Name: identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

Wij danken mevrouw Karla Gorena voor technische bijstand bij stroomcytometrie. L.S. wordt ondersteund door de China Scholarship Council en Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. wordt ondersteund door de afdeling Klinische Laboratoriumwetenschappen, Hogeschool voor Toegepaste Medische Wetenschappen, Jouf University, Sakaka, Saoedi-Arabië. X.D.L. wordt ondersteund door het UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund en het Max en Minnei Voelcker Fund.

Experimentele procedures hier beschreven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Texas Health San Antonio.
1. Dot blot om de aanwezigheid van dsRNA structuren in HDM totale RNA aan te tonen
<ol><li>Totale RNA-isolatie van allergenen, insecten en niet-insectenallergenen<ol>
<li>Zet HDM, insecten, of niet-insecten dieren levend verzameld of commercieel verkregen in 50 mL buizen, en snel bevriezen met vloeistof-N2. Bewaar vervolg...

<ol>
	<li>Strachan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hay+fever,+hygiene,+and+household+size.">Hay fever, hygiene, and household size.</a> BMJ. 299, 1259-1260 (1989).</li><li>Schuijs, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farm+dust+and+endotoxin+protect+against+allergy+through+A20+induction+in+lung+epithelial+cells.">Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells.</a> Science. 349, 1106-1110 (2015).</li><li>Stein, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+and+Asthma+Risk+in+Amish+and+Hutterite+Farm+Children.">Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children.</a> New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).</li><li>Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Endogenous+Nucleic+Acids+by+the+Innate+Immune+System.">Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.</a> Immunity. 44, 739-754 (2016).</li><li>Schlee, M., Hartmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminating+self+from+non-self+in+nucleic+acid+sensing.">Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing.</a> Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).</li><li>Wu, J., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+sensing+and+signaling+of+cytosolic+nucleic+acids.">Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids.</a> Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).</li><li>O'Hara, A. M., Shanahan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+flora+as+a+forgotten+organ.">The gut flora as a forgotten organ.</a> EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).</li><li>. Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html">https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html</a> (2018)</li><li>Weber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).</li><li>Barral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+cytoplasmic+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA-5:+Key+regulators+of+innate+immunity.">Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity.</a> Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).</li><li>Netea, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Th1/Th2+paradigm+towards+a+Toll-like+receptor/T-helper+bias.">From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).</li><li>McNally, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+administration+of+dsRNA+analog+poly(I:C)+induces+interferon-alpha+receptor-dependent+accumulation+of+antigen+experienced+T+cells+in+the+airways.">Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways.</a> PLoS One. 7, 51351 (2012).</li><li>Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+with+dsRNA+adjuvant+ARNAX+induces+antigen-specific+tumor+shrinkage+without+cytokinemia.">Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia.</a> Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).</li><li>Toussi, D. N., Massari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Adjuvant+Effect+of+molecularly+defined+Toll-Like+Receptor+Ligands.">Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands.</a> Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).</li><li>She, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Sensing+of+Aeroallergen-Associated+Double-Stranded+RNA+Triggers+an+IFN+Response+and+Modulates+Type+2+Lung+Inflammation.">Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation.</a> Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).</li><li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+inflammation+and+cytokine+dynamics+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+from+a+mouse+model+of+bronchial+asthma+during+A(H1N1)pdm09+influenza+infection.">Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection.</a> Science Reports. 7, 9128 (2017).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Autonomous+Memory+Alveolar+Macrophages+Requires+T+Cell+Help+and+Is+Critical+to+Trained+Immunity.">Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity.</a> Cell. 175, 1634-1650 (2018).</li><li>Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+techniques+for+bronchoalveolar+lavage+in+translational+respiratory+research:+Paving+the+way+to+develop+novel+therapeutic+moieties.">Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties.</a> Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Salahuddin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+and+Matched+Blood+for+Alveolar+Macrophage+and+CD4++T-cell+Immunophenotyping+and+HIV+Reservoir+Assessment.">Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Stranded+RNA+Is+Detected+by+Immunofluorescence+Analysis+in+RNA+and+DNA+Virus+Infections,+Including+Those+by+Negative-Stranded+RNA+Viruses.">Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Monsion, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Detection+of+Long+dsRNA+in+Vitro+and+in+Vivo+Using+the+dsRNA+Binding+Domain+from+FHV+B2+Protein.">Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein.</a> Front Plant Sci. 9, 70 (2018).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis.">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li><li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation.">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li><li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+asthma:+a+comparison+between+C57BL/6+and+BALB/c+strains+regarding+bronchial+responsiveness,+inflammation,+and+cytokine+production.">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li></ol>

