Name: identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

Nous remercions Mme Karla Gorena pour son assistance technique en cytométrie des flux. L.S. est soutenu par le China Scholarship Council et la Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. est soutenu par le Département des sciences du laboratoire clinique, College of Applied Medical Sciences, Jouve University, Sakaka, Arabie Saoudite. X.D.L. est soutenu par l’UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund et le Fonds Max et Minnei Voelcker.

Les procédures expérimentales décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Texas Health San Antonio.
1. Tache de point pour montrer la présence des structures dsRNA dans l’ARN total de HDM
<ol><li>Isolement total de l’ARN contre les allergènes, les insectes et les allergènes autres insectes<ol>
<li>Mettre le HDM, les insectes ou les animaux non-insectes recueillis vivants ou obtenus commercialement da...

<ol>
	<li>Strachan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hay+fever,+hygiene,+and+household+size.">Hay fever, hygiene, and household size.</a> BMJ. 299, 1259-1260 (1989).</li><li>Schuijs, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farm+dust+and+endotoxin+protect+against+allergy+through+A20+induction+in+lung+epithelial+cells.">Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells.</a> Science. 349, 1106-1110 (2015).</li><li>Stein, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+and+Asthma+Risk+in+Amish+and+Hutterite+Farm+Children.">Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children.</a> New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).</li><li>Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Endogenous+Nucleic+Acids+by+the+Innate+Immune+System.">Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.</a> Immunity. 44, 739-754 (2016).</li><li>Schlee, M., Hartmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminating+self+from+non-self+in+nucleic+acid+sensing.">Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing.</a> Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).</li><li>Wu, J., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+sensing+and+signaling+of+cytosolic+nucleic+acids.">Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids.</a> Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).</li><li>O'Hara, A. M., Shanahan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+flora+as+a+forgotten+organ.">The gut flora as a forgotten organ.</a> EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).</li><li>. Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html">https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html</a> (2018)</li><li>Weber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).</li><li>Barral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+cytoplasmic+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA-5:+Key+regulators+of+innate+immunity.">Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity.</a> Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).</li><li>Netea, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Th1/Th2+paradigm+towards+a+Toll-like+receptor/T-helper+bias.">From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).</li><li>McNally, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+administration+of+dsRNA+analog+poly(I:C)+induces+interferon-alpha+receptor-dependent+accumulation+of+antigen+experienced+T+cells+in+the+airways.">Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways.</a> PLoS One. 7, 51351 (2012).</li><li>Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+with+dsRNA+adjuvant+ARNAX+induces+antigen-specific+tumor+shrinkage+without+cytokinemia.">Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia.</a> Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).</li><li>Toussi, D. N., Massari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Adjuvant+Effect+of+molecularly+defined+Toll-Like+Receptor+Ligands.">Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands.</a> Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).</li><li>She, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Sensing+of+Aeroallergen-Associated+Double-Stranded+RNA+Triggers+an+IFN+Response+and+Modulates+Type+2+Lung+Inflammation.">Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation.</a> Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).</li><li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+inflammation+and+cytokine+dynamics+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+from+a+mouse+model+of+bronchial+asthma+during+A(H1N1)pdm09+influenza+infection.">Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection.</a> Science Reports. 7, 9128 (2017).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Autonomous+Memory+Alveolar+Macrophages+Requires+T+Cell+Help+and+Is+Critical+to+Trained+Immunity.">Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity.</a> Cell. 175, 1634-1650 (2018).</li><li>Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+techniques+for+bronchoalveolar+lavage+in+translational+respiratory+research:+Paving+the+way+to+develop+novel+therapeutic+moieties.">Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties.</a> Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Salahuddin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+and+Matched+Blood+for+Alveolar+Macrophage+and+CD4++T-cell+Immunophenotyping+and+HIV+Reservoir+Assessment.">Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Stranded+RNA+Is+Detected+by+Immunofluorescence+Analysis+in+RNA+and+DNA+Virus+Infections,+Including+Those+by+Negative-Stranded+RNA+Viruses.">Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Monsion, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Detection+of+Long+dsRNA+in+Vitro+and+in+Vivo+Using+the+dsRNA+Binding+Domain+from+FHV+B2+Protein.">Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein.</a> Front Plant Sci. 9, 70 (2018).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis.">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li><li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation.">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li><li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+asthma:+a+comparison+between+C57BL/6+and+BALB/c+strains+regarding+bronchial+responsiveness,+inflammation,+and+cytokine+production.">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li></ol>

