Name: identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

카를라 고레나(Karla Gorena) 씨는 유동 세포측정에 대한 기술 지원을 해 주셔서 감사합니다. L.S.는 중국 장학위원회와 후난지방혁신재단(CX201713068)의 지원을 받고 있습니다. H.H.A.는 사우디아라비아 주 사카카 주 응용 의학 대학 임상 실험실 과학과의 지원을 받고 있습니다. X.D.L.은 UT 헬스 샌안토니오 의과 대학 스타트업 펀드와 맥스 및 미니시 보엘커 기금의 지원을 받고 있습니다.

여기에 설명 된 실험 절차는 텍사스 건강 샌 안토니오 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
1. HDM 총 RNA에서 dsRNA 구조의 존재를 보여주는 도트 블롯
<ol><li>알레르겐, 곤충 및 비 곤충 알레르겐으로부터의 총 RNA 절연<ol>
<li>HDM, 곤충 또는 비곤충 동물을 살아 있거나 상업적으로 50mL 튜브에 넣고 액체 N2로신속하게 동결하십시오. 그런 다음 후속 총 RN...

<ol>
	<li>Strachan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hay+fever,+hygiene,+and+household+size.">Hay fever, hygiene, and household size.</a> BMJ. 299, 1259-1260 (1989).</li><li>Schuijs, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farm+dust+and+endotoxin+protect+against+allergy+through+A20+induction+in+lung+epithelial+cells.">Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells.</a> Science. 349, 1106-1110 (2015).</li><li>Stein, M. 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D., Hansbro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+techniques+for+bronchoalveolar+lavage+in+translational+respiratory+research:+Paving+the+way+to+develop+novel+therapeutic+moieties.">Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties.</a> Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Salahuddin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+and+Matched+Blood+for+Alveolar+Macrophage+and+CD4++T-cell+Immunophenotyping+and+HIV+Reservoir+Assessment.">Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Stranded+RNA+Is+Detected+by+Immunofluorescence+Analysis+in+RNA+and+DNA+Virus+Infections,+Including+Those+by+Negative-Stranded+RNA+Viruses.">Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Monsion, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Detection+of+Long+dsRNA+in+Vitro+and+in+Vivo+Using+the+dsRNA+Binding+Domain+from+FHV+B2+Protein.">Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein.</a> Front Plant Sci. 9, 70 (2018).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis.">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li><li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation.">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li><li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+asthma:+a+comparison+between+C57BL/6+and+BALB/c+strains+regarding+bronchial+responsiveness,+inflammation,+and+cytokine+production.">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li></ol>

현재 프로토콜은 알레르기 성 천식의 마우스 모형에 있는 호산성 폐 염증의 발달에 알레르기성 관련 미생물 RNA의 면역 자극성 속성 및 그들의 충격을 평가하는 방법을 설명합니다. 긴 dsRNAs는 포유류 세포에 있는 인터페론 반응을 강력하게 활성화할 수 있는 많은 바이러스의 복제 중간체로 알려져 있더라도, HDM 알레르겐에 있는 그들의 존재는 우리의 최근 일15까지알려지지 않았?...

