Name: identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

ونشكر السيدة كارلا غورينا على المساعدة التقنية في عملية استئصال الانسياب. يدعم L.S. مجلس المنح الدراسية الصيني ومؤسسة الابتكار في مقاطعة هونان للدراسات العليا (CX201713068). ويدعم سموه قسم علوم المختبرات السريرية، كلية العلوم الطبية التطبيقية، جامعة الجوف، ساكاكا، المملكة العربية السعودية. ويدعم X.D.L. من قبل UT الصحة سان انطونيو الصحة كلية الطب بدء تشغيل صندوق وماكس وميني فويلكر الصندوق.

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية الموصوفة هنا من قبل لجنة الرعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة تكساس للصحة سان أنطونيو.
1. نقطة لطخة لإظهار وجود هياكل DSRNA في الجيش الملكي النيبالي هد أم مجموع
<ol><li>عزل الحمض النووي الريبي الكلي عن مسببات الحساسية والحشرات وغير ا...

<ol>
	<li>Strachan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hay+fever,+hygiene,+and+household+size.">Hay fever, hygiene, and household size.</a> BMJ. 299, 1259-1260 (1989).</li><li>Schuijs, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farm+dust+and+endotoxin+protect+against+allergy+through+A20+induction+in+lung+epithelial+cells.">Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells.</a> Science. 349, 1106-1110 (2015).</li><li>Stein, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+and+Asthma+Risk+in+Amish+and+Hutterite+Farm+Children.">Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children.</a> New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).</li><li>Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Endogenous+Nucleic+Acids+by+the+Innate+Immune+System.">Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.</a> Immunity. 44, 739-754 (2016).</li><li>Schlee, M., Hartmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminating+self+from+non-self+in+nucleic+acid+sensing.">Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing.</a> Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).</li><li>Wu, J., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+sensing+and+signaling+of+cytosolic+nucleic+acids.">Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids.</a> Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).</li><li>O'Hara, A. M., Shanahan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+flora+as+a+forgotten+organ.">The gut flora as a forgotten organ.</a> EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).</li><li>. Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html">https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html</a> (2018)</li><li>Weber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).</li><li>Barral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+cytoplasmic+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA-5:+Key+regulators+of+innate+immunity.">Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity.</a> Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).</li><li>Netea, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Th1/Th2+paradigm+towards+a+Toll-like+receptor/T-helper+bias.">From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).</li><li>McNally, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+administration+of+dsRNA+analog+poly(I:C)+induces+interferon-alpha+receptor-dependent+accumulation+of+antigen+experienced+T+cells+in+the+airways.">Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways.</a> PLoS One. 7, 51351 (2012).</li><li>Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+with+dsRNA+adjuvant+ARNAX+induces+antigen-specific+tumor+shrinkage+without+cytokinemia.">Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia.</a> Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).</li><li>Toussi, D. N., Massari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Adjuvant+Effect+of+molecularly+defined+Toll-Like+Receptor+Ligands.">Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands.</a> Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).</li><li>She, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Sensing+of+Aeroallergen-Associated+Double-Stranded+RNA+Triggers+an+IFN+Response+and+Modulates+Type+2+Lung+Inflammation.">Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation.</a> Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).</li><li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+inflammation+and+cytokine+dynamics+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+from+a+mouse+model+of+bronchial+asthma+during+A(H1N1)pdm09+influenza+infection.">Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection.</a> Science Reports. 7, 9128 (2017).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Autonomous+Memory+Alveolar+Macrophages+Requires+T+Cell+Help+and+Is+Critical+to+Trained+Immunity.">Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity.</a> Cell. 175, 1634-1650 (2018).</li><li>Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+techniques+for+bronchoalveolar+lavage+in+translational+respiratory+research:+Paving+the+way+to+develop+novel+therapeutic+moieties.">Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties.</a> Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Salahuddin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+and+Matched+Blood+for+Alveolar+Macrophage+and+CD4++T-cell+Immunophenotyping+and+HIV+Reservoir+Assessment.">Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Stranded+RNA+Is+Detected+by+Immunofluorescence+Analysis+in+RNA+and+DNA+Virus+Infections,+Including+Those+by+Negative-Stranded+RNA+Viruses.">Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Monsion, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Detection+of+Long+dsRNA+in+Vitro+and+in+Vivo+Using+the+dsRNA+Binding+Domain+from+FHV+B2+Protein.">Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein.</a> Front Plant Sci. 9, 70 (2018).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis.">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li><li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation.">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li><li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+asthma:+a+comparison+between+C57BL/6+and+BALB/c+strains+regarding+bronchial+responsiveness,+inflammation,+and+cytokine+production.">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li></ol>