Le protocole actuel décrit comment évaluer les propriétés immunostimulatoires de l’ARN microbien associé aux allergènes et leurs impacts sur le développement de l’inflammation des poumons éosinophiles dans un modèle de souris d’asthme allergique. Bien que les longs DsARN soient connus comme les intermédiaires de réplication de nombreux virus qui peuvent activer efficacement les réponses à l’interféron dans les cellules de mammifères, leurs présences dans les allergènes HDM ont été inconnues jus...

Sur la base de l’hypothèse d’hygiène initialement proposée par Strachan1, l’exposition de la petite enfance à des facteurs microbiens environnementaux tels que l’endotoxine peut protéger contre le développement de troubles allergiques2,3. Pendant les infections microbiennes, par exemple, les infections virales, la détection immunitaire innée des acides nucléiques étrangers (ARN/ADN) déclenche les réponses de défense de l’hôte4,5,6. Cependant, l’existence et la prévalence d’acides nucléiques immunogènes tels que les longues espèces d’ARN à double brin (ARN) dans les acariens domestiques (HDM) ou d’autres allergènes d’insectes demeurent inconnues. Ce protocole a été conçu pour déterminer si le HDM ou les allergènes d’insectes et de non-insectes contiennent de longues espèces de dsRNA qui peuvent activer une réponse immunitaire protectrice pour contrer le développement d’une inflammation pulmonaire éosinophile grave dans un modèle de souris d’asthme allergique. Ici, nous fournissons trois méthodes simples et rapides pour évaluer les déterminants structurels dans l’ARN total de HDM qui sont exigés pour réguler l’inflammation des poumons éosinophiles allergènes induites.
Le système immunitaire muqueuse est le plus grand organe immunitaire dans le corps et sert de première ligne de défense de l’hôte contre les infections microbiennes et les insultes allergiques7,8. Le long dsRNA, l’intermédiaire de réplication de nombreux virus, est connu pour fonctionner comme un modèle moléculaire associé à un pathogène (PAMP) pour stimuler puissamment les réponses innées via toll comme le récepteur 3 (TLR3) pour induire l’expression des gènes stimulés par l’interféron (ISGs)9,10,11,1212,13,14. Nous avons récemment montré que l’ARN total hdm contenait des structures dsRNA, qui ont upregulated l’expression des ISGs et réduit l’inflammation pulmonaire éosinophile grave lorsqu’il est administré par l’instillation intratrachéale dans un modèle murin d’asthme allergique induit par les extraits de HDM15. La gravité des inflammations pulmonaires est déterminée par l’analyse des types de cellules immunitaires dans le lavage bronchoalvéolaire (BAL) et le tissu pulmonaire par cytométrie de flux16,17,18,19,20.
Ce protocole comprend trois essais : 1) détection rapide des structures dsRNA avec tache de point d’ARN à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris J2 qui se lie spécifiquement à l’ARN (≥40bp) d’une manière séquence-indépendante ; 2) évaluation rapide des effets in vivo de l’ARN immunostimularisant dans les poumons de souris en mesurant l’induction des ISG à l’aide de RT-qPCR; 3) quantification précise des éosinophiles dans le BAL et le poumon dans le contexte de l’inflammation pulmonaire induite par hdm utilisant l’analyse de cytométrie de flux.
Les tests ci-dessus peuvent être utilisés pour étudier non seulement les maladies pulmonaires allergiques, mais aussi les infections bactériennes et virales respiratoires. Par exemple, l’anticorps J2 spécifique à l’ARND peut également être utilisé dans d’autres applications telles que la chromatographie d’immunoaffinité, l’immunohistorichemisme, l’analyse immunosorbent liée aux enzymes (ELISA) et l’immunostaining21,22,23. En outre, plusieurs applications en aval de la collecte de liquides BAL peuvent être utilisées pour quantifier les contenus solubles tels que les cytokines et les chimiokines à l’aide d’ELISA, et le profilage transcriptionnel des cellules dans les voies respiratoires (p. ex., macrophages alvéolaires). Bien qu’il existe une variété de protocoles disponibles dans la littérature pour évaluer les affections pulmonaires, la plupart de ces protocoles se concentrent souvent sur la validation cible. Les procédures décrites ici peuvent être appliquées pour identifier les composants des allergènes environnementaux qui sont importants pour réguler le développement de maladies allergiques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.40 &#181;m Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Counting Beads</td>
			<td>Life Technologies Europe B.V.</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK-RBC lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond-N+ Membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560456</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117317</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0193-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-0031-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103130</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-5931-82</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-5321-80</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552126</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI34042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannual, 20G X 1.5&#8221;</td>
			<td>CADENCE SCIENCE</td>
			<td>9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockroach</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. farinae</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pteronyssinus</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1156F03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Bath - Four Blocks</td>
			<td>Universal Medical, Inc.</td>
			<td>BSH1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earthworm</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL</td>
			<td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td>
			<td>38056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (BD FACS Celesta)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>sc-363629Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 anti-dsRNA monoclonal antibody</td>
			<td>SCICONS</td>
			<td>10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung digestion solution</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913050-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU:116913100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-BeadBeater</td>
			<td>Homogenizers</td>
			<td>SKU:BS:607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000C</td>
			<td>Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply</td>
			<td>TSCND2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 21 G x 1 1/2 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat milk</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon string</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>3243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase III</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker or Small laboratory mixer</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>201100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPHERO AccuCount Fluorescent</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>ACFP-70-5</td>
			<td>1 to 10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spider</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cell medium</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 2400 UV</td>
			<td>LabX</td>
			<td>20447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasp</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation

Les allergènes environnementaux tels que les acariens domestiques (HDM) sont souvent sous des formes complexes contenant à la fois des protéines allergiques qui entraînent des réponses aberrantes de type 2 et des substances microbiennes qui induisent des réponses immunitaires innées. Ces composants microbiens associés aux allergènes jouent un rôle important dans la régulation du développement de conditions inflammatoires de type 2 telles que l’asthme allergique. Cependant, les mécanismes sous-jacents restent largement indéfinis. Le protocole présenté ici détermine les caractéristiques structurelles et l’activité in vivo de l’ARN immunostimularisé associé aux allergènes. Plus précisément, les allergènes communs sont examinés pour la présence d’espèces à double BRIN d’ARN (dsRNA) qui peuvent stimuler les réponses IFN dans les poumons et freiner le développement de l’éosinophilie pulmonaire grave dans un modèle de souris de l’asthme allergique induit par HDM. Ici, nous avons inclus les trois essais suivants: Dot blot pour montrer les structures dsRNA dans l’ARN total isolé des allergènes, y compris les espèces HDM, RT-qPCR pour mesurer les activités de l’ARN HDM dans l’expression des gènes stimulants de l’interféron (ISGs) dans les poumons de souris et l’analyse FACS pour déterminer les effets de l’ARN HDM sur le nombre d’éosinophiles dans BAL et poumon, respectivement.

La présence de structures longues d’ARN dans le HDM, les insectes et les petits animaux non-insectes a été examinée par tache de point à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris spécifique à dsRNA J2 (≥ 40bp). RNase III a été utilisé pour digérer l’ARN de 12 à 15 pb fragments d’ARN, qui étaient indétectables par J2 (Figure 1).
La capacité de l’ARN total de HDM pour stimuler une réponse immunitaire innée dans les poumons de souris d...

