Name: identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

Ringraziamo la signora Karla Gorena per l'assistenza tecnica nella citometria di flusso. L.S. è sostenuta dal China Scholarship Council e dalla Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. è supportato dal Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, Sakaka, Arabia Saudita. X.D.L. è supportato dal FONDO UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund e dal Max and Minnei Voelcker Fund.

Le procedure sperimentali descritte qui sono state approvate dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Texas Health San Antonio.
1. Dot blot per mostrare la presenza di strutture dsRNA nell'RNA totale HDM
<ol><li>Isolamento totale dell'RNA da allergeni, insetti e allergeni non insetti<ol>
<li>Metti HDM, insetti o animali non insetti raccolti vivi o ottenuti commercialmente in tubi da 50 mL e congela rapidamente con il liquido-N2. Quindi conservare a -70 ...

<ol>
	<li>Strachan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hay+fever,+hygiene,+and+household+size.">Hay fever, hygiene, and household size.</a> BMJ. 299, 1259-1260 (1989).</li><li>Schuijs, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farm+dust+and+endotoxin+protect+against+allergy+through+A20+induction+in+lung+epithelial+cells.">Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells.</a> Science. 349, 1106-1110 (2015).</li><li>Stein, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+and+Asthma+Risk+in+Amish+and+Hutterite+Farm+Children.">Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children.</a> New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).</li><li>Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Endogenous+Nucleic+Acids+by+the+Innate+Immune+System.">Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.</a> Immunity. 44, 739-754 (2016).</li><li>Schlee, M., Hartmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminating+self+from+non-self+in+nucleic+acid+sensing.">Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing.</a> Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).</li><li>Wu, J., Chen, Z. 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Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html">https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html</a> (2018)</li><li>Weber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).</li><li>Barral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+cytoplasmic+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA-5:+Key+regulators+of+innate+immunity.">Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity.</a> Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).</li><li>Netea, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Th1/Th2+paradigm+towards+a+Toll-like+receptor/T-helper+bias.">From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).</li><li>McNally, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+administration+of+dsRNA+analog+poly(I:C)+induces+interferon-alpha+receptor-dependent+accumulation+of+antigen+experienced+T+cells+in+the+airways.">Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways.</a> PLoS One. 7, 51351 (2012).</li><li>Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+with+dsRNA+adjuvant+ARNAX+induces+antigen-specific+tumor+shrinkage+without+cytokinemia.">Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia.</a> Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).</li><li>Toussi, D. N., Massari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Adjuvant+Effect+of+molecularly+defined+Toll-Like+Receptor+Ligands.">Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands.</a> Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).</li><li>She, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Sensing+of+Aeroallergen-Associated+Double-Stranded+RNA+Triggers+an+IFN+Response+and+Modulates+Type+2+Lung+Inflammation.">Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation.</a> Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).</li><li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+inflammation+and+cytokine+dynamics+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+from+a+mouse+model+of+bronchial+asthma+during+A(H1N1)pdm09+influenza+infection.">Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection.</a> Science Reports. 7, 9128 (2017).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Autonomous+Memory+Alveolar+Macrophages+Requires+T+Cell+Help+and+Is+Critical+to+Trained+Immunity.">Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity.</a> Cell. 175, 1634-1650 (2018).</li><li>Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+techniques+for+bronchoalveolar+lavage+in+translational+respiratory+research:+Paving+the+way+to+develop+novel+therapeutic+moieties.">Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties.</a> Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Salahuddin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+and+Matched+Blood+for+Alveolar+Macrophage+and+CD4++T-cell+Immunophenotyping+and+HIV+Reservoir+Assessment.">Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Stranded+RNA+Is+Detected+by+Immunofluorescence+Analysis+in+RNA+and+DNA+Virus+Infections,+Including+Those+by+Negative-Stranded+RNA+Viruses.">Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Monsion, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Detection+of+Long+dsRNA+in+Vitro+and+in+Vivo+Using+the+dsRNA+Binding+Domain+from+FHV+B2+Protein.">Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein.</a> Front Plant Sci. 9, 70 (2018).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis.">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li><li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation.">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li><li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+asthma:+a+comparison+between+C57BL/6+and+BALB/c+strains+regarding+bronchial+responsiveness,+inflammation,+and+cytokine+production.">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li></ol>

