Name: identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

אנו מודים לגב קרלה גורנה לקבלת סיוע טכני בזרימה ציטואסינסה. L.S. נתמכת על ידי מועצת המלגות סין והקרן לחדשנות מחוזי הונאן לתארים מתקדמים (CX201713068). H.H.A. נתמכת על ידי המחלקה למדעי המעבדה הקלינית, המכללה למדעי הרפואה היישומית, אוניברסיטת ג'ול, סאקקה, ערב הסעודית. X.D.L. נתמך על ידי בריאות UT סן אנטוניו בית הספר לרפואה הפעלה של הקרן מקס ו מינין Voelcker.

הליכים ניסיוניים שתוארו כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה של אוניברסיטת טקסס בריאות סן אנטוניו.
1. כתם נקודה כדי להראות נוכחות של מבנים dsRNA ב-RNA הכולל של HDM
<ol><li>סה כ בידוד RNA מאלרגנים, חרקים ואלרגנים שאינם חרקים<ol>
<li>לשים HDM, חרקים, או בעלי חיים שאינם חרקים ?...

<ol>
	<li>Strachan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hay+fever,+hygiene,+and+household+size.">Hay fever, hygiene, and household size.</a> BMJ. 299, 1259-1260 (1989).</li><li>Schuijs, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farm+dust+and+endotoxin+protect+against+allergy+through+A20+induction+in+lung+epithelial+cells.">Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells.</a> Science. 349, 1106-1110 (2015).</li><li>Stein, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+and+Asthma+Risk+in+Amish+and+Hutterite+Farm+Children.">Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children.</a> New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).</li><li>Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Endogenous+Nucleic+Acids+by+the+Innate+Immune+System.">Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.</a> Immunity. 44, 739-754 (2016).</li><li>Schlee, M., Hartmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminating+self+from+non-self+in+nucleic+acid+sensing.">Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing.</a> Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).</li><li>Wu, J., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+sensing+and+signaling+of+cytosolic+nucleic+acids.">Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids.</a> Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).</li><li>O'Hara, A. M., Shanahan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+flora+as+a+forgotten+organ.">The gut flora as a forgotten organ.</a> EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).</li><li>. Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html">https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html</a> (2018)</li><li>Weber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).</li><li>Barral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+cytoplasmic+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA-5:+Key+regulators+of+innate+immunity.">Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity.</a> Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).</li><li>Netea, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Th1/Th2+paradigm+towards+a+Toll-like+receptor/T-helper+bias.">From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).</li><li>McNally, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+administration+of+dsRNA+analog+poly(I:C)+induces+interferon-alpha+receptor-dependent+accumulation+of+antigen+experienced+T+cells+in+the+airways.">Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways.</a> PLoS One. 7, 51351 (2012).</li><li>Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+with+dsRNA+adjuvant+ARNAX+induces+antigen-specific+tumor+shrinkage+without+cytokinemia.">Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia.</a> Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).</li><li>Toussi, D. N., Massari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Adjuvant+Effect+of+molecularly+defined+Toll-Like+Receptor+Ligands.">Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands.</a> Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).</li><li>She, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Sensing+of+Aeroallergen-Associated+Double-Stranded+RNA+Triggers+an+IFN+Response+and+Modulates+Type+2+Lung+Inflammation.">Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation.</a> Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).</li><li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+inflammation+and+cytokine+dynamics+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+from+a+mouse+model+of+bronchial+asthma+during+A(H1N1)pdm09+influenza+infection.">Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection.</a> Science Reports. 7, 9128 (2017).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Autonomous+Memory+Alveolar+Macrophages+Requires+T+Cell+Help+and+Is+Critical+to+Trained+Immunity.">Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity.</a> Cell. 175, 1634-1650 (2018).</li><li>Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+techniques+for+bronchoalveolar+lavage+in+translational+respiratory+research:+Paving+the+way+to+develop+novel+therapeutic+moieties.">Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties.</a> Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Salahuddin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+and+Matched+Blood+for+Alveolar+Macrophage+and+CD4++T-cell+Immunophenotyping+and+HIV+Reservoir+Assessment.">Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Stranded+RNA+Is+Detected+by+Immunofluorescence+Analysis+in+RNA+and+DNA+Virus+Infections,+Including+Those+by+Negative-Stranded+RNA+Viruses.">Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Monsion, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Detection+of+Long+dsRNA+in+Vitro+and+in+Vivo+Using+the+dsRNA+Binding+Domain+from+FHV+B2+Protein.">Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein.</a> Front Plant Sci. 9, 70 (2018).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis.">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li><li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation.">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li><li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+asthma:+a+comparison+between+C57BL/6+and+BALB/c+strains+regarding+bronchial+responsiveness,+inflammation,+and+cytokine+production.">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li></ol>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להעריך את תכונות הגירוי החיסוני של מיקרוביאלית הקשורים אלרגן-RNA וההשפעות שלהם על התפתחות דלקת ריאות אאוזינופילית במודל העכבר של אסתמה אלרגית. למרות dsRNAs ארוך ידועים כintermediates השכפול של וירוסים רבים שיכולים להפעיל בסיפוק אינטרפרון תגובות בתאי היונקים, הנוכחות של?...

מבוסס על השערת היגיינה המוצע במקור על ידי strachan1, החשיפה המוקדמת לגיל הסביבה גורמים מיקרוביאלית כגון אנדוטוקסין יכול להגן מפני פיתוח של הפרעות אלרגיות2,3. במהלך זיהומים מיקרוביאלית, למשל, זיהומים ויראליים, זיהוי החיסונית מולדת של חומצות גרעין זרות (RNA/DNA) מפעיל תגובות הביטחון מארח4,5,6. עם זאת, הקיום והשכיחות של חומצות גרעין החיסונית כגון כפול מסוג RNA (dsRNA) מינים של קרדית אבק הבית (HDM) או אלרגנים אחרים חרקים נשארים לא ידועים. פרוטוקול זה נועד לקבוע אם HDM או חרקים ואלרגנים שאינם חרקים מכילים מינים dsRNA ארוך שיכול להפעיל תגובה חיסונית הגנה לנטרל את ההתפתחות של דלקת ריאות אאוזינופילית חמורה במודל העכבר של אסתמה אלרגית. כאן, אנו מספקים שלוש שיטות פשוטות ומהירות כדי להעריך את דטרמיננטים מבניים ב-RNA הכולל HDM הדרושים עבור ויסות הנגרמת אלרגן לדלקת ריאות אאוזינופילית.
מערכת החיסון רירית היא האיבר החיסונית הגדול ביותר בגוף ומשמש כשורה הראשונה של הגנה מארחים מפני זיהומים מיקרוביאלית ועלבונות אלרגיות7,8. Dsrna ארוך, שכפול ביניים של וירוסים רבים, ידוע לתפקד כדפוס מולקולרי הקשורים הפתוגן (pamp) כדי לעורר בסיפוק תגובות מולדים באמצעות אגרה כמו קולטן 3 (TLR3) כדי לגרום לביטוי של אינטרפרון מגורה גנים (isgs)9,10,11,12,13,14. לאחרונה הראו כי HDM סך הכל RNA הכיל מבנים dsRNA, אשר upregulated הביטוי של ISGs ומופחת דלקת ריאות אאוזינופילית חמורה כאשר מנוהל באמצעות intratracheal במודל מורטין של אסתמה אלרגית הנגרמת על ידי מחלץ HDM15. חומרת דלקות ריאות נקבעת על-ידי ניתוח סוגי התאים החיסוניים בעזרת ברונכשיים (BAL) ורקמת ריאות דרך הזרימה cy,16,17,18,19,20.
פרוטוקול זה כולל שלוש assays: 1) זיהוי מהיר של מבנים dsrna עם כתם כתמי RNA באמצעות העכבר נוגדן בטיים אשר במיוחד נקשר dsrna (≥ 40bp) באופן עצמאי רצף; 2) הערכה מהירה להשפעות vivo של RNA מגירוי חיסוני בריאות העכבר על ידי מדידת אינדוקציה של ISGs באמצעות RT-qPCR; 3) כימות מדויק של אאוזיפרלס באל וריאה בהקשר של דלקת ריאות HDM המושרה באמצעות הזרימה cy, לנסות.
האמור לעיל ניתן להשתמש כדי ללמוד לא רק אלרגיות מחלות ריאות, אלא גם זיהומים בקטריאליים ונגיפי הנשימה. לדוגמה, הנוגדן J2 ספציפי של dsrna יכול לשמש גם ביישומים אחרים כגון כרומטוגרפיה של זיקה חיסוני, אימונוהיסטוכימיה, חיסוני מקושר אנזים (אליסה) ו מכתים חיסוני21,22,23. בנוסף, מספר יישומים במורד איסוף נוזל BAL יכול להיות מנוצל עבור כימות תוכן מסיסים כגון ציטוקינים ו נוגדנים באמצעות אליסה, ו הטרנססקריפט פרופיל של תאים באיירווייז (למשל, מכתשי מקרופאגים). למרות שיש מגוון פרוטוקולים הזמינים בספרות להערכת תנאי הריאות, רוב הפרוטוקולים הללו מתמקדים לעתים קרובות באימות היעד. ניתן ליישם את ההליכים המתוארים כאן על מנת לזהות רכיבים באלרגנים סביבתיים החשובים לוויסות ההתפתחות של מחלות אלרגיות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.40 &#181;m Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Counting Beads</td>
			<td>Life Technologies Europe B.V.</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK-RBC lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond-N+ Membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560456</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117317</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0193-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-0031-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103130</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-5931-82</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-5321-80</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552126</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI34042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannual, 20G X 1.5&#8221;</td>
			<td>CADENCE SCIENCE</td>
			<td>9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockroach</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. farinae</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pteronyssinus</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1156F03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Bath - Four Blocks</td>
			<td>Universal Medical, Inc.</td>
			<td>BSH1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earthworm</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL</td>
			<td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td>
			<td>38056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (BD FACS Celesta)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>sc-363629Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 anti-dsRNA monoclonal antibody</td>
			<td>SCICONS</td>
			<td>10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung digestion solution</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913050-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU:116913100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-BeadBeater</td>
			<td>Homogenizers</td>
			<td>SKU:BS:607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000C</td>
			<td>Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply</td>
			<td>TSCND2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 21 G x 1 1/2 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat milk</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon string</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>3243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase III</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker or Small laboratory mixer</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>201100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPHERO AccuCount Fluorescent</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>ACFP-70-5</td>
			<td>1 to 10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spider</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cell medium</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 2400 UV</td>
			<td>LabX</td>
			<td>20447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasp</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation

אלרגנים סביבתיים כגון קרדית אבק הבית (HDM) הם לעתים קרובות בצורות מורכבות המכילות גם חלבונים אלרגיים כי כונן מסוג שני תגובות וחומרים מיקרוביאלית לגרום לתגובות החיסונית מולדים. הרכיבים הקשורים לאלרגן בתחום החיידקים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות ההתפתחות של מצבים דלקתיים מסוג 2 כגון אסתמה אלרגית. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים נשארים בלתי מוגדרים ברובו. הפרוטוקול המוצג כאן קובע את המאפיינים המבבניים ובפעילות vivo של האלרגן הקשורים חיסוני מגירוי RNA. במיוחד, אלרגנים נפוצות נבדקים לנוכחות של כפול תקוע RNA (dsRNA) מינים שיכולים לעורר תגובות IFN בריאות ולרסן את ההתפתחות של הריאה הקשה אאוזינווליה במודל העכבר של אסטמה מושרה HDM. הנה, כללנו את שלושת: המילים הבאות שאומרות נקודה חשופה להראות את מבנים dsRNA בסך הכל RNA מבודדים אלרגנים כולל מינים HDM, RT-qPCR כדי למדוד את הפעילויות של ה-RNA HDM ב אינטרפרון מגרה גנים (ISGs) הביטוי בריאות העכבר ניתוח FACS כדי לקבוע את ההשפעות של ה-RNA HDM על מספר אאוזינופילים באל, בהתאמה

הנוכחות של מבנים dsRNA ארוך ב HDM, חרקים ובעלי חיים קטנים שאינם חרקים נבדק על ידי אבן חשופה באמצעות העכבר הספציפי dsRNA נוגדן J2 (≥ 40bp). RNase III שימש כדי לעכל dsRNA לתוך 12-15 שברי הלחץ bp, אשר היו בלתי ניתן לגילוי על ידי J2 (איור 1).
היכולת של ה-RNA הכולל של HDM כדי לעורר תגובה חיסוני...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

אלרגנים סביבתיים כגון קרדית אבק הבית (HDM) מכילים לעתים קרובות חומרים מיקרוביאלית המפעילים תגובות החיסונית מולדים לווסת דלקת אלרגית. הפרוטוקול המוצג כאן ממחיש את הזיהוי של מינים dsRNA ב אלרגנים HDM ואפיון של הפעילות החיסונית שלהם בדלקת ריאות אאוזינופילית.

זיהוי ואפיון של מינים החיסוני של RNA ב-HDM אלרגנים לווסת דלקת ריאות אאוזינופילית

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

פרוטוקול זה נועד לטפל בנושא חשוב מאוד ולא פתור על איך חומרים מיקרוביאליים נוכחים ואלרגנים סביבתיים יכולים לווסת את הפיתוח של דלקת אלרגית. באופן ספציפי, השיטות המוצגות כאן יכולות לעזור לענות אם מינים RNA דו-נטושים בקרדית אבק הבית הם אימונוגניים ב- vivo ומצליחים לווסת דלקת ריאות אאוזינופילית. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה הם שהם פשוטים, יעילים, ניתנים לשחזור גבוה ו ניתן לבצע אותם באמצעות כלים וציוד נפוצים.שיטות אלה יכולות לשמש גם כדי להעריך מחלות ריאות הנגרמות על ידי זיהומים ויראליים בדרכי הנשימה. לי היא, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי, תעזור להדגים את ההליך. התחל על ידי בידוד RNA הכולל של אלרגנים, חרקים, ואלרגנים שאינם חרקים.מעבירים כמות נאותה של דגימה לתוך צינור שני מיליליטר המכיל 1.4 מילימטרים של חרוזים קרמיים, ולהקפיא את הצינורות במיכל חנקן נוזלי במשך כ 10 דקות. הוסף מיליליטר אחד של ריאגנט בידוד RNA מבוסס guanidinium thiocyanate לכל צינור. ואז לשבור את החרק ובעלי חיים קטנים שאינם חרקים עם משבש תאים באנרגיה גבוהה במהירות המרבית במשך 45 שניות.מצננים את הדגימה על הקרח, וחוזרים על תהליך זה פעמיים. העבר את הפתרון לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף 200 מיקרוליטרים של כלורופורם לכל צינור, ומערבולת המדגם.צנטריפוגה הצינורות ב 14, 000 פעמים גרם במשך 14 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ואז להעביר את השלב הממימי העליון לתוך צינור חדש המכיל 500 microliters של isopropanol. מערבבים את הדגימה.ואז צנטריפוגה זה ב 14, 000 פעמים גרם במשך 14 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בזהירות שאף את העל-טבעי. לאחר מכן לשטוף את גלולת RNA עם 500 microliters של 75% אתנול, צנטריפוגה אותו ב 7, 500 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בזהירות להסיר את כל הנוזלים. לייבש את הכדור באוויר, ולהמיס את RNA עם 20 עד 50 microliters של מים ללא RNase. כדי לזהות את מבני ה-RNA התקועים הכפולים ב-RNA הכולל, תוכלו לזהות שני מיקרוליטרים של דגימת ה-RNA של 200 ננוגרם למיקרוליטר על קרום הניילון טעון באופן חיובי.לחצות את הדגימות לממברנה ב 1, 200 microjoules על ידי 100 ב crosslinker UV. חזור על איתור ו crosslinking פעמיים נוספות, אשר יגרום בסך הכל 1.2 מיקרוגרם של RNA לכל כתם. חסום כריכה לא ספציפית עם 5% חלב ב- TBS-T למשך שעה תוך כדי טלטול בטמפרטורת החדר.לאחר מכן הסירו את פתרון החסימה, והוסיפו את נוגדן ה-RNA J2 נגד גדילים כפולים בדילול של אחד ל-1, 000 בחלב 1% ב-TBS-T. דגירה הממברנה לילה עם רעידות בארבע מעלות צלזיוס. ביום שלמחר, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBS-T במשך חמש דקות לכל לשטוף.מוסיפים את הנוגדן המשני, וידגירה את הממברנה במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן חזור על השטיפה עם TBS-T. מוסיפים את המצע, ומדגירה את הממברנה במשך חמש עד 15 דקות עד לאות הרצוי גלוי.לעצור את התגובה על ידי שטיפת הממברנה עם מים מזוקקים כפול. כדי לאסוף את דגימות הריאה, מניחים את הריאות על ניירות רקמות, ובונים חתיכה אחת קטנה של כל אונה ריאות. מניחים כל חתיכה לתוך צינור שני מיליליטר המכיל חרוזים.כדי לאסוף lavage ברונכואלוולרית, לחטא עכבר המתת חיטוי עם 70% אתנול, ולהשתמש מספריים לחתוך את העור מהאזור העליון של הבטן לצוואר. בעדינות למשוך את בלוטות הרוק ואת שריר sternohyoid לגזרים עם מדחפים כדי לחשוף את קנה הנשימה. ואז למקם חוט ניילון מתחתיו.לעשות חתך בקנה הנשימה כשני מיליליטר מתחת לגרון רק מספיק כדי להכניס קנולה, ולקשר את החוט סביב קנה הנשימה והקנה. צרף מזרק לסוף ה Cannula, ולטעון אותו עם PBS-EDTA טרי. ואז להזריק ולהשראה מיליליטר אחד של הפתרון לתוך הריאה.נתק את המזרק מהקנולה, ופלט את הפתרון לצינור של 15 מיליליטר. חזור על תהליך זה לקרח עם PBS-EDTA טרי, ובריכה lavage. צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים g במשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.ואז להקליט את עוצמת הקול, ולהעביר את העל טבעי לשני צינורות 1.5 מיליליטר מבלי להפריע גלולה. לאחר שימוש חוזר גלולה, להעביר 150 microliters לתוך צלחת 96 היטב, צנטריפוגה את הצלחת במשך שבע דקות ב 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס. ואז במהירות להפוך את הצלחת על נייר טישו כדי להסיר את supernatant.הכתם את התאים בנוגדנים במאגר FACS בנוכחות נוגדן חוסם 2.4G2, והדרגר את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך. לאחר הכתמה, צנטריפוגה את הצלחת כדי גלולה את התאים ב 500 פעמים g במשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את פתרון הכתמים על ידי היפוך הצלחת על נייר טישו.הוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר FACS כדי לשטוף את התאים ולאחר מכן חזור על הצנטריפוגה. בצע שימוש חוזר בדגימות ב- 150 מיקרוליטרים של מאגר FACS ולאחר מכן העבר אותם לצינורות FACS המכילים 350 מיקרוליטרים נוספים של מאגר. הוסף 25 מיקרוליטרים של חרוזי ספירה לכל מדגם, והמשך בניתוח ציטומטריית זרימה.נוכחותם של מבני רנ"א ארוכים דו-תקעים בקרדית אבק הבית, חרקים ובעלי חיים קטנים שאינם חרקים נבדקה על ידי כתם נקודה באמצעות נוגדן חד שבטי כפול, ספציפי לעכבר RNA. RNase III שימש לעיכול RNA כפול תקוע לתוך 12 עד 15 שברי זוג בסיס, אשר היו בלתי ניתנים לגילוי על ידי J2. היכולת של קרדית אבק הבית RNA הכולל לעורר תגובה חיסונית המולדת בריאות העכבר הוכח על ידי RT-qPCR. הטיפול RNase III ביטל את הפעילות immunostimulatory של RNA סה"כ קרדית אבק הבית, המציין כי מבני RNA כפול תקועים חיוניים לפעילות חיסונית המולדת בריאות.ההשפעה המעכבת של קרדית אבק הבית RNA הכולל על התפתחות של סוג חמור שתי דלקת ריאות הוערכו עם ניתוח FACS. דלקת ריאות אאוזינופילית נגרמה על ידי תמציות קרדית אבק, אשר טופלו עם או בלי RNase III. השפלה של מיני RNA ארוכים דו-גדיליים גרמה לדלקת ריאות מסוג 2 חמורה, שבאה לידי ביטוי במספרים האאוזינופילים המוגברים בשירותים וריאות ברונכואלוולריים.יש לציין, מספר האאוזינופילים בקבוצה הכוללת RNA קרדית האבק דומה לקבוצה שטופלה בתמצית קרדית האבק המקורית שהכילה באופן אנדוגני את מיני ה- RNA הארוכים התקועים הכפולים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, להיות זהיר מאוד בעת הזרקת וזיכרון נוזל BAL, כמו כל נזק לריאות בשלב זה עשוי לשנות את התוצאות הסופיות. בנוסף להליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ELISA כדי לנתח תכנים מסיסים שאינם תאיים הקיימים בנוזל BAL.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור חומרים מיקרוביאליים אחרים הקיימים באלרגנים סביבתיים, כגון גורמי RNA שאינם דו-גדיליים שיכולים לווסת את התפתחות דלקת ריאות אלרגית.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

שימוש ביצים מ<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; כמו<em&gt; ב-vivo</em&gt; דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em&gt; Eimeria</em&gt; כי להדביק תרנגולות

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

אפיון פונקציונלי של מקרופאגים רגולטוריים המעכבים חסינות-תגובתי חסינות

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...