스트라찬1이원래 제안한 위생 가설에 기초하여, 내독소와 같은 환경 미생물 인자에 대한 유아 노출은 알레르기 장애2,,3의발달로부터 보호 할 수 있습니다. 미생물 감염 중, 예를 들어, 바이러스 감염, 외국 핵산(RNA/DNA)의 선천적인 면역 검출은 호스트 방어 반응을4,,5,,6을유발한다. 그러나, 집먼지 진드기(HDM) 또는 다른 곤충 알레르겐에서 긴 이중 좌초 RNA(dsRNA) 종과 같은 면역원성 핵산의 존재 그리고 유병률은 알려지지 않은 채로 남아 있다. 이 프로토콜은 HDM 또는 곤충 및 비 곤충 알레르겐이 알레르기 성 천식의 마우스 모델에서 심각한 호산성 폐 염증의 발달을 중화하기 위해 보호 면역 반응을 활성화 할 수있는 긴 dsRNA 종을 포함 여부를 결정하기 위해 설계되었습니다. 여기서, 우리는 알레르겐 유도 호산성 폐 염증을 조절하는 데 필요한 HDM 총 RNA에서 구조적 결정요인을 평가하는 세 가지 간단하고 빠른 방법을 제공한다.
점막 면역 계통은 바디에서 가장 큰 면역 기관이고 미생물 감염 및 알레르기성 모욕 둘 다에 대하여 호스트 방어의 첫번째 선 역할을7,,8. 긴 dsRNA는, 많은 바이러스의 복제 중간체로서, 인터페론 자극 유전자(ISGs)9,,10,,,11,12,,13,14의발현을 유도하기 위해 수용체 3(TLR3)와 같은 톨을 통해 선천적 반응을 강력하게 자극하는 병원균 관련 분자 패턴(PAMP)으로 기능하는 것으로 알려져있다. 최근에는 HDM 총 RNA가 DSRNA 구조를 함유하고 있으며, 이는 ISGs의 발현을 조절하고 HDM 추출물에 의해 유도된 알레르기 성 천식의 뮤린 모델에서 내내 주입을 통해 투여될 때 심한 호산성 폐 염증을감소시켰다. 폐 염증의 중증도는 혈류,세포측정제16,,17,18,19,,20을통해 기관지알래 라베이지(BAL) 및 폐 조직에서 면역 세포 유형을 분석하여 결정된다.,
이 프로토콜은 3개의 분석서를 포함합니다: 1) 특이하게 dsRNA (≥40bp)에 서열 독립적인 방식으로 결합하는 마우스 단클론 항체 J2를 사용하여 RNA 도트 블롯을 가진 dsRNA 구조물의 신속한 검출; 2) RT-qPCR을 사용하여 ISGs의 유도를 측정하여 마우스 폐에서 면역 자극 RNA의 생체 내 효과에 대한 빠른 평가; 3) 혈류 세포측정 분석을 이용하여 HDM 유도 폐 염증의 맥락에서 BAL 및 폐에서 호산구의 정확한 정량화.
위의 에세이는 알레르기 성 폐 질환뿐만 아니라 호흡기 세균 및 바이러스 감염을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, dsRNA 특이적 J2 항체는 면역화성 크로마토그래피, 면역히스토케, 효소-연결된 면역소벤트 분석법(ELISA) 및 면역염색21,,22,,23과같은 다른 응용 분야에서도 사용될 수 있다. 또한, BAL 유체 수집의 하류에 여러 응용 분야는 ELISA를 사용하여 사이토카인 및 케모킨과 같은 용용성 함량을 정량화하고, 기도내 세포의 전사 프로파일링(예를 들어, 폐포 대식세포)에 활용될 수 있다. 폐 상태를 평가하기 위해 문헌에서 사용할 수있는 다양한 프로토콜이 있지만, 이러한 프로토콜의 대부분은 종종 대상 유효성 검사에 초점을 맞춥니다. 여기에 설명된 절차는 알레르기 성 질병의 발달을 조절하는 데 중요한 환경 알레르겐의 구성 요소를 식별하기 위해 적용 될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.40 &#181;m Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Counting Beads</td>
			<td>Life Technologies Europe B.V.</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK-RBC lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond-N+ Membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560456</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117317</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0193-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-0031-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103130</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-5931-82</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-5321-80</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552126</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI34042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannual, 20G X 1.5&#8221;</td>
			<td>CADENCE SCIENCE</td>
			<td>9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockroach</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. farinae</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pteronyssinus</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1156F03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Bath - Four Blocks</td>
			<td>Universal Medical, Inc.</td>
			<td>BSH1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earthworm</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL</td>
			<td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td>
			<td>38056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (BD FACS Celesta)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>sc-363629Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 anti-dsRNA monoclonal antibody</td>
			<td>SCICONS</td>
			<td>10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung digestion solution</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913050-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU:116913100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-BeadBeater</td>
			<td>Homogenizers</td>
			<td>SKU:BS:607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000C</td>
			<td>Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply</td>
			<td>TSCND2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 21 G x 1 1/2 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat milk</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon string</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>3243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase III</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker or Small laboratory mixer</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>201100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPHERO AccuCount Fluorescent</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>ACFP-70-5</td>
			<td>1 to 10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spider</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cell medium</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 2400 UV</td>
			<td>LabX</td>
			<td>20447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasp</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation

집 먼지 진드기 (HDM)와 같은 환경 알레르겐은 종종 비정상적인 유형 2 반응을 구동하는 알레르기 성 단백질과 타고난 면역 반응을 유도하는 미생물 물질을 포함하는 복잡한 형태로 종종 있습니다. 이러한 알레르겐 관련 미생물 성분은 알레르기 성 천식과 같은 타입-2 염증 조건의 발달을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. 그러나 기본 메커니즘은 크게 정의되지 않은 상태로 유지됩니다. 여기서 제시된 프로토콜은 알레르겐 관련 면역 자극RNA의 구조적 특성 및 생체 내 활성을 결정한다. 구체적으로, 일반적인 알레르겐은 폐에서 IFN 반응을 자극하고 HDM 유도 알레르기 천식의 마우스 모델에서 중증 폐 호산구의 발달을 억제할 수 있는 이중 좌초 RNA(dsRNA) 종의 존재를 검사한다. 여기서, 우리는 다음과 같은 세 가지 분석을 포함했다: HDM 종을 포함한 알레르겐으로부터 분리된 총 RNA에서 dsRNA 구조를 보여주는 도트 블롯, RT-qPCR은 마우스 폐및 FACS 분석에서 인터페론 자극 유전자(ISGs) 발현에서 HDM RNA의 활동을 측정하여 각각 BAL및 폐, 폐의 EOSinophils수에 대한 HDM RNA의 효과를 결정한다.

HDM, 곤충 및 비 곤충 작은 동물에서 긴 dsRNA 구조의 존재는 dsRNA 특이적 마우스 단일 클론 항체 J2 (≥ 40bp)를 사용하여 점 블롯에 의해 검사되었다. RNase III는 DsRNA를J2(도1)에 의해 검출할 수 없는 12-15 bp dsRNA 단편으로 소화하는 데 사용하였다.
HDM 총 RNA의 능력은 용량 의존적 방식으로 마우스 폐에서 선천적인 면역 반응을 자극하는 RT-qPCR(도2,<...

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Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

집 먼지 진드기 (HDM)와 같은 환경 알레르겐은 종종 알레르기 염증을 조절하기 위해 선천적 인 면역 반응을 활성화하는 미생물 물질을 함유하고 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 HDM 알레르겐에서 dsRNA 종의 식별과 호산성 폐 염증을 조절하는 면역원성 활동의 특성화를 보여줍니다.