Het huidige protocol beschrijft hoe de immunostimulerende eigenschappen van allergeen-geassocieerd microbiële RNA en hun effecten op de ontwikkeling van eosinofiele longontsteking in een muismodel van allergische astma te evalueren. Hoewel lange dsRNAs bekend staan als de replicatie tussenproducten van vele virussen die krachtig interferonreacties in zoogdiercellen kunnen activeren, zijn hun aanwezigheid in HDM-allergenen onbekend tot ons recente werk15. De combinatie van RNA dot blot, RT-qPCR en...

Op basis van de hygiënehypothese die Strachan1oorspronkelijk voorstelde , kan blootstelling aan milieumicrobiële factoren zoals endotoxine beschermen tegen de ontwikkeling van allergische aandoeningen2,3. Tijdens microbiële infecties, bijvoorbeeld virale infecties, activeert de aangeboren immuundetectie van vreemde nucleïnezuren (RNA/DNA) hostverdedigingsreacties4,5,6. Het bestaan en de prevalentie van immunogene nucleïnezuren zoals lange dubbelstrengs RNA (dsRNA) soorten in huisstofmijt (HDM) of andere insectenallergenen blijven echter onbekend. Dit protocol is ontworpen om te bepalen of HDM of insecten- en niet-insectenallergenen lange dsRNA-soorten bevatten die een beschermende immuunrespons kunnen activeren om de ontwikkeling van ernstige eosinofiele longontsteking in een muismodel van allergische astma tegen te gaan. Hier bieden we drie eenvoudige en snelle methoden om de structurele determinanten in HDM totaal RNA te evalueren die nodig zijn voor het reguleren van allergeen-geïnduceerde eosinofiele longontsteking.
Het slijmvlies immuunsysteem is het grootste immuunsysteem orgaan in het lichaam en dient als de eerste lijn van gastheer verdediging tegen zowel microbiële infecties en allergische beledigingen7,8. De lange dsRNA, de replicatie tussenliggende van vele virussen, staat bekend om te functioneren als een pathogen-geassocieerd moleculair patroon (PAMP) om krachtig te stimuleren aangeboren reacties via Toll like receptor 3 (TLR3) om de expressie van interferon gestimuleerd genen (ISG's)9,10,11,12,13,14induceren . We hebben onlangs aangetoond dat HDM totale RNA bevatte dsRNA structuren, die upregulated de expressie van ISG's en verminderde ernstige eosinofiele longontsteking wanneer toegediend via de intratracheale instillatie in een murine model van allergische astma geïnduceerd door HDM extracten15. De ernst van longontstekingen wordt bepaald door het analyseren van de immuunceltypen in bronchoalveolaire lavage (BAL) en longweefsel via flow cytometrie16,17,18,19,20.
Dit protocol bevat drie tests: 1) snelle detectie van dsRNA-structuren met RNA-puntvlek met behulp van een monoklonale antilichaam J2 van de muis, dat specifiek op een sequentieonafhankelijke manier aan het dsRNA (≥40bp) bindt; 2) snelle evaluatie van in vivo effecten van immunostimulatorium RNA in muislongen door het meten van de inductie van ISG's met behulp van RT-qPCR; 3) nauwkeurige kwantificering van eosinofielen in BAL en long in de context van HDM-geïnduceerde longontsteking met behulp van flow cytometrie analyse.
De bovenstaande testen kunnen worden gebruikt om niet alleen allergische longziekten te bestuderen, maar ook respiratoire bacteriële en virale infecties. Zo kan het dsRNA-specifieke J2-antilichaam ook worden gebruikt in andere toepassingen zoals immunoaffiniteitschromatografie, immunohistochemie, enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) en immunostaining21,22,23. Bovendien kunnen verschillende toepassingen stroomafwaarts van BAL-vloeistofverzameling worden gebruikt voor het kwantificeren van oplosbare inhoud, zoals cytokines en chemokines met behulp van ELISA, en transcriptieprofilering van cellen in de luchtwegen (bijvoorbeeld alveolaire macrofagen). Hoewel er een verscheidenheid van protocollen beschikbaar in de literatuur om longaandoeningen te evalueren, de meeste van deze protocollen richten zich vaak op de doelvalidatie. De hier beschreven procedures kunnen worden toegepast om componenten in milieuallergenen te identificeren die belangrijk zijn voor het reguleren van de ontwikkeling van allergische ziekten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.40 &#181;m Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Counting Beads</td>
			<td>Life Technologies Europe B.V.</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK-RBC lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond-N+ Membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560456</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117317</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0193-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-0031-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103130</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-5931-82</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-5321-80</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552126</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI34042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannual, 20G X 1.5&#8221;</td>
			<td>CADENCE SCIENCE</td>
			<td>9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockroach</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. farinae</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pteronyssinus</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1156F03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Bath - Four Blocks</td>
			<td>Universal Medical, Inc.</td>
			<td>BSH1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earthworm</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL</td>
			<td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td>
			<td>38056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (BD FACS Celesta)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>sc-363629Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 anti-dsRNA monoclonal antibody</td>
			<td>SCICONS</td>
			<td>10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung digestion solution</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913050-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU:116913100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-BeadBeater</td>
			<td>Homogenizers</td>
			<td>SKU:BS:607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000C</td>
			<td>Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply</td>
			<td>TSCND2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 21 G x 1 1/2 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat milk</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon string</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>3243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase III</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker or Small laboratory mixer</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>201100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPHERO AccuCount Fluorescent</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>ACFP-70-5</td>
			<td>1 to 10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spider</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cell medium</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 2400 UV</td>
			<td>LabX</td>
			<td>20447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasp</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation

Milieuallergenen zoals huisstofmijt (HDM) bevinden zich vaak in complexe vormen die zowel allergische eiwitten bevatten die afwijkende reacties van type 2 en microbiële stoffen stimuleren die aangeboren immuunreacties veroorzaken. Deze allergeen-geassocieerde microbiële componenten spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de ontwikkeling van type 2 ontstekingsaandoeningen zoals allergische astma. De onderliggende mechanismen blijven echter grotendeels ongedefinieerd. Het hier gepresenteerde protocol bepaalt de structurele kenmerken en in vivo activiteit van allergeen-geassocieerd immunostimulatorium RNA. Specifiek, gemeenschappelijke allergenen worden onderzocht op de aanwezigheid van dubbelstrengs RNA (dsRNA) soorten die IFN reacties in de longen kan stimuleren en de ontwikkeling van ernstige longeosinofilie in een muismodel van HDM-geïnduceerde allergische astma kunnen beperken. Hier hebben we de volgende drie tests opgenomen: Dot blot om de dsRNA-structuren in totale RNA-structuren te tonen die geïsoleerd zijn van allergenen, waaronder HDM-soorten, RT-qPCR om de activiteiten van HDM RNA in interferontimulerende genen (ISG's) expressie in muislongen en FACS-analyse te meten om de effecten van HDM RNA op het aantal eosinofielen in BAL en long te bepalen, respectievelijk.

De aanwezigheid van lange dsRNA-structuren in HDM, insecten en niet-insect kleine dieren werd onderzocht door dot vlek met behulp van een dsRNA-specifieke muis monoklonale antilichaam J2 (≥ 40bp). RNase III werd gebruikt om dsRNA te verteren tot 12-15 bp dsRNA-fragmenten, die niet op te sporen waren door J2 (figuur 1).
Het vermogen van HDM total RNA om een aangeboren immuunrespons in muislongen op een dosisafhankelijke manier te stimuleren, werd geanalyseerd doo...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Milieuallergenen zoals huisstofmijt (HDM) bevatten vaak microbiële stoffen die aangeboren immuunreacties activeren om allergische ontstekingen te reguleren. Het hier gepresenteerde protocol toont de identificatie aan van dsRNA-soorten in HDM-allergenen en karakterisering van hun immunogene activiteiten bij het moduleren van eosinofiele longontsteking.

