestesiada para uma placa de dissecação bem contendo 200 microliters de PBS.Use pinças para agarrar a mosca no tórax e remover a cabeça com outro par de pinças, em seguida, transfira o corpo para um novo poço com PBS e lave-o com suave agitação para remover o corante ligado ao corpo. Abra o abdômen com dois pares de pinças e separe cuidadosamente todo o intestino do corpo. Tire a colheita de todo o intestino e coloque-a em um tubo com 100 microliters de PBS.Coloque o resto do intestino em outro tubo com 100 microliters de PBS e use pontas de pipeta para moer a cultura e o intestino e dissolver o corante em PBS. Repita a dissecação até que sejam coletadas culturas e tripas suficientes. Após a coleta das amostras, centrifufique os tubos na velocidade mais alta por um minuto e transfira 90 microliters de supernascer para bem de uma placa de 96 poços.Faça uma série de diluições de corante azul padrão em concentrações de uma vez 10 a 7 a 10 para o 4º gramas por mililitro e adicione-as aos poços. Meça a absorvância em 630 nanômetros dos poços e use as medidas padrão para traçar um gráfico de linha de absorvância versus concentração de corante. Em seguida, use a curva para calcular a concentração de corante das amostras.O ensaio de motilidade de cultura foi usado para contar contrações de cultura em moscas mutantes nprl de três dias de idade e controles de fundo genético. A mutação diminuiu significativamente a taxa de contração da cultura. Para confirmar ainda mais a função do NPRL2 na cultura, o movimento alimentar foi detectado alimentando alimentos tingidos para as moscas.Todas as moscas tinham quantidades semelhantes de corante na cultura, mas as moscas NPRL2 tinham menos corante no intestino, o que pode estar associado à diminuição da taxa de contração da cultura. Ao digitar este protocolo, certifique-se de que a cultura permanece contato com o corpo e a mosca está viva e acordada. Caso contrário, a cultura perderá a capacidade de contrair.Durante o processo de dissecção, a cultura e o intestino devem estar em contato. Se o corante vazar para o meio de dissecção, a amostra não poderá mais ser usada. Vamos apenas preencher nosso apetite e a ejeção de alimentos em pouco tempo também pode ser avaliada detectando a quantidade de corante em todo o intestino.

Research

JoVE Journal

Biology

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