يصف البروتوكول الحالي كيفية تقييم خصائص التحفيز المناعي للحمض النووي الميكروبي المرتبط بالحساسية وتأثيراتها على تطور التهاب الرئة اليوزيني في نموذج الماوس للربو التحسسي. على الرغم من أن dsRNAs طويلة معروفة وسيطة النسخ المتماثل من العديد من الفيروسات التي يمكن أن تنشط بقوة استجابات الإنتر?...

استنادا إلى فرضية النظافة المقترحة أصلا من قبل ستراكان1, في مرحلة مبكرة من الطفولة التعرض للعوامل الميكروبية البيئية مثل الانستوكين يمكن أن تحمي ضد تطور الاضطرابات التحسسية2,3. أثناء الالتهابات الميكروبية، على سبيل المثال، العدوى الفيروسية، والكشف المناعي الفطري للأحماض النووية الأجنبية (RNA/DNA) يؤدي إلى استجابات الدفاع المضيف4،5،6. ومع ذلك ، فإن وجود وانتشار الأحماض النووية المناعية مثل أنواع الحمض النووي الريبي (DSRNA) الطويلة التي تقطعت بها السبل في عث الغبار المنزلية (HDM) أو مسببات الحساسية الأخرى للحشرات لا تزال غير معروفة. تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان HDM أو مسببات الحساسية الحشرية وغير الحشرية تحتوي على أنواع طويلة من dsRNA التي يمكن أن تنشط استجابة مناعية وقائية لمواجهة تطور التهاب الرئة اليوسينوفيلي الحاد في نموذج فأر للربو التحسسي. هنا، ونحن نقدم ثلاث طرق بسيطة وسريعة لتقييم المحددات الهيكلية في رنا هد إم مجموع التي هي مطلوبة لتنظيم التهاب الرئة النيوزنوفيلي الناجم عن مسببات الحساسية.
الجهاز المناعي المخاطي هو أكبر جهاز مناعي في الجسم ويعمل كخط أول للدفاع المضيف ضد كل من الالتهابات الميكروبية والشتائم التحسسية7,8. وdsRNA طويلة، ووسيط تكرار العديد من الفيروسات، ومن المعروف أن تعمل كنمط الجزيئية المرتبطة بعوامل الأمراض (PAMP) لتحفيز الاستجابات الفطرية بقوة عبر حصيلة مثل مستقبلات 3 (TLR3) للحث على التعبير عن الجينات محفزة إنترفيرون (ISGs)9،10،11،12،13،14. لقد أظهرنا مؤخرا أن RNA هد ام الكلي يحتوي على هياكل dsRNA، والتي upregulated التعبير عن ISGs والحد من التهاب الرئة يهونوسوسي شديد عندما تدار عن طريق تقطير داخلtracheal في نموذج مورين من الربو التحسسي الناجمة عن مقتطفات HDM15. يتم تحديد شدة التهابات الرئة عن طريق تحليل أنواع الخلايا المناعية في bronchoalveolar lavage (BAL) والأنسجة الرئوية عن طريق تدفق16،17،18،19،20.
ويتضمن هذا البروتوكول ثلاثة مقايسات: 1) الكشف السريع عن هياكل DSRNA مع لطخة نقطة RNA باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة الماوس J2 الذي يربط على وجه التحديد إلى dsRNA (≥40bp) بطريقة مستقلة عن تسلسل؛ 2) تقييم سريع لمؤثرات vivo من الحمض المناعي الريبي في الرئتين الماوس عن طريق قياس تحريض ISGs باستخدام RT-qPCR؛ 3) القياس الكمي الدقيق للويوزنوفيليات في BAL والرئة في سياق التهاب الرئة الناجم عن HDM باستخدام تحليل تدفق قياس الخلايا.
يمكن استخدام التشايسات أعلاه لدراسة ليس فقط أمراض الرئة التحسسية ، ولكن أيضًا الالتهابات البكتيرية والفيروسية التنفسية. على سبيل المثال، يمكن أيضا أن تستخدم الأجسام المضادة J2 DSRNA محددة في تطبيقات أخرى مثل الكروماتوغرافيا المناعية، وhistochemistry المناعية، والمناعة المرتبطة الانزيم المقايسة (ELISA) والمناعة21،22،23. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العديد من التطبيقات المصب من جمع السوائل BAL لتحديد كمي المحتويات القابلة للذوبان مثل السيتوكينات و chemokines باستخدام ELISA، والتنسخ التنميط للخلايا في الشعب الهوائية (على سبيل المثال، الضامة السنخية). على الرغم من وجود مجموعة متنوعة من البروتوكولات المتاحة في المؤلفات لتقييم حالات الرئة، فإن معظم هذه البروتوكولات غالباً ما تركز على التحقق من الصحة المستهدفة. يمكن تطبيق الإجراءات الموضحة هنا لتحديد المكونات في المواد المسببة للحساسية البيئية المهمة لتنظيم تطور أمراض الحساسية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.40 &#181;m Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Counting Beads</td>