호산성 폐 염증을 조절하는 HDM 알레르겐의 면역원성 RNA 종의 식별 및 특성화

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

이 프로토콜은 현재 미생물 물질과 환경 알레르겐이 알레르기 염증의 발달을 조절할 수있는 방법에 대한 매우 중요하고 해결되지 않은 문제를 해결하기 위해 설계되었습니다. 구체적으로, 여기에 제시된 방법은 집 먼지 진드기에 있는 이중 좌초 RNA 종이 생체내 면역원성이고 호산성 폐 염증을 조절할 수 있는지 여부를 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 간단하고 효율적이며 재현성이 뛰어나며 일반적으로 사용되는 도구와 장비를 사용하여 수행할 수 있다는 것입니다.이 방법은 또한 호흡기 바이러스성 감염에 기인한 폐 질병을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 내 실험실에서 대학원생 인 Li She는 절차를 시연하는 데 도움이 될 것입니다. 알레르겐, 곤충 및 비 곤충 알레르겐에서 총 RNA를 격리하는 것으로 시작합니다.적당한 양의 시편을 1.4밀리미터의 세라믹 구슬을 함유한 2밀리리터 튜브로 옮기고, 액체 질소 용기에 튜브를 약 10분 동안 동결한다. 각 튜브에 구안디늄 티오야네이트 계 RNA 격리 시약 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 곤충과 곤충이 아닌 작은 동물을 고에너지 세포 파괴기로 45초 동안 최대 속도로 분해합니다.얼음에 샘플을 냉각하고 두 번이 과정을 반복합니다. 솔루션을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 각 튜브에 200 마이크로리터를 추가하고 샘플을 소용돌이시다.14, 000배의 튜브를 섭씨 4도에서 14분간 원심분리합니다. 그런 다음 상부 수성 상을 500 마이크로리터의 이소프로판올을 포함하는 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 샘플을 섞는다.그런 다음 원심 분리는 섭씨 4도에서 14 분 동안 14, 000 배 g에서 원심 분리합니다. 신중하게 슈퍼 나티를 흡인. 그런 다음 RNA 펠릿을 75%에탄올의 500 마이크로리터로 세척하고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 10분 동안 7, 500회 g에서 씻어낸다.조심스럽게 모든 액체를 제거합니다. 펠릿을 공기 건조시키고 RNA가 없는 물 20~50마이크로리터로 RNA를 용해시키십시오. 총 RNA에서 이중 좌초 된 RNA 구조를 검출하기 위해, 양전하 나일론 멤브레인에 마이크로리터 당 200 나노 그램 RNA 샘플의 2 개의 마이크로 리터를 발견한다.UV 크로스링커에서 1, 200 마이크로줄에서 멤브레인에 샘플을 교차 연결합니다. 얼룩당 총 1.2 마이크로그램의 RNA가 생성되는 두 번 더 스포팅및 교차 연결을 반복합니다. 실온에서 흔들면서 1시간 동안 TBS-T에서 5%의 우유로 비특이적 결합을 차단합니다.그런 다음 차단 용액을 제거하고 TBS-T에서 1%의 우유에 1대 1, 000 희석에서 반이중 좌초 RNA J2 항체를 첨가한다. 하룻밤 사이에 막을 배양하고 섭씨 4도에서 흔들어 보임. 다음 날, 세척 당 5 분 동안 TBS-T로 멤브레인을 세 번 씻으시다.이차 항체를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 멤브레인을 배양하십시오. 그런 다음 TBS-T로 세서를 반복합니다. 기판을 추가하고 원하는 신호가 보일 때까지 멤브레인을 5~15분 동안 배양합니다.이중 증류수로 멤브레인을 헹구어 반응을 멈춥시다. 폐 샘플을 수집하려면 폐를 조직 용지에 놓고 각 폐 엽의 작은 조각을 소비합니다. 각 조각을 구슬이 들어 있는 2밀리리터 튜브에 넣습니다.기관지 알롤라 라베이를 수집하려면 안락사 마우스를 70 %에탄올로 소독하고 가위를 사용하여 복부의 상부 영역에서 목으로 피부를 자른다. 침샘과 스테르노하이드 근육을 집게로 떼어 내어 기관지를 노출시합니다. 그런 다음 나일론 문자열을 아래에 놓습니다.캐뉼라를 삽입하기에 충분한 후두 아래 약 2 밀리리터의 기관장에 절개를 하고 기관지와 캐뉼라 주위에 끈을 매듭짓십시오. 주사기를 캐뉼라 끝에 부착하고 신선한 PBS-EDTA로 로드합니다. 그런 다음 용액의 1 밀리리터를 주입하고 폐에 흡입합니다.주사기를 캐뉼라에서 분리하고 용액을 15 밀리리터 튜브로 배출합니다. 