Identificatie en karakterisering van immunogene RNA-soorten bij HDM-allergenen die eosinofiele longontsteking moduleren

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Dit protocol is ontworpen om een zeer belangrijk en onopgelost probleem aan te pakken over hoe microbiële stoffen aanwezig en milieuallergenen de ontwikkeling van allergische ontstekingen kunnen reguleren. Specifiek, de methoden hier gepresenteerd kan helpen beantwoorden of dubbelstrengs RNA soorten in huis huis huis stofmijten zijn immunogene in vivo en in staat om eosinofiele longontsteking moduleren. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat ze eenvoudig, efficiënt, zeer reproduceerbaar en kan worden uitgevoerd met behulp van veel gebruikte gereedschappen en apparatuur.Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om longziekten veroorzaakt door virale infecties van de luchtwegen te evalueren. Li Zij, een afgestudeerde student in mijn laboratorium, zal helpen de procedure aan te tonen. Begin met het isoleren van het totale RNA van allergenen, insecten en niet-insectenallergenen.Breng een juiste hoeveelheid monster in een twee-milliliter buis met 1,4 millimeter keramische kralen, en vries de buizen in een vloeibare stikstof container voor ongeveer 10 minuten. Voeg een milliliter guanidinium thiocyanaat-gebaseerde RNA isolatie reagens aan elke buis. Breek vervolgens het insect en niet-insect kleine dieren met een hoog-energetische cel disruptor op maximale snelheid gedurende 45 seconden.Chill het monster op ijs, en herhaal dit proces twee keer. Breng de oplossing over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Voeg 200 microliter chloroform toe aan elke buis en draaikolk het monster.Centrifugeren de buizen op 14.000 keer g gedurende 14 minuten bij vier graden Celsius. Breng vervolgens de bovenste waterige fase over in een nieuwe buis met 500 microliter isopropanol. Meng het monster.Dan centrifugeren op 14,000 keer g gedurende 14 minuten op vier graden Celsius. Zorgvuldig aspirate de supernatant. Was vervolgens de RNA-pellet met 500 microliters van 75%-ethanol en vercentrifugeren op 7, 500 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Verwijder voorzichtig alle vloeistof. Droog de pellet aan en los het RNA op met 20 tot 50 microliter RNase-vrij water. Om de dubbelstrengs RNA-structuren in het totale RNA te detecteren, spot je twee microliters van het 200 nanogram-per-microliter RNA-monster op het positief geladen nylonmembraan.Crosslink de monsters aan het membraan bij 1. Herhaal het spotten en crosslinken nog twee keer, wat resulteert in een totaal van 1,2 microgram RNA per vlek. Blokkeer niet-specifieke binding met 5% melk in TBS-T gedurende een uur tijdens het schudden bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens de blokkerende oplossing en voeg het anti-dubbelstrengs RNA J2-antilichaam toe bij een één-op-1, 000 verdunning in 1%melk in TBS-T. Incubeer het membraan 's nachts met schudden op vier graden Celsius. Op de volgende dag, was het membraan drie keer met TBS-T gedurende vijf minuten per wasbeurt.Voeg het secundaire antilichaam toe en broed het membraan een uur lang uit bij kamertemperatuur. Herhaal dan de wasbeurten met TBS-T. Voeg het substraat toe en broed het membraan gedurende vijf tot 15 minuten tot een gewenst signaal zichtbaar is.Stop de reactie door het membraan te spoelen met dubbel gedestilleerd water. Om de longmonsters te verzamelen, plaats de longen op tissuepapier, en accijns een klein stukje van elke longkwab. Plaats elk stuk in een twee-milliliter buis met kralen.Om bronchoalveolar lavage te verzamelen, desinfecteerde een geëuthanaseerde muis met 70% ethanol en gebruikt u een schaar om de huid van het bovenste gedeelte van de buik tot de nek te snijden. Trek voorzichtig de speekselklieren en de sternohyoid spier uit elkaar met tangen om de luchtpijp bloot te leggen. Plaats er dan een nylon touwtje onder.Maak een incisie in de luchtpijp ongeveer twee milliliter onder het strottenhoofd net genoeg om een canule in te voegen en knoop de string rond de luchtpijp en canule. Bevestig een spuit aan het einde van de canule en laad deze met verse PBS-EDTA. Injecteer en aspiraat vervolgens een milliliter van de oplossing in de long.Maak de spuit los van de canule en werp de oplossing in een buis van 15 milliliter. Herhaal dit proces