			<td>Life Technologies Europe B.V.</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK-RBC lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond-N+ Membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560456</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117317</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0193-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-0031-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103130</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-5931-82</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-5321-80</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552126</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI34042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannual, 20G X 1.5&#8221;</td>
			<td>CADENCE SCIENCE</td>
			<td>9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockroach</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. farinae</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pteronyssinus</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1156F03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Bath - Four Blocks</td>
			<td>Universal Medical, Inc.</td>
			<td>BSH1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earthworm</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL</td>
			<td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td>
			<td>38056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (BD FACS Celesta)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>sc-363629Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 anti-dsRNA monoclonal antibody</td>
			<td>SCICONS</td>
			<td>10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung digestion solution</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913050-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU:116913100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-BeadBeater</td>
			<td>Homogenizers</td>
			<td>SKU:BS:607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000C</td>
			<td>Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply</td>
			<td>TSCND2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 21 G x 1 1/2 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat milk</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon string</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>3243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase III</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker or Small laboratory mixer</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>201100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPHERO AccuCount Fluorescent</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>ACFP-70-5</td>
			<td>1 to 10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spider</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cell medium</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 2400 UV</td>
			<td>LabX</td>
			<td>20447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasp</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation

مسببات الحساسية البيئية مثل عث الغبار المنزل (HDM) وغالبا ما تكون في أشكال معقدة تحتوي على كل من البروتينات الحساسية التي تدفع ردود من النوع 2 الشاذة والمواد الميكروبية التي تحفز الاستجابات المناعية الفطرية. تلعب هذه المكونات الميكروبية المرتبطة بالحساسية دورًا مهمًا في تنظيم تطور الحالات الالتهابية من النوع 2 مثل الربو التحسسي. غير أن الآليات الأساسية لا تزال غير محددة إلى حد كبير. البروتوكول المعروض هنا يحدد الخصائص الهيكلية ونشاط في الجسم الحي من الحمض النووي الريبي المسبب للحساسية المرتبطة بالمناعة. على وجه التحديد، يتم فحص المواد المسببة للحساسية المشتركة لوجود دنا مزدوجة التي تقطعت بها السبل (dsRNA) الأنواع التي يمكن أن تحفز ردود IFN في الرئتين وكبح جماح تطور يهون الرئة الحادة في نموذج الماوس من الربو التحسسي الناجم عن HDM. هنا، قمنا بتضمين ثلاثة فحوصات التالية: نقطة لطخة لإظهار هياكل DSRNA في مجموع الحمض النووي الريبي معزولة من مسببات الحساسية بما في ذلك أنواع HDM، RT-qPCR لقياس أنشطة HDM RNA في الجينات محفزة إنترفيرون (ISGs) التعبير في الرئتين الماوس وتحليل القوات المسلحة الكونغولية لتحديد آثار الحمض النووي HDM على عدد من الحمض النووي في BAL والرئة، على التوالي.