Il protocollo attuale descrive come valutare le proprietà immunostimulatoriche dell'RNA microbico associato agli allergeni e il loro impatto sullo sviluppo dell'infiammazione polmonare eosinofila in un modello murino di asma allergica. Anche se lunghi dsRNA sono noti come gli intermedi di replicazione di molti virus che possono potentemente attivare le risposte di interferone nelle cellule dei mammiferi, le loro presenze negli allergeni HDM sono state sconosciute fino al nostro recente lavoro15. ...

Sulla base dell'ipotesi igienica originariamente proposta da Strachan1, l'esposizione della prima infanzia a fattori microbici ambientali come l'endotossina può proteggere contro lo sviluppo di disturbi allergici2,3. Durante le infezioni microbiche, ad esempio le infezioni virali, il rilevamento immunitario innato degli acidi nucleici estranei (RNA/DNA) innesca risposte alla difesa dell'ospite4,5,6. Tuttavia, l'esistenza e la prevalenza di acidi nucleici immunogenici come le specie di RNA a doppio filamento (dsRNA) lunghe in acari della polvere domestica (HDM) o altri allergeni da insetti rimangono sconosciuti. Questo protocollo è stato progettato per determinare se gli allergeni HDM o insetti e non insetti contengono specie di dsRNA lungo che possono attivare una risposta immunitaria protettiva per contrastare lo sviluppo di una grave infiammazione polmonare eosinofila in un modello murino di asma allergica. Qui, forniamo tre metodi semplici e veloci per valutare i determinanti strutturali nell'RNA totale HDM che sono necessari per regolare l'infiammazione del polmone eosinofilo indotta da allergeni.
Il sistema immunitario mucosale è il più grande organo immunitario del corpo e serve come prima linea di difesa dell'ospite contro sia le infezioni microbiche che gli insulti allergici7,8. Il lungo dsRNA, il intermedio di replicazione di molti virus, è noto per funzionare come un modello molecolare patogeno-associato (PAMP) per stimolare potentemente le risposte innate tramite Toll come il recettore 3 (TLR3) per indurre l'espressione di geni stimolati interferone (ISG)9,10,11,12,13,14.11 Recentemente abbiamo dimostrato che l'RNA totale dell'HDM conteneva strutture di dsRNA, che hanno aumentato l'espressione degli ISG e ridotto grave infiammazione polmonare eosinofila quando somministrato tramite l'instillazione intratratracheale in un modello murino di asma allergica indotta dagli estratti HDM15. La gravità delle infiammazioni polmonari è determinata analizzando i tipi di cellule immunitarie nello slavao bronchoalveolar (BAL) e nel tessuto polmonare attraverso la citometria di flusso16,17,18,19,20.
Questo protocollo include tre saggi: 1) rilevamento rapido delle strutture di dsRNA con macchia di punto di RNA utilizzando un anticorpo monoclonale del topo J2 che si lega specificamente al dsRNA (40bp) in modo indipendente dalla sequenza; 2) valutazione rapida degli effetti in vivo dell'RNA immunostimulatoroy nei polmoni murini misurando l'induzione di ISG utilizzando RT-qPCR; 3) quantificazione accurata degli eosinofili in BAL e nel polmone nel contesto dell'infiammazione polmonare indotta dall'HDM mediante l'analisi della citometria del flusso.
I saggi di cui sopra possono essere utilizzati per studiare non solo le malattie polmonari allergiche, ma anche le infezioni batteriche e virali respiratorie. Ad esempio, l'anticorpo J2 specifico del dsRNA può essere utilizzato anche in altre applicazioni come la cromatografia dell'immunoaffinità, l'immunostochimica, il saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA) e l'immunostaining21,22,23. Inoltre, diverse applicazioni a valle della raccolta di fluidi BAL possono essere utilizzate per quantificare contenuti solubili come citochine e chemiochine utilizzando ELISA e profilazione trascrizionale delle cellule nelle vie respiratorie (ad esempio, macrofagi alveolar). Anche se ci sono una varietà di protocolli disponibili in letteratura per valutare le condizioni polmonari, la maggior parte di questi protocolli spesso si concentrano sulla convalida del bersaglio. Le procedure qui descritte possono essere applicate per identificare i componenti negli allergeni ambientali che sono importanti per regolare lo sviluppo di malattie allergiche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.40 &#181;m Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Counting Beads</td>
			<td>Life Technologies Europe B.V.</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK-RBC lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond-N+ Membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560456</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117317</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0193-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-0031-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103130</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-5931-82</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-5321-80</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552126</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI34042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannual, 20G X 1.5&#8221;</td>
			<td>CADENCE SCIENCE</td>
			<td>9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockroach</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. farinae</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pteronyssinus</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1156F03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Bath - Four Blocks</td>
			<td>Universal Medical, Inc.</td>
			<td>BSH1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earthworm</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL</td>
			<td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td>
			<td>38056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (BD FACS Celesta)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>sc-363629Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 anti-dsRNA monoclonal antibody</td>
			<td>SCICONS</td>
			<td>10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung digestion solution</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913050-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU:116913100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-BeadBeater</td>
			<td>Homogenizers</td>
			<td>SKU:BS:607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000C</td>
			<td>Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply</td>
			<td>TSCND2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 21 G x 1 1/2 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat milk</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon string</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>3243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase III</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker or Small laboratory mixer</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>201100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPHERO AccuCount Fluorescent</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>ACFP-70-5</td>
			<td>1 to 10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spider</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cell medium</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 2400 UV</td>
			<td>LabX</td>
			<td>20447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasp</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation

Gli allergeni ambientali come gli acari della polvere domestica (HDM) sono spesso in forme complesse contenenti sia proteine allergiche che guidano risposte aberranti di tipo 2 che sostanze microbiche che inducono risposte immunitarie innate. Questi componenti microbici associati agli allergeni svolgono un ruolo importante nella regolazione dello sviluppo di condizioni infiammatorie di tipo 2 come l'asma allergica. Tuttavia, i meccanismi sottostanti rimangono in gran parte indefiniti. Il protocollo qui presentato determina le caratteristiche strutturali e l'attività in vivo dell'RNA immunostimulatory associato agli allergeni. In particolare, vengono esaminati gli allergeni comuni per la presenza di specie di RNA a doppio filamento (dsRNA) che possono stimolare le risposte IFN nei polmoni e frenare lo sviluppo di eosinofilia polmonare grave in un modello murino di asma allergica indotta dall'HDM. Qui, abbiamo incluso i seguenti tre saggi: Dot blot per mostrare le strutture di dsRNA in RNA totale isolate dagli allergeni tra cui le specie MH, RT-qPCR per misurare le attività dell'RNA HDM nei geni che stimolano l'interferone (ISG) espressione nei polmoni dei topi e nell'analisi FACS per determinare gli effetti dell'RNA HDM sul numero di eosinofili in BAL e nei polmoni, rispettivamente.

La presenza di lunghe strutture di dsRNA in HDM, insetti e piccoli animali non insetti è stata esaminata da una macchia a punti utilizzando un anticorpo monoclonale del topo specifico del dsRNA J2 (a 40 pb). RNase III è stato usato per digerire dsRNA in frammenti di dsRNA da 12 a 15 bp, che non erano rilevabili da J2 (Figura 1).
La capacità dell'RNA totale HDM di stimolare una risposta immunitaria innata nei polmoni di topo in modo dipendente dalla dose è stat...