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Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Les allergènes environnementaux tels que les acariens domestiques (HDM) contiennent souvent des substances microbiennes qui activent les réponses immunitaires innées pour réguler l’inflammation allergique. Le protocole présenté ici démontre l’identification des espèces de dsRNA dans les allergènes de HDM et la caractérisation de leurs activités immunogéniques en modulant l’inflammation des poumons éosinophiles.

Identification et caractérisation des espèces d’ARN immunogéniques chez les allergènes HDM qui modulent l’inflammation pulmonaire éosinophile

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Ce protocole a été conçu pour aborder une question très importante et non résolue sur la façon dont les substances microbiennes présentes et les allergènes environnementaux peuvent réguler le développement de l’inflammation allergique. Plus précisément, les méthodes présentées ici peuvent aider à répondre si les espèces d’ARN à double brin dans les acariens de la poussière domestique sont immunogènes in vivo et capables de moduler l’inflammation pulmonaire éosinophile. Les principaux avantages de ces techniques sont qu’elles sont simples, efficaces, hautement reproductibles et peuvent être réalisées à l’aide d’outils et d’équipements couramment utilisés.Ces méthodes peuvent également être utilisées pour évaluer les maladies pulmonaires causées par les infections virales respiratoires. Li She, une étudiante diplômée de mon laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Commencez par isoler l’ARN total des allergènes, des insectes et des allergènes non insectes.Transférer une quantité appropriée de spécimen dans un tube de deux millilitres contenant 1,4 millimètre de perles de céramique et congeler les tubes dans un contenant d’azote liquide pendant environ 10 minutes. Ajouter un millilitre de réhésif d’isolement d’ARN à base de guanidinium à base de thiocyanate à chaque tube. Ensuite, brisez l’insecte et les petits animaux non insectes avec un perturbateur cellulaire à haute énergie à vitesse maximale pendant 45 secondes.Réfrigérer l’échantillon sur la glace et répéter ce processus deux fois. Transférez la solution dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajouter 200 microlitres de chloroforme à chaque tube et vortexer l’échantillon.Centrifuger les tubes à 14 000 fois g pendant 14 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube contenant 500 microlitres d’isopropanol. Mélanger l’échantillon.Puis centrifugez-le à 14 000 fois g pendant 14 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez soigneusement le surnatant. Ensuite, lavez la pastille d’ARN avec 500 microlitres de 75% d’éthanol, et centrifugez-la à 7 500 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Retirer soigneusement tout le liquide. Séchez à l’air le granulé et dissolvez l’ARN avec 20 à 50 microlitres d’eau sans RNase. Pour détecter les structures d’ARN à double brin dans l’ARN total, placez deux microlitres de l’échantillon d’ARN de 200 nanogrammes par microlitre sur la membrane de nylon chargée positivement.Reliez les échantillons à la membrane à 1200 microjoules par 100 dans un lien croisé UV. Répétez le repérage et le croisement deux fois de plus, ce qui se traduira par un total de 1,2 microgramme d’ARN par tache. Bloquez la liaison non spécifique avec 5% de lait dans tbs-t pendant une heure tout en secouant à température ambiante.Ensuite, retirez la solution de blocage, et ajoutez l’anticorps anti-ARN J2 à double brin à une dilution de 1 à 1000 dans 1% de lait dans tbs-T. Incuber la membrane pendant la nuit en secouant à quatre degrés Celsius. Le lendemain, laver la membrane trois fois avec le TBS-T pendant cinq minutes par lavage.Ajouter l’anticorps secondaire et incuber la membrane pendant une heure à température ambiante. Répétez ensuite les lavages avec tbs-T. Ajouter le substrat et incuber la membrane pendant cinq à 15 minutes jusqu’à ce qu’un signal désiré soit visible.Arrêtez la réaction en rinçant la membrane avec de l’eau doublement distillée. Pour recueillir les échantillons pulmonaires, placez les poumons sur des papiers de soie et excisez un petit morceau de chaque lobe pulmonaire. Placez chaque pièce