تم فحص وجود هياكل طويلة من DSRNA في HDM والحشرات والحيوانات الصغيرة غير الحشرية بواسطة لطخة نقطة باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة للماوس خاص بـ dsRNA J2 (≥ 40bp). وقد استخدم RNase الثالث لهضم dsRNA في 12-15 شظايا BP dsRNA، والتي كانت غير قابلة للكشف من قبل J2(الشكل 1).
تم تحليل قدرة RNA...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

غالبًا ما تحتوي المواد المسببة للحساسية البيئية مثل عث الغبار في المنزل (HDM) على مواد ميكروبية تنشط الاستجابات المناعية الفطرية لتنظيم التهاب الحساسية. البروتوكول المقدم هنا يوضح تحديد أنواع dsRNA في المواد المسببة للحساسية HDM وتوصيف أنشطتها المناعية في تعديل التهاب الرئة اليوزيني.

تحديد وتوصيف أنواع الحمض المناعي للرنا في مسببات الحساسية HDM التي تعدل التهاب الرئة اليوزيوزي

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

تم تصميم هذا البروتوكول لمعالجة قضية مهمة جدا وغير محلولة حول كيفية المواد الميكروبية الموجودة والمواد المسببة للحساسية البيئية يمكن أن تنظم تطور التهاب الحساسية. على وجه التحديد، يمكن أن تساعد الأساليب المعروضة هنا في الإجابة عما إذا كانت أنواع الحمض النووي الريبي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في عث الغبار المنزلية مناعية في الجسم الحي وقادرة على تعديل التهاب الرئة اليوسينوفيلي. المزايا الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها بسيطة وفعالة وقابلة للاستنساخ للغاية ويمكن تنفيذها باستخدام الأدوات والمعدات الشائعة الاستخدام.ويمكن أيضاً استخدام هذه الطرق لتقييم أمراض الرئة الناجمة عن العدوى الفيروسية التنفسية. لي شي، طالب دراسات عليا في مختبري، سيساعد في إظهار الإجراء. تبدأ من خلال عزل RNA الكلي من المواد المسببة للحساسية والحشرات، وغير الحشرات المسببة للحساسية.نقل كمية مناسبة من العينة في أنبوب مليلتر اثنين تحتوي على 1.4 ملليمتر من الخرز السيراميك، وتجميد الأنابيب في حاوية النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق تقريبا. إضافة ملليلتر واحد من guanidinium thiocyanate القائم على كاشف العزلة RNA إلى كل أنبوب. ثم كسر الحشرة وغير الحشرات الحيوانات الصغيرة مع تعطيل خلية عالية الطاقة في أقصى سرعة لمدة 45 ثانية.هدئ العينة على الجليد، وكرر هذه العملية مرتين. نقل الحل إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. إضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم إلى كل أنبوب، ودوامة العينة.أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 14،000 مرات ز لمدة 14 دقيقة في أربع درجات مئوية. ثم نقل المرحلة مائي العليا في أنبوب جديد يحتوي على 500 ميكرولترات من الايزوبروبانول. اخلطي العينة.ثم الطرد المركزي في 14،000 مرات ز لمدة 14 دقيقة في أربع درجات مئوية. pirate بعناية عظمى. ثم غسل بيليه الجيش الملكي النيبالي مع 500 ميكرولترات من 75٪ الإيثانول، والطرد المركزي في 7، 500 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.إزالة بعناية جميع السوائل. الهواء الجافة بيليه، وحل الجيش الملكي النيبالي مع 20-50 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase. للكشف عن هياكل الحمض النووي الريبي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في الجيش الملكي النيبالي الكلي، بقعة اثنين من ميكرولترات عينة 200 نانوغرام لكل ميكرولتر RNA على غشاء النايلون مشحونة بشكل إيجابي.