op ijs met verse PBS-EDTA, en zwembad de spoel. Centrifugeren de buis op 500 keer g gedurende zeven minuten op vier graden Celsius.Neem vervolgens het volume op en breng de supernatant over op twee buizen van 1,5 milliliter zonder de pellet te verstoren. Breng na het opnieuw intrekken van de pellet 150 microliters over in een plaat met 96 put en centrifuge de plaat zeven minuten lang bij 500 g en vier graden Celsius. Keer vervolgens snel de plaat om op tissuepapier om de supernatant te verwijderen.Bevlek de cellen met antilichamen in FACS-buffer in aanwezigheid van 2,4G2-blokkerend antilichaam en broed de plaat 30 minuten in het donker uit bij kamertemperatuur. Na het bevlekken, centrifugeren de plaat om de cellen pellet op 500 keer g gedurende zeven minuten op vier graden Celsius. Verwijder de kleuroplossing door de plaat op tissuepapier om te keren.Voeg 100 microliter facs-buffer toe om de cellen te wassen en herhaal vervolgens de centrifugatie. Resuspend de monsters in 150 microliters van FACS buffer, en breng ze vervolgens naar FACS buizen met een extra 350 microliters van buffer. Voeg 25 microliter van het tellen van kralen aan elk monster, en ga verder met flow cytometrie analyse.De aanwezigheid van lange dubbelstrengs RNA-structuren in huisstofmijt, insecten en niet-insect kleine dieren werd onderzocht door dot vlek met behulp van een dubbelstrengs, RNA-specifieke muis monoklonale antilichaam. RNase III werd gebruikt om het dubbelstrengs RNA te verteren tot 12 tot 15 basispaarfragmenten, die niet op te sporen waren door J2. Het vermogen van huisstofmijt totaal RNA om een aangeboren immuunrespons in muislongen te stimuleren werd aangetoond door RT-qPCR. De RNase III-behandeling schafte de immunostimulerende activiteit van huisstofmijt totaal RNA af, wat aangeeft dat de dubbelstrengs RNA-structuren essentieel zijn voor aangeboren immuunactiviteit in de longen.Het remmende effect van huisstofmijt totaal RNA op de ontwikkeling van een ernstige type twee longontsteking werden geëvalueerd met FACS analyse. De eosinofiele longontsteking werd veroorzaakt door stofmijtextracten, die met of zonder RNase III werden behandeld. De afbraak van lange dubbelstrande RNA-soorten resulteerde in ernstige type twee longontsteking, weerspiegeld door de toegenomen eosinofiele aantallen in bronchoalveolr lavage en longen.Met name het aantal eosinofielen in de totale RNA-behandelde groep met stofmijt is vergelijkbaar met de groep die is behandeld met het oorspronkelijke stofmijtextract dat de lange dubbelstrengs RNA-soorten endogeen bevatte. Bij het proberen van dit protocol, wees zeer voorzichtig bij het injecteren en het verzamelen van de BAL vloeistof, als eventuele schade aan de longen in dit stadium kan de uiteindelijke resultaten te veranderen. Naast deze procedure kunnen andere methoden zoals ELISA worden uitgevoerd om niet-cellulaire oplosbare inhoud in de BAL-vloeistof te analyseren.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers om andere microbiële stoffen te onderzoeken die aanwezig zijn in omgevingsallergenen, zoals niet-dubbelstrengs RNA-factoren die de ontwikkeling van allergische longontsteking kunnen reguleren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Een 1,5 uur Procedure voor de identificatie van Enterococcus Soorten Rechtstreeks van bloedkweken

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Het gebruik van eieren van<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als een<em&gt; In vivo</em&gt; Model van Helminth veroorzaakte longontsteking

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Totaal Eiwitextractie en 2-D gelelektroforese Werkwijzen voor<em&gt; Burkholderia</em&gt; Soorten

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Elektroforese (NAAM) Assay Hiermee kan de snelle identificatie van HIV-1 nucleocapsid Remmers

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

-Loop gemedieerde Isothermisch Amplification (LAMP) Testen voor de Species-specifieke detectie van<em&gt; Eimeria</em&gt; Dat Kippen infecteren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolatie, karakterisering en functionele onderzoek van het tandvlees Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precisie-cut Mouse Lung Slices Live Pulmonary visualiseren van dendritische cellen

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...