이 과정을 반복하여 신선한 PBS-EDTA로 얼음을 만들고 라베를 풀수 있습니다. 4섭씨에서 7분간 500g의 원심분리기.그런 다음 볼륨을 기록하고 펠릿을 방해하지 않고 두 개의 1.5 밀리리터 튜브로 상수튜브를 전송합니다. 펠릿을 다시 중단한 후 150마이크로리터를 96웰 플레이트로 옮기고, 접시를 500배, 섭씨 4도에서 7분간 원심분리합니다. 그런 다음 티슈 페이퍼의 접시를 재빨리 반전하여 상체를 제거합니다.2.4G2 차단 항체의 존재에 FACS 버퍼에 항체를 가진 세포를 얼룩시키고, 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 플레이트를 배양한다. 염색 후, 원심분리판을 500배 g로 4°C에서 7분간 펠릿하게 한다. 티슈 페이퍼의 플레이트를 반전시켜 염색 용액을 제거합니다.FACS 버퍼 100마이크로리터를 추가하여 세포를 세척한 다음 원심 분리를 반복합니다. 150마이크로리터의 FACS 버퍼에서 샘플을 다시 중단한 다음 추가 350마이크로리터의 완충제가 포함된 FACS 튜브로 전송합니다. 각 샘플에 구슬 을 계산하는 25 마이크로 리터를 추가하고 유동 세포 분석으로 진행합니다.집 먼지 진드기, 곤충 및 비 곤충 작은 동물에 긴 이중 좌초 RNA 구조의 존재는 이중 좌초, RNA 특정 마우스 단일 클론 항체를 사용하여 점 블롯에 의해 검사되었다. RNase III는 J2에 의해 검출할 수 없는 12 15개의 염기 쌍 단편으로 이중 좌초 RNA를 소화하기 위하여 이용되었습니다. 마우스 폐에서 선천적인 면역 반응을 자극하는 집 먼지 진드기 총 RNA의 능력은 RT-qPCR에 의해 입증되었다. RNase III 치료는 집 먼지 진드기 총 RNA의 면역 자극 활성을 폐지, 이중 좌초 RNA 구조는 폐에서 타고난 면역 활동에 필수적임을 나타내는.중증형 2형 폐염증의 개발에 대한 집먼지 진드기 총 RNA의 억제 효과는 FACS 분석을 통해 평가하였다. 호산성 폐 염증은 RNase III의 유무에 관계없이 치료된 먼지 진드기 추출물에 의해 유도되었다. 긴 이중 좌초 RNA 종의 분해는 기관지 정맥포 라베이지 및 폐에서 증가 호산구 수에 의해 반영 된 심한 유형 2 폐 염증을 초래했다.특히, 먼지 진드기 총 RNA 처리 군에서 호산구의 수는 내인적으로 긴 이중 좌초 RNA 종을 포함하는 원래의 먼지 진드기 추출물로 처리된 그룹과 비교된다. 이 프로토콜을 시도할 때, 이 단계에서 폐에 어떤 손상이 최종 결과를 바꿀 수 있기 때문에 BAL 액체를 주입하고 회수할 때 매우 주의하십시오. 이 절차 이외에, ELISA와 같은 다른 방법은 BAL 유체에 존재하는 비세포 수용성 함량을 분석하기 위해 수행될 수 있다.개발 후, 이 기술은 알레르기 성 폐 염증의 발달을 조절할 수 있는 비 이중 좌초 RNA 요인과 같은 환경 알레르겐에 존재하는 그밖 미생물 물질을 탐구하는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

의 식별을위한 1.5 시간 절차 Enterococcus</em직접 혈액 배양에서> 종

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

연구

면역학 및 감염병학

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

에서 계란을 사용하여<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; 등<em&gt; 생체내에서</em기생충 유도된 폐 염증의&gt; 모델

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한<em&gt; Burkholderia의</em&gt; 종

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

뉴 클레오 캡시드 소둔 매개 전기 영동 (NAME) 분석은 HIV-1 뉴 클레오 캡시드 억제제의 신속한 식별을 할 수 있습니다

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

의 종 특이 검출을위한 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석 실험<em&gt; 에이 메리아</em&gt; 닭을 감염이

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

절연, 특성화 및 잇몸 면역 세포 네트워크의 기능 시험

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...