ربط العينات بالغشاء في 1، 200 ميكروجول بنسبة 100 في crosslinker الأشعة فوق البنفسجية. كرر اكتشاف و crosslinking مرتين أكثر، مما سيؤدي إلى ما مجموعه 1.2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل بقعة. كتلة الربط غير محددة مع 5٪ الحليب في TBS-T لمدة ساعة واحدة في حين تهتز في درجة حرارة الغرفة.ثم إزالة حل حجب، وإضافة المضادة المضادة مزدوجة تقطعت بهما الحمض النووي الريبي J2 في واحد إلى 1، 000 تخفيف في 1٪ الحليب في TBS-T. احتضان الغشاء بين عشية وضحاها مع اهتزاز في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، اغسل الغشاء ثلاث مرات بـ TBS-T لمدة خمس دقائق لكل غسل.إضافة الأجسام المضادة الثانوية، واحتضان الغشاء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم كرر يغسل مع TBS-T. إضافة الركيزة، واحتضان الغشاء لمدة خمس إلى 15 دقيقة حتى إشارة المرجوة مرئية.وقف رد الفعل عن طريق شطف الغشاء مع الماء المقطر المزدوج. لجمع عينات الرئة، ضع الرئتين على أوراق الأنسجة، واكوس قطعة صغيرة واحدة من كل فص الرئة. ضع كل قطعة في أنبوب مليلتر اثنين يحتوي على الخرز.لجمع bronchoalveolar lavage ، وتطهير الماوس القتل الرحيم مع 70 ٪ من الإيثانول ، واستخدام مقص لقطع الجلد من المنطقة العليا من البطن إلى الرقبة. سحب بلطف الغدد اللعابية والعضلات sternohyoid وبصرف النظر مع ملقط لفضح القصبة الهوائية. ثم ضع سلسلة نايلون تحته.إجراء شق في القصبة الهوائية ما يقرب من مليلتر تحت الحنجرة فقط بما فيه الكفاية لإدراج قنية، وعقدة السلسلة حول القصبة الهوائية وقنية. إرفاق حقنة إلى نهاية القنيولا، وتحميلها مع برنامج تلفزيوني جديد-EDTA. ثم حقن وpirate واحد ملليلتر من المحلل في الرئة.فصل الحقنة من القنية، وإخراج الحل في أنبوب 15 ملليلتر. كرر هذه العملية إلى الجليد مع برنامج تلفزيوني جديد-EDTA، وبركة المرحاض. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 500 مرة ز لمدة سبع دقائق في أربع درجات مئوية.ثم سجل حجم، ونقل عظمى إلى اثنين من أنابيب 1.5 ملليلتر دون إزعاج بيليه. بعد إعادة بناء الكريه، نقل 150 ميكرولترات إلى لوحة 96-جيدا، والطرد المركزي لوحة لمدة سبع دقائق في 500 مرة ز وأربع درجات مئوية. ثم عكس بسرعة لوحة على ورقة الأنسجة لإزالة افرحة.وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة في عازلة FACS في وجود 2.4G2 حظر الأجسام المضادة، واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد تلطيخ، الطرد المركزي لوحة إلى بيليه الخلايا في 500 مرات ز لمدة سبع دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة حل تلطيخ عن طريق عكس لوحة على ورقة الأنسجة.إضافة 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت FACS لغسل الخلايا، ثم كرر الطرد المركزي. إعادة تعليق العينات في 150 ميكرولترات من العازلة FACS، ومن ثم نقلها إلى أنابيب FACS التي تحتوي على 350 ميكرولتر إضافية من العازلة. إضافة 25 ميكرولترات من عد الخرز إلى كل عينة، والمضي قدما مع تحليل تدفق القياسات.تم فحص وجود هياكل الحمض النووي الريبي الطويلة المزدوجة في عث الغبار المنزلية والحشرات والحيوانات الصغيرة غير الحشرية بواسطة لطخة نقطة باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة للماوس مزدوج تقطعت به السبل ومحددة للرنا. تم استخدام RNase III لهضم الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل إلى 12 إلى 15 جزءًا من زوج القاعدة ، والتي لم يتم اكتشافها بواسطة J2. وقد أظهرت قدرة عث الغبار المنزل مجموع الجيش الملكي النيبالي لتحفيز استجابة المناعة الفطرية في الرئتين الماوس من قبل RT-qPCR. العلاج RNase الثالث ألغت النشاط المناعي من عث الغبار البيت مجموع RNA، مشيرا إلى أن هياكل الحمض النووي الريبي المزدوج تقطعت بهم السبل ضرورية للنشاط المناعي الفطري في الرئتين.تم تقييم التأثير المثبط للعث الغبار المنزل مجموع RNA على تطوير التهاب الرئة من النوع الحاد الثاني مع تحليل FACS. وقد تسبب التهاب الرئة اليوزيني من قبل مستخلصات عث الغبار، التي تم التعامل مع أو بدون RNase الثالث. أدى تدهور أنواع الحمض النووي الريبي الطويلة التي تقطعت بها السبل إلى التهاب رئوي حاد من النوع الثاني ، ينعكس في زيادة أعداد الحمضات في لامغ القصبات والرئتين.وتجدر الإشارة إلى أن عدد الحمضات في مجموع عث الغبار الذي يعالجه الحمض النووي الريبي هو مماثل للمجموعة المعالجة باستخراج عث الغبار الأصلي الذي يحتوي بشكل داخلي على أنواع الحمض النووي الريبي الطويلة التي تقطعت بها السبل. عند محاولة هذا البروتوكول، كن حذراً جداً عند حقن و تذكر سائل BAL، حيث أن أي تلف يصيب الرئتين في هذه المرحلة قد يغير النتائج النهائية. بالإضافة إلى هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل ELISA لتحليل المحتويات غير الخلوية القابلة للذوبان الموجودة في سائل BAL.بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف المواد الميكروبية الأخرى الموجودة في مسببات الحساسية البيئية ، مثل عوامل الحمض النووي الريبي غير المزدوجة التي يمكن أن تنظم تطور التهاب الرئة التحسسي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

إجراء 1.5 ساعة لتحديد معوي أنواع الثقافات مباشرة من الدم

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

باستخدام بويضات من<em&gt; البلهارسيا المنسونية</em&gt; ك<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نموذج من التهاب الرئة الناجم عن الديدان الطفيلية

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

مجموع استخراج بروتين و 2-D طرق جل الكهربائي ل<em&gt; بيركولديريا</em&gt; الأنواع

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

متساوي التضخيم (LAMP) فحوصات بوساطة حلقة للكشف عن أنواع محددة من<em&gt; الأيمرية</em&gt; التي تصيب الدجاج

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

عزل وتوصيف والفحص الوظيفي لشبكة خلية اللثة المناعي

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

توصيف وظيفي من الضامة التنظيمية التي تمنع مناعة الكسب غير المشروع

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

عزل وتوصيف وتنقية الضامة من الأنسجة المتضررة من التهاب المتصلة بالسمنة

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

الرئة ماوس شرائح لتصور لايف الخلايا الجذعية الرئوي قطع الدقة

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...