dans un tube de deux millilitres contenant des perles.Pour recueillir le lavage bronchoalveolar, désinfecter une souris euthanasiée avec 70% d’éthanol, et utiliser des ciseaux pour couper la peau de la partie supérieure de l’abdomen au cou. Tirez doucement les glandes salivaires et le muscle sternohyoid à part avec des forceps pour exposer la trachée. Placez ensuite une ficelle de nylon en dessous.Faire une incision dans la trachée environ deux millilitres sous le larynx juste assez pour insérer une canule, et nouer la ficelle autour de la trachée et la canule. Fixez une seringue à l’extrémité de la canule et chargez-la avec du PBS-EDTA frais. Injectez et aspirez ensuite un millilitre de la solution dans le poumon.Détachez la seringue de la canule et éjectez la solution dans un tube de 15 millilitres. Répétez ce processus sur la glace avec pbs-EDTA frais, et mettre en commun le lavage. Centrifuger le tube à 500 fois g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius.Enregistrez ensuite le volume et transférez le supernatant sur deux tubes de 1,5 millilitre sans déranger la pastille. Après avoir réutilisé la pastille, transférer 150 microlitres dans une plaque de 96 puits et centrifuger la plaque pendant sept minutes à 500 fois g et quatre degrés Celsius. Puis inverser rapidement la plaque sur du papier de soie pour enlever le surnatant.Tacher les cellules avec des anticorps dans le tampon FACS en présence de 2,4G2 bloquant l’anticorps, et incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après coloration, centrifuger la plaque pour pelleter les cellules à 500 fois g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Enlever la solution de coloration en inversant la plaque sur du papier de soie.Ajouter 100 microlitres de tampon FACS pour laver les cellules, puis répéter la centrifugation. Resuspendez les échantillons dans 150 microlitres de tampon FACS, puis transférez-les dans des tubes FACS contenant 350 microlitres supplémentaires de tampon. Ajouter 25 microlitres de perles de comptage à chaque échantillon, et procéder à l’analyse de cytométrie de flux.La présence de longues structures d’ARN à double brin dans les acariens domestiques, les insectes et les petits animaux non insectes a été examinée par tache à points à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris à double brin et spécifique à l’ARN. RNase III a été utilisé pour digérer l’ARN à double brin en 12 à 15 fragments de paire de base, qui étaient indétectables par J2. La capacité de l’ARN total d’acarien de poussière de maison pour stimuler une réponse immunisée innée dans les poumons de souris a été démontrée par RT-qPCR. Le traitement de RNase III a aboli l’activité immunostimulatoire de l’ARN total d’acarien de poussière de maison, indiquant que les structures doubles-échouées d’ARN sont essentielles pour l’activité immunisée innée dans les poumons.L’effet inhibiteur de l’ARN total d’acarien de poussière de maison sur le développement d’une inflammation pulmonaire grave de type deux a été évalué avec l’analyse de FACS. L’inflammation éosinophile de poumon a été induite par des extraits d’acarien de poussière, qui ont été traités avec ou sans RNase III. La dégradation de longues espèces d’ARN à double brin a entraîné une inflammation pulmonaire grave de type deux, reflétée par l’augmentation du nombre d’éosinophiles dans le lavage bronchoalveolar et les poumons.Notamment, le nombre d’éosinophiles dans le groupe total traité par ARN par acariens est comparable au groupe traité avec l’extrait original d’acarien de poussière qui contenait endogènement les longues espèces d’ARN à double brin. Lorsque vous essayez ce protocole, soyez très prudent lors de l’injection et de la récoltation du liquide BAL, car tout dommage aux poumons à ce stade peut modifier les résultats finaux. En plus de cette procédure, d’autres méthodes comme ELISA peuvent être effectuées pour analyser le contenu soluble non cellulaire présent dans le fluide BAL.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer d’autres substances microbiennes présentes dans les allergènes environnementaux, tels que les facteurs d’ARN non à double brin qui peuvent réguler le développement de l’inflammation pulmonaire allergique.

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