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Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Gli allergeni ambientali come gli acari della polvere domestica (HDM) spesso contengono sostanze microbiche che attivano risposte immunitarie innate per regolare l'infiammazione allergica. Il protocollo qui presentato dimostra l'identificazione delle specie di dsRNA negli allergeni HDM e la caratterizzazione delle loro attività immunogeniche nella modulazione dell'infiammazione polmonare eosinofila.

Identificazione e caratterizzazione delle specie di RNA immunogenico negli allergeni HDM che modulano l'infiammazione polmonare eosinofila

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Questo protocollo è stato progettato per affrontare un problema molto importante e irrisolto su come le sostanze microbiche presenti e gli allergeni ambientali possono regolare lo sviluppo di infiammazioni allergiche. In particolare, i metodi qui presentati possono aiutare a rispondere se le specie di RNA a doppio filamento negli acari della polvere domestica sono immunogeniche in vivo e in grado di modulare l'infiammazione polmonare eosinofila. I principali vantaggi di queste tecniche sono che sono semplici, efficienti, altamente riproducibili e possono essere eseguite utilizzando strumenti e attrezzature di uso comune.Questi metodi possono anche essere utilizzati per valutare le malattie polmonari causate da infezioni virali respiratorie. Li She, una studentessa laureata nel mio laboratorio, aiuterà a dimostrare la procedura. Inizia isolando l'RNA totale da allergeni, insetti e allergeni non insetti.Trasferire una quantità adeguata di campione in un tubo da due millilitri contenente 1,4 millimetri di perline di ceramica e congelare i tubi in un contenitore di azoto liquido per circa 10 minuti. Aggiungere un millilitro di reagente di isolamento dell'RNA a base di tiocianato di guanidinio ad ogni tubo. Quindi rompere l'insetto e i piccoli animali non insetti con un disgregatore cellulare ad alta energia alla massima velocità per 45 secondi.Raffreddare il campione sul ghiaccio e ripetere questo processo due volte. Trasferire la soluzione in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio a ciascun tubo e vortice il campione.Centrifuga i tubi a 14.000 volte g per 14 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo contenente 500 microlitri di isopropanolo. Mescolare il campione.Quindi centrifugarlo a 14.000 volte g per 14 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare con cura il supernatante. Quindi lavare il pellet di RNA con 500 microlitri di etanolo al 75% e centrifugarlo a 7.500 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere con cura tutto il liquido. Asciugare all'aria il pellet e sciogliere l'RNA con da 20 a 50 microlitri di acqua priva di RNasi. Per rilevare le strutture dell'RNA a doppio filamento nell'RNA totale, individuare due microlitri del campione di RNA da 200 nanogrammi per microlitro sulla membrana di nylon caricata positivamente.Collegare i campioni alla membrana a 1.200 microjoule per 100 in un reticolatore UV. Ripetere l'avvistamento e il reticolo altre due volte, il che si tradurrà in un totale di 1,2 microgrammi di RNA per macchia. Blocca l'attacco non specifico con il 5% di latte in TBS-T per un'ora mentre tremi a temperatura ambiente.Quindi rimuovere la soluzione di blocco e aggiungere l'anticorpo RNA J2 anti-doppio filamento a una diluizione uno-a-1.000 nel latte all'1% in TBS-T. Incubare la membrana durante la notte con tremori a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare la membrana tre volte con TBS-T per cinque minuti per lavaggio.Aggiungere l'anticorpo secondario e incubare la membrana per un'ora a temperatura ambiente. Quindi ripetere i lavaggi con TBS-T. Aggiungere il substrato e incubare la membrana per cinque-15 minuti fino a quando non è visibile un segnale desiderato.Interrompere la reazione risciacquando la membrana con acqua doppia distillata. Per raccogliere i campioni polmonari, posizionare i polmoni su carte velina e asportare un piccolo pezzo di ogni lobo polmonare. Posizionare ogni pezzo in un tubo da due millilitri contenente perline.Per raccogliere la lavanda broncoalveolare, disinfettare un topo eutanasiato con il 70% di etanolo e utilizzare le forbici per tagliare la pelle dalla zona superiore dell'addome al collo. Estrarre delicatamente le ghiandole salivari e il muscolo sternoioide con le flessorie per esporre la trachea. Quindi posizionare una corda di nylon sotto di essa.Fare un'incisione nella trachea circa due millilitri sotto la laringe quanto basta per inserire una cannula e annodare la corda intorno alla trachea e alla cannula. Attaccare una siringa all'estremità della cannula e caricarla con PBS-EDTA fresco. Quindi iniettare e aspirare un millilitro della soluzione nel polmone.Staccare la siringa dalla cannula ed espellere la soluzione in un tubo da 15 millilitri. Ripetere questo processo sul ghiaccio con PBS-EDTA fresco e mettere in comune la lavanda. Centrifugare il tubo a 500 volte g per sette minuti a quattro gradi Celsius.Quindi registrare il volume e trasferire il supernatante in due tubi da 1,5 millilitri senza disturbare il pellet. Dopo aver riaspenso il pellet, trasferire 150 microlitri in una piastra da 96 po 'e centrifugare la piastra per sette minuti a 500 volte g e quattro gradi Celsius. Quindi invertire rapidamente la piastra sulla carta velina per rimuovere il supernatante.Macchiare le cellule con anticorpi nel tampone FACS in presenza di anticorpi bloccanti 2.4G2 e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Dopo la colorazione, centrifugare la piastra per pellettare le cellule a 500 volte g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere la soluzione di colorazione invertendo la piastra su carta velina.Aggiungere 100 microlitri di tampone FACS per lavare le cellule, quindi ripetere la centrifugazione. Riaspensare i campioni in 150 microlitri di tampone FACS, quindi trasferirli in tubi FACS contenenti altri 350 microlitri di tampone. Aggiungere 25 microlitri di perline di conteggio a ciascun campione e procedere con l'analisi della citometria del flusso.La presenza di lunghe strutture a RNA a doppio filamento negli acari della polvere domestica, negli insetti e nei piccoli animali non insetti è stata esaminata da una macchia a punti usando un anticorpo monoclonale del topo a doppio filamento specifico dell'RNA. La RNasi III è stata usata per digerire l'RNA a doppio filamento in frammenti di coppia di basi da 12 a 15, che non erano rilevabili da J2. La capacità dell'RNA totale dell'acaro della polvere domestica di stimolare una risposta immunitaria innata nei polmoni del topo è stata dimostrata da RT-qPCR. Il trattamento RNasi III ha abolito l'attività immunostimolante dell'RNA totale dell'acaro della polvere domestica, indicando che le strutture dell'RNA a doppio filamento sono essenziali per l'attività immunitaria innata nei polmoni.L'effetto inibitorio dell'RNA totale dell'acaro della polvere domestica sullo sviluppo di una grave infiammazione polmonare di tipo due è stato valutato con l'analisi FACS. L'infiammazione polmonare eosinofila è stata indotta da estratti di acari della polvere, che sono stati trattati con o senza RNasi III. La degradazione delle lunghe specie di RNA a doppio filamento ha provocato una grave infiammazione polmonare di tipo due, riflessa dall'aumento del numero di eosinofili nel lavaggio broncoalveolare e nei polmoni.In particolare, il numero di eosinofili nel gruppo totale trattato con RNA dell'acaro della polvere è paragonabile al gruppo trattato con l'estratto originale di acaro della polvere che conteneva endogenamente le lunghe specie di RNA a doppio filamento. Quando si tenta questo protocollo, fare molta attenzione quando si inietta e si ricorda il liquido BAL, poiché qualsiasi danno ai polmoni in questa fase può alterare i risultati finali. Oltre a questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come ELISA per analizzare i contenuti solubili non cellulari presenti nel fluido BAL.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare altre sostanze microbiche presenti negli allergeni ambientali, come fattori di RNA non a doppio filamento che possono regolare lo sviluppo di infiammazione